劉斐雯　俞坤強　彭洪衛(wèi)　柳維林　林如輝　陶　靜，2　陳立典，2，3△?。?福建中醫(yī)藥大學，福建福州35022；2.福建省康復技術重點實驗室，福建福州35022；3.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復研究中心，福建福州35022）

?

電針百會、神庭穴對局灶性腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及海馬區(qū)GAP-43蛋白表達的影響*

劉斐雯1俞坤強1彭洪衛(wèi)1柳維林1林如輝1陶靜1，2陳立典1，2，3△
（1.福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122；2.福建省康復技術重點實驗室，福建福州350122；3.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復研究中心，福建福州350122）

【摘要】目的觀察電針百會穴、神庭穴對腦缺血再灌注（MCAO）大鼠學習記憶能力的影響，并探討其可能的機制。方法45只雄性Sprague-Dawley大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組和電針組，各15只。模型組和電針組采用線栓法制備缺血2 h MCAO大鼠模型，電針組電針百會穴、神庭穴（1/20 Hz，每日30 min，7 d）。采用Longa評分檢測各組大鼠的神經(jīng)行為學評分，采用Morris水迷宮測試檢測學習記憶能力，采用TTC染色和小動物磁共振檢測腦梗死體積，采用Western blotting法檢測缺血側海馬區(qū)GAP-43蛋白的表達水平。結果模型組大鼠Longa評分在第5日、第7日明顯高于電針組（P＜0.05）。定向航行試驗結果表明，隨著時間推移，各組大鼠平均潛伏期均逐漸縮短，而電針組大鼠的行為學表現(xiàn)明顯優(yōu)于模型組（P＜0.001）；空間探索實驗顯示，電針組大鼠穿越原平臺次數(shù)明顯多于模型組（P＜0.05）。小動物磁共振結果示假手術組結構清晰，腦室走向正常。模型組右側結構正常，左側大腦部分梗死、腫脹。電針組右側結構正常，左側梗死、腫脹區(qū)域小于模型組，提示電針百會、神庭穴可以減小腦梗死體積。TTC染色結果，與模型組比較，電針組大鼠腦梗死體積占全腦體積的比例小于模型組，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。各組Western blotting結果示，與假手術組比較，模型組大鼠GAP-43蛋白表達增加，而電針組大鼠的GAP-43蛋白表達較模型組多（P＜0.05）。結論電針百會、神庭穴可以改善MCAO大鼠學習記憶能力，其機制可能與減輕腦組織損傷并上調(diào)海馬區(qū)GAP-43蛋白表達，增強神經(jīng)元突觸可塑性有關。

【關鍵詞】腦缺血再灌注電針學習記憶小動物磁共振GAP-43

認知障礙在腦卒中患者中發(fā)病率高達56.6%［1］，其中45.4%腦卒中后認知障礙患者主要表現(xiàn)為學習記憶能力下降［2］，嚴重影響腦卒中患者的整體功能恢復和身心健康［3］。針刺百會、神庭穴可以改善腦卒中患者的學習記憶能力［4-5］，然其機制仍未完全闡明［6］。腦組織缺血缺氧損傷后學習記憶等功能的恢復，必須依賴突觸的結構和功能的重塑［7］。海馬區(qū)GAP-43參與了神經(jīng)的生長、發(fā)育、再生以及維持突觸功能和釋放遞質過程，是神經(jīng)再塑與再生標志物［8］。本實驗制備大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血再灌注（MCAO）大鼠模型，觀察電針神庭、百會穴對MCAO大鼠學習記憶能力、腦梗死體積以及海馬區(qū)GAP-43蛋白表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物與分組45只清潔級、健康雄性、體質量為（260±20）g的Sprague-Dawley大鼠，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［合格證號SYXK（閩）2005-004］，每籠5只，進行分籠適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將大鼠進行編號，分為假手術組、模型組、電針組，各15只，實驗過程嚴格按照國際動物保護和使用指南的規(guī)定進行。

1.2實驗試劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑，美國Sigma-aldrich公司提供；PSD-95一抗、β-actin一抗、辣根過氧化物酶二抗，美國Cell Signaling Technology公司提供。

1.3實驗儀器Morris水迷宮，中國醫(yī)學科學院藥物研究所生產(chǎn)；Image-lab圖像分析系統(tǒng)，美國Bio-rad laboratories公司生產(chǎn)。

1.4造模參照改良Longa方法［9］，制備左側大腦中動脈閉塞的MCAO大鼠模型。術前所有實驗大鼠禁食12 h。大鼠稱重后，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。常規(guī)去毛消毒，分離頸總動脈，向上分離出頸內(nèi)動脈和頸外動脈主干及分支。結扎頸總動脈近心端及分叉處頸外動脈，微動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈。然后在頸總動脈結扎處遠端約3 mm處剪一小口，將備好的栓線插入頸內(nèi)動脈，撤去頸內(nèi)動脈血管夾，緩慢推動栓線至大腦前動脈近端，直至遇到少許阻力時停止，插入長度18.0~22.0 mm。固定栓線，常規(guī)縫合傷口。2 h后將栓線退回至頸總動脈分叉處，形成缺血再灌注模型。假手術組大鼠只進行動脈分離的操作，不進行結扎和插線。整個實驗過程中注意大鼠保暖。大鼠蘇醒后按Longa評分判斷模型是否成功，評分1~3分的大鼠可以納入實驗。

1.5干預方法電針組參考《實驗針灸學》取大鼠神庭和百會穴，使用華佗牌30號0.5寸毫針，接G6805電針儀，電壓峰值6 V，以針體輕輕抖動為度，疏密波，頻率為1/20 Hz。每次治療時間為30 min，每日同一時間治療1次，共7 d。造模后第2日開始治療，直至大鼠被處死。假手術組置于普通籠中飼養(yǎng)，予同等條件抓取。模型組造模后回籠飼養(yǎng)，予同等條件抓取。

1.6觀察指標1）神經(jīng)行為學評分：采用Longa進行神經(jīng)行為學評分。0分：無神經(jīng)功能缺損體征。1分：不能完全伸展對側前爪。2分：向偏癱側轉圈。3分：行走時向偏癱側傾倒。4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。Longa神經(jīng)行為學評分從造模開始，每天同一時間進行1次評定并記錄。2）行為學檢測：Morris水迷宮測試進行行為學檢測，測試包括定位航行實驗、空間探索實驗兩個部分。Morris水迷宮是一個直徑為200 cm、高度為50 cm的圓形水池，水深30 cm，水溫（25±2）℃，池壁4個等距離點將水池分為4個象限，任選一個象限在其中央放置平臺，逃逸平臺直徑為6 cm，低于水面1~2 cm，四周的池壁表面光滑整潔，光線四周對稱，水池周圍參照物從實驗開始到結束位置保持不變。于術后3 d開始進行Morris水迷宮測試直至處死。（1）定位航行實驗：實驗開始前，將大鼠放置于水池中自由游泳2 min，使其充分適應環(huán)境以及人的抓握等相關操作，將大鼠按順時針方向依次由第1象限、第2象限、第3象限、第4象限入水點順序面向池壁放入水中。若大鼠在90 s內(nèi)找到平臺，并在平臺上停留的時間達到3 s以上，認為大鼠找到平臺，此時由計算機記錄到的時間為逃避潛伏期；若大鼠在限定的時間內(nèi)未找到隱匿于水中的平臺，則將大鼠拖曳至平臺上，讓其在平臺上停留10 s，此時逃避潛伏期計為90 s。定位航行實驗于術后3 d開始，連續(xù)檢測4 d。（2）空間探索實驗：術后第7日，撤去平臺后，任意選取一入水點將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄90 s內(nèi)大鼠穿過放置原平臺區(qū)域的次數(shù)。3）磁共振掃描：術后第7日，在Morris水迷宮實驗結束后，使用德國bruker（布魯克）7.0 T小動物磁共振儀進行掃描。大鼠在用異氟烷完全麻醉后，采用仰臥位，并使其頭部固定于有機玻璃板架上，選用大鼠頭部線圈，開始檢測前先行矢狀位定位掃描，再進行T 2WI掃描，參數(shù)：采用TSE序列，TR 2738 ms，TE 33 ms，24層，矩陣30 mm×30 mm，RFOV60%，NSA為15，掃描時間為5 min 50 s。4）TTC染色：采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法檢測各組大鼠腦梗死體積。在大鼠斷頭取腦后，將取得的腦組織迅速置于-20℃冰箱冷凍15 min，至腦組織變硬，將腦組織從大腦半球額極到枕極做連續(xù)的冠狀位切片（每片厚度約2 mm，共切6片），將腦片放入1%TTC磷酸緩沖液（pH=7.4）后，置于37℃恒溫箱10～15 min，并用毛筆不時翻動腦片，以使腦片均勻接觸到染色液，整個過程注意避光。TTC因與正常組織中的脫氫酶反應而呈現(xiàn)紅色，而由于缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，故不能與TTC反應，使腦梗死組織呈蒼白色。利用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對腦梗死面積以及大腦面積進行計算，然后得出腦梗死體積百分比=（梗死面積和×2 mm）/（全腦面積和×2 mm）。5）Western blotting：取缺血側（左側）海馬組織置液氮罐中速凍后于-80℃冰箱保存。取海馬組織100 mg，加裂解緩沖液1 mL和苯甲基磺酰氟（PMSF）10 μL，充分研磨后離心，取上清。BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。樣品蛋白變性后，取樣品蛋白50 μg，12%SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜，封閉液封閉2 h，分別用MMP-2、MMP-9（1∶500）、β-actin一抗（1∶1000）孵育，4℃過夜，用辣根過氧化物標記的二抗（1∶5000）室溫孵育1h。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，Imagelab圖像分析系統(tǒng)分析。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，若符合正態(tài)分布，則進行兩獨立樣本t檢驗；若不符合正態(tài)分布，則進行秩和檢驗；多組計量資料符合正態(tài)分布，則進行單因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齊者用LSD法，若方差不齊則用Games-Howell法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較見表1。模型組大鼠Longa評分在第5日、第7日明顯高于電針組（P＜0.05）。

2.2各組大鼠行為學結果比較見表2，表3。定向航行試驗結果表明，隨著時間推移，各組大鼠平均潛伏期均逐漸縮短，而電針組大鼠的行為學表現(xiàn)明顯優(yōu)于模型組（P＜0.01）；空間探索實驗顯示，電針組大鼠穿越原平臺次數(shù)明顯多于模型組（P＜0.05）。

2.3各組大鼠腦梗死體積比較1）小動物磁共振比較：見圖1。假手術組結構清晰，腦室走向正常。模型組右側結構正常，左側大腦部分梗死、腫脹。電針組右側結構正常，左側梗死、腫脹區(qū)域小于模型組，提示電針百會、神庭穴可以減小腦梗死體積（注：箭頭所指為梗死區(qū)）。2）TTC染色比較：見表4。與模型組比較，電針組大鼠腦梗死體積占全腦體積的比例小于模型組，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

表1　各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較（分，±s）

表1　各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較（分，±s）

與模型組比較，△　P＜0.05。

組別　第5日第7日假手術組　00 第1日　第3日00模型組1.90±0.32 1.80±0.42 n 15 15　 2.4±0.52 2.10±0.57電針組15　 2.4±0.70 1.90±0.32 1.40±0.52△　1.20±0.42△

表2　各組大鼠逃避潛伏期結果比較（s，±s）

表2　各組大鼠逃避潛伏期結果比較（s，±s）

與假手術組比較，*P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.001。

組別　第5日第6日假手術組16.76±2.42 12.41±3.46 第3日　第4日32.40±7.20 24.93±8.05模型組　67.82±4.63*　53.19±9.15*　 n 15 15 85.52±3.28*　75.30±7.45*　電針組15 50.48±6.15△　38.39±5.74△　26.33±8.05△　19.13±3.66△

表3　各組大鼠穿越平臺次數(shù)結果比較（次，±s）

表3　各組大鼠穿越平臺次數(shù)結果比較（次，±s）

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

組別　n　次數(shù)假手術組154.25±1.28模型組151.38±0.92*　電針組15　2.63±1.59△

圖1　各組大鼠小動物核磁T2結構

表4　兩組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

表4　兩組大鼠腦梗死體積比較（%，±s）

組別　n　梗死體積百分比模型組15　33.11±1.52電針組1517.76±2.08△

與模型組比較，△P＜0.001。

2.4各組大鼠Western blotting結果比較見圖2，表5。與假手術組比較，模型組大鼠GAP-43蛋白表達增加，而電針組大鼠的GAP-43蛋白表達較模型組多（P＜0.05）。

3　討　論

圖2　各組大鼠海馬GAP-43蛋白表達結果

表5　各組大鼠海馬GAP-43蛋白表達結果比較（%，±s）

表5　各組大鼠海馬GAP-43蛋白表達結果比較（%，±s）

與模型組比較，△P＜0.05。

組別　n　GAP-43/β-Actin假手術組15　55.31±11.19模型組15　77.26±12.61電針組15　98.67±21.48△

缺血性腦卒中發(fā)生后，由于腦組織缺血缺氧進而發(fā)生一系列復雜的病理改變，導致大腦神經(jīng)元破壞和死亡［10］，最終而出現(xiàn)學習記憶減退等功能障礙。針刺可以改善腦缺血后的氧化應激、炎癥反應、能量代謝障礙所致的病理損傷［11］，有助于促進學習記憶能力等高級腦功能恢復。督脈為陽脈之海，其行貫脊、入絡腦，與腦聯(lián)系十分密切。百會、神庭穴皆是督脈經(jīng)穴，具有醒腦開竅、寧神益智等作用，可主治腦卒中后認知障礙等腦部疾患，這一結論在研究團隊前期臨床研究中已經(jīng)得到證實［12-14］。

細胞水平上突觸的強度的變化，被認為是學習記憶的形態(tài)學基礎［15-16］，而腦缺血缺氧后大腦學習記憶等神經(jīng)功能的恢復，取決于大腦的突觸可塑性，依賴突觸的結構和功能的重塑［17］。GAP-43是一種胞膜磷酸蛋白質，同時也是一種神經(jīng)特異性蛋白質，廣泛存在于各種神經(jīng)組織中，尤其在軸突末端以及突觸前膜的含量極高，在突觸發(fā)育和神經(jīng)細胞再生過程中扮演重要的角色［18］。生理情況下，在成熟的神經(jīng)元中，由于軸突的生長處于一種抑制狀態(tài)，所以神經(jīng)元中的GAP-43的含量很低。當軸突受到損傷后，軸突的生長和重建可被重新誘導，而GAP-43在其中有著重要的作用［19］。GAP-43可以使F-肌動蛋白聚集，將生長錐附著、固定，從而使細胞變形，與此同時還可以促進單胺遞質釋放與維持長時程增強效應，從而在引導軸突生長以及調(diào)節(jié)軸突形成新的聯(lián)系上起關鍵作用［20-21］。因此，GAP-43蛋白參與了腦卒中后突觸結構和功能重塑的過程，從而影響了大腦高級功能恢復的過程［22］。

本實驗中，筆者觀察到電針組大鼠的神經(jīng)行為學評分低于模型組，且電針組大鼠的腦梗死體積小于模型組，說明電針百會、神庭穴可以改善MCAO大鼠病理損傷，促進神經(jīng)功能的恢復。研究中行為學的結果還顯示，電針組大鼠的行為學表現(xiàn)優(yōu)于模型組，表明電針可以改善MCAO大鼠的學習記憶功能，且同模型組相比，電針組大鼠左側海馬區(qū)GAP-43的含量明顯升高。綜上所述，電針百會、神庭穴可以提高MCAO大鼠的學習記憶能力，且這種治療作用可能與上調(diào)GAP-43蛋白表達，增強突觸可塑性相關。

參考文獻

［1］曲艷吉，卓琳，詹思延.中國腦卒中后認知障礙流行病學特征的系統(tǒng)評價［J］.中華老年心腦血管病雜志，2013，14（12）：1294-1301.

［2］胡昔權，竇祖林，萬桂芳，等.腦卒中患者認知功能障礙的發(fā)生率及其影響因素的探討［J］.中華物理醫(yī)學與康復雜志，2003，25（4）：219-222.

［3］Park JH，Kim BJ，Bae H，et al. Impact of post-stroke cognitive impairment with no dementia on health -related quality of life［J］. Journal of Stroke，2013，15（1）：49-56.

［4］馮曉東，劉嬌，陳立典.電針對局灶性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響及其機制①［J］.中國康復理論與實踐，2013，19（3）：227-230.

［5］林浴坤，陶靜，陳斌，等.電針對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學習記憶功能的影響［J］.中國康復理論與實踐，2014，20（9）：831-834.

［6］Leung MC，Yip KK，Ho YS，et al. Mechanisms underlying the effect of acupuncture on cognitive improvement：a systematic review of animal studies［J］. J Neuroimmune Pharmacol，2014，9（4）：492-507.

［7］Zhao S，Zhao M，Xiao T，et al. Constraint-induced movement therapy overcomes the intrinsic axonal growth-inhibitory signals in stroke rats［J］. Stroke，2013，44（6）：1698-1705.

［8］孟明，張春梅，趙旭偉，等.阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀對腦卒中大鼠腦組織神經(jīng)生長相關蛋白43與血管內(nèi)皮生長因子表達的影響及治療老年急性缺血性腦卒中的療效［J］.中國老年學雜志，2015，35（10）：2641-2644.

［9］Tao J，Chen B，Gao Y，et al. Electroacupuncture enhances hippocampal NSCs proliferation in cerebral ischemia-reperfusion injured rats via activation of notch signaling pathway［J］. International Journal of Neuroscience，2014，124（3）：204-212.

［10］Jin R，Song Z，Yu S，et al. Phosphatidylinositol -3 -kinase gamma plays a central role in blood-brain barrier dysfunction in acute experimental stroke［J］. Stroke，2011，42（7）：2033-2044.

［11］Leung MCP，Yip KK，Ho YS，et al. Mechanisms underlying the effect of acupuncture on cognitive improvement：a systematic review of animal studies［J］. Journal of NeuroImmune Pharmacology，2014，9（4）：492-507.

［12］劉嬌，馮曉東.電針百會、神庭穴配合康復訓練治療腦卒中后認知障礙臨床研究［J］.中醫(yī)學報，2013，28（4）：608-610.

［13］江一靜.電針百會、神庭對腦卒中后認知功能障礙的影響［D］.福州：福建中醫(yī)藥大學，2011.

［14］Liu F，Li ZM，Jiang YJ，et al. A meta-analysis of acupuncture use in the treatment of cognitive impairment after stroke［J］. J Altern Complement Med，2014，20（7）：535-544.

［15］Kasai H，F(xiàn)ukuda M，Watanabe S，et al. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition［J］. Trends in Neurosciences，2010，33（3）：121-129.

［16］Gazzaniga.認知神經(jīng)科學：關于心智的生物學［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2011：310-312.

［17］樊留博，章霞，盧戰(zhàn)，等.電針聯(lián)合強制性運動對腦缺血大鼠神經(jīng)功能及GAP-43表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2015，34（1）：162-165.

［18］Donnelly CJ，Park M，Spillane M，et al. Axonally synthesized beta-actin and GAP-43 proteins support distinct modes of axonalgrowth［J］.Journalof Neuroscience，2013，33（13）：5878.

［19］Liu Z，Chopp M，Ding X，et al. Axonal Remodeling of the corticospinal tract in the spinal cord contributes to voluntary motor recovery after stroke in adult mice［J］. Stroke，2013，44（7）：1951-1956.

［20］張鵬飛，徐成成，李文磊，等.電針對局灶性腦缺血大鼠10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白和神經(jīng)生長相關蛋白-43表達的影響［J］.中國康復理論與實踐，2015，21（1）：35-38.

［21］Becker T，Lieberoth BC，Becker CG，et al. Differences in the regenerative response of neuronal cell populations and indications for plasticity in intraspinal neurons after spinal cord transection in adult zebrafish［J］. Molecular and Cellular Neuroscience，2005，30（2）：265-278.

［22］Cheng MY，Wang EH，Woodson WJ，et al. Optogenetic neuronal stimulation promotes functional recovery after stroke［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2014，111（35）：12913-12918.

Effect of Electro-acupuncture on Learning and Memory Ability and GAP-43 Expression in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

LIU Feiwen，YU Kunqiang，PENG Hongwei，et al.
College of Reha-bilitation Medicine of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)ujian，F(xiàn)uzhou 350122，China.

【Abstract】Objective：To observe the effect of electro-acupuncture（EA）at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）on learning and memory ability of rats after cerebral ischemia-reperfusion injury and explore the potential mechanism through GAP-43 expression. Methods：45 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham group（n=8），the model group（n=8）and EA group（n=8，EA at Baihui and Shenting，1/20 Hz，30 min/ day，7 days）. The sham group and the model group were modeled with MCAO for 2 h and reperfusion. The animals′learning and memory ability was tested by Morris water maze；the cerebral infarction volume was measured by TTC staining and magnetic resonance；the damage and edema of neuron were detected with hematoxylin-eosin staining；the protein expression of GAP-43 was detected by Western blotting，and neurological deficit score was evaluated with Longa. Results：Longa of the modeled group was higher than the EA group on the 5thand 7thday（P＜0.05）. The place navigation showed that the escape latency of all group was shorter，and the EA group was shorter than the modeled group. The spatial probe showed that the EA group was more than the modeled group in the times of arriving platform（P＜0.05）. The animal magnetic resonance showed that there was no damage in ventriclein sham group. There were some infarction organizations in the left hemisphere in the modeled group. TTC staining shows that the damaged area of the EA group was smaller than the modeled group（P＜0.001）. Western blotting showed that the expression of GAP-43 in model group increased compared with sham group，while the expression of GAP-43 in EA group increased more than model group（P＜0.05）.. Conclusion：EA can improve learning and memory ability of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury，which may be related with reducing the damage and edema of neuron，and inhibiting the expression of GAP-43 in hippocampus.

【Key words】Cerebral Ischemia-reperfusion；Electro-acupuncture；Learning and memory；Small animals magnetic resonance；GAP-43

中圖分類號：R245.9+7

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）02-0189-05

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.001

*基金項目：國家自然科學基金項目（No.81373778）；福建省康復技術協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目（No.X2012004-協(xié)同）

通信作者△（電子郵箱：cld＠fit.com.edu.cn）

收稿日期（2015-09-30）