漆曉玲??趙蕾??陳珊珊??孟姝??吳亞菲.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都?6004；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周病科，重慶?4047；.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院牙周病科（四川大學(xué)），成都?6004

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·口腔微生物毒力因子專欄·

牙齦卟啉單胞菌脂多糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子RANTES和分形素的影響

漆曉玲1,2趙蕾3陳珊珊1孟姝3吳亞菲3
1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都?610041；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周病科，重慶?401147；3.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?華西口腔醫(yī)院牙周病科（四川大學(xué)），成都?610041

[摘要]目的 觀察牙齦卟啉單胞菌脂多糖（Pg-LPS）對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）表達(dá)調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子（RANTES）和分形素的影響。方法 應(yīng)用不同質(zhì)量濃度（200、500、1?000?ng·mL-1）的Pg-LPS分別處理HUVEC?1、6、12、24?h，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測RANTES及分形素mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。結(jié)果 在Pg-LPS與HUVEC共同培養(yǎng)?1、6和12?h時(shí)，除培養(yǎng)時(shí)間為12?h、Pg-LPS質(zhì)量濃度為200?ng·mL-1組的RANTES?mRNA和1?h、200?ng·mL-1組RANTES蛋白表達(dá)與對照組無明顯差異外，其余各實(shí)驗(yàn)組RANTES蛋白和mRNA表達(dá)量及分形素mRNA表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；6?h時(shí)，二者mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值，分別為對照組的4.88倍和6.20倍；刺激6?h后，RANTES蛋白和mRNA表達(dá)量及分形素的mRNA表達(dá)量均降低，24?h時(shí)，僅Pg-LPS質(zhì)量濃度為500?ng·mL-1組與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；分形素蛋白的表達(dá)量則僅在Pg-LPS濃度為1?000?ng·mL-1刺激6、12?h時(shí)與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論 Pg-LPS感染具有上調(diào)HUVEC表達(dá)趨化因子RANTES和分形素的作用，可能在牙周炎促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的過程中起一定作用。

[關(guān)鍵詞]動脈粥樣硬化；?牙周炎；?趨化因子；?牙齦卟啉單胞菌；?脂多糖

牙周炎與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）及心血管疾?。╟ardiovascular?disease，CVD）密切相關(guān)，是CVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。血循環(huán)中的單核細(xì)胞趨化進(jìn)入血管壁的過程是AS形成和發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，與單核細(xì)胞趨化功能相關(guān)的CC類及CX3C類趨化因子在這一過程中起重要作用。調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子（regulated?upon?activation?normal?T-cell?expressed?and?secreted，RANTES）是一種CC類趨化因子。目前CX3C類趨化因子亞家族只發(fā)現(xiàn)了不規(guī)則趨化因子，又稱分形素（fractalkine）這一個(gè)成員。研究證明，RANTES和分形素均參與了AS的炎癥反應(yīng)過程，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)及AS形成的作用[1-4]。

牙齦卟啉單胞菌是牙周炎主要致病菌，脂多糖（lipopolysacchearide，LPS）是其重要的毒力因子之一。本課題組前期研究[5]表明：牙齦卟啉單胞菌可侵入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human?umbilical?vein?endothelial?cells，HUVEC），并對其細(xì)胞功能產(chǎn)生一定影響；進(jìn)一步研究[6]顯示：牙齦卟啉單胞菌及其毒力因子LPS可促進(jìn)單核細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)上調(diào)。另有研究[7]也表明，牙齦卟啉單胞菌能黏附并侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞，其毒力因子LPS還可以通過上調(diào)黏附分子、趨化因子及趨化因子受體等從而促進(jìn)白細(xì)胞的活化，參與AS病損的形成。但牙齦卟啉單胞菌的LPS能否通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子RANTES和分形素的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮趨化遷移的作用，目前國內(nèi)外研究還較少。本研究通過觀察不同質(zhì)量濃度牙齦卟啉單胞菌LPS對HUVEC表達(dá)趨化因子RANTES和分形素的影響，探索其在CVD中的可能致病機(jī)制，為牙周炎與CVD的相關(guān)關(guān)系提供依據(jù)。

1??材料和方法

1.1??實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

HUVEC細(xì)胞株EA-hy926，由上海斯信生物科技有限公司提供。

1.2??試劑和儀器

牙齦卟啉單胞菌的LPS（Invivogen公司，美國）；胎牛血清，DMEM-高糖培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；TrizolTMReagent（Invitrogen公司，美國）；人RANTES及分形素酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司提供）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）。恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），超凈工作臺（Biological?Safety?Cabinets，Thermo公司，美國），水平搖床（SYC-2101型，Crystal公司，美國），酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國），高速冷凍離心機(jī)（Hermle公司，德國），高通量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）儀（BIO-RAD公司，美國），ABI7300型熒光定量PCR儀（Applied?Biosystems公司，美國）。1.3??細(xì)胞培養(yǎng)

用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基復(fù)蘇細(xì)胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37?℃和5%CO2環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)，每2?d傳代1次（去除培養(yǎng)基中血清，PBS清洗3次，加入胰酶消化），鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4??細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將對數(shù)生長期的HUVEC接種于96孔板，密度為每毫升5×104個(gè)，每孔0.2?mL。培養(yǎng)24?h后，每孔加入不同質(zhì)量濃度的LPS，使孔內(nèi)LPS終質(zhì)量濃度分別為0（對照組）、10、50、100、200、500、1?000、2?000、5?000?ng·mL-1，每個(gè)不同的質(zhì)量濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，空白組僅加入DMEM培養(yǎng)基0.2?mL，余孔加入等體積的PBS液。培養(yǎng)24?h后，吸出待測孔的培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基0.2?mL，每孔中加入MTT 液20 μL，置于培養(yǎng)箱中3.5~4?h后終止培養(yǎng)，吸棄上清液，每孔中加入DMSO液200 μL，置于培養(yǎng)箱中30?min后水平搖床低速震蕩10?min，待結(jié)晶充分溶解后，利用ELISA檢測儀測定出490?nm波長的相應(yīng)吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）。

1.5??LPS感染HUVEC模型

選取不同質(zhì)量濃度的LPS與HUVEC共培養(yǎng)，使其終質(zhì)量濃度為0、200、500、1?000?ng·mL-1。分別于培養(yǎng)后1、6、12、24?h收集細(xì)胞上清液，Trizol法裂解細(xì)胞以提取細(xì)胞總RNA。

1.6??RANTES及分形素mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real?time?quantitative-PCR，RT-PCR）檢測RANTES及分形素mRNA的表達(dá)。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行RTPCR反應(yīng)，采用β-actin作為內(nèi)參基因。各基因的引物序列如下。β-actin，F(xiàn)：5’-CCACGAAACTACCTTCAA-CTCC-3’，R：5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3’；RANTES，F(xiàn)：5’-CATCCTCATTGCTACTGCCCTCT-3’，R：5’-GCCACTGGTGTAGAAATACTCCTTG-3’；分形素，F(xiàn)：5’-TTCTGCCATCTGACTGTCCTGC-3’，R：5’-TGCCTGGTTCTGTTGATAGTGGAT-3’。

1.7??RANTES及分形素蛋白的表達(dá)

采用ELISA法測定細(xì)胞上清液中RANTES及分形素蛋白的表達(dá)，根據(jù)試劑盒所示步驟進(jìn)行操作。RANTES最低檢測質(zhì)量濃度為70?pg·mL-1，分形素最低檢測質(zhì)量濃度為20?pg·mL-1。

1.8??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析法，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2??結(jié)果

2.1??細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用不同質(zhì)量濃度LPS刺激HUVEC細(xì)胞24?h后的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。10、50、100、200、500、1?000?ng·mL-1LPS組細(xì)胞存活率均在95%以上，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。2?000、5?000?ng·mL-1LPS刺激后，細(xì)胞存活率較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)中LPS刺激的質(zhì)量濃度為0、200、500、1?000?ng·mL-1。

圖 1??不同質(zhì)量濃度LPS作用下HUVEC存活率?Fig?1??The?survival?rate?of?HUVEC?under?different?concentrations ?of?LPS

2.2??RANTES及分形素的mRNA表達(dá)

2.2.1??RANTES?mRNA的表達(dá) ?不同質(zhì)量濃度LPS刺激HUVEC細(xì)胞后RANTES?mRNA的表達(dá)變化見表1。在刺激的12?h內(nèi)，RANTES?mRNA相對表達(dá)量隨著LPS質(zhì)量濃度增高呈增加趨勢，除12?h時(shí)200?ng·mL-1組外，其余實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6?h時(shí)1?000?ng·mL-1組RANTES?mRNA相對表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照組的4.88倍。6?h后，各實(shí)驗(yàn)組RANTES?mRNA的表達(dá)量較之前呈下降趨勢，24?h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組RANTES?mRNA表達(dá)量均略微高于對照組，僅500?ng·mL-1組與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同一時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組間比較顯示：1、6、12?h時(shí)，1?000?ng·mL-1組RANTES?mRNA相對表達(dá)量均高于200?ng·mL-1及500?ng·mL-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表 1 LPS刺激HUVEC后RANTES mRNA的相對表達(dá)量Tab 1 RANTES mRNA expression levels of HUVEC stimulated by LPS±s

表 1 LPS刺激HUVEC后RANTES mRNA的相對表達(dá)量Tab 1 RANTES mRNA expression levels of HUVEC stimulated by LPS±s

注：a：與相同時(shí)間點(diǎn)對照組相比，P＜0.05；b：與相同時(shí)間點(diǎn)2?00?ng·mL-1組相比，P＜0.05；c：與相同時(shí)間點(diǎn)500?ng·mL-1組相比，P＜0.05；d：與相同質(zhì)量濃度1?h組相比，P＜0.05；e：與相同質(zhì)量濃度6?h組相比，P＜0.05；f：與相同質(zhì)量濃度12?h組相比，P＜0.05。

時(shí)間/h LPS質(zhì)量濃度/（ng·mL-1） F值 P值0 200 500 1?000 1 1.71±0.24a2.22±0.78ae3.57±0.39abce23.32 ＜0.000?1 6 1 2.29±0.79ac3.81±0.80abdf4.88±0.38abcdf33.51 ＜0.000?1 1 12 1 1.64±0.34 2.22±0.28ae3.21±0.71abce20.14 ＜0.000?1 24 1 1.53±0.27 1.81±0.48ae1.39±0.52def3.13 0.066

2.2.2??分形素mRNA的表達(dá) ?LPS刺激HUVEC細(xì)胞后分形素mRNA的表達(dá)變化見表2。在刺激的12?h內(nèi)，分形素mRNA相對表達(dá)量隨LPS質(zhì)量濃度增高呈增加趨勢，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。6?h時(shí)1?000?ng·mL-1組分形素mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照組的6.20倍。6?h后，各實(shí)驗(yàn)組分形素mRNA表達(dá)量較之前下降，24?h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組分形素mRNA表達(dá)量均略微高于對照組，僅500?ng·mL-1組與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同一時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組間比較顯示：1、6、12?h時(shí)，隨著LPS質(zhì)量濃度增加，分形素mRNA相對表達(dá)量相應(yīng)增高， 各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表 2 LPS刺激HUVEC后分形素mRNA的相對表達(dá)量Tab 2 Fractalkine mRNA expression levels of HUVEC stimulated by LPS???±s

表 2 LPS刺激HUVEC后分形素mRNA的相對表達(dá)量Tab 2 Fractalkine mRNA expression levels of HUVEC stimulated by LPS???±s

注：a：與相同時(shí)間點(diǎn)對照組相比，P＜0.05；b：與相同時(shí)間點(diǎn)2?00?ng·mL-1組相比，P＜0.05；c：與相同時(shí)間點(diǎn)500?ng·mL-1組相比，P＜0.05；d：與相同質(zhì)量濃度1?h組相比，P＜0.05；e：與相同質(zhì)量濃度6?h組相比，P＜0.05；f：與相同質(zhì)量濃度12?h組相比，P＜0.05。

LPS質(zhì)量濃度/（ng·mL-1）時(shí)間/h F值 P值0 200 500 1?000 1 2.07±0.48ac3.47±0.30abe4.60±0.52abce68.14 ＜0.000?1 6 1 2.78±0.70ac4.86±0.46abd6.20±0.57abcd73.57 ＜0.000?1 1 12 1 2.00±0.62ac3.91±0.89ab5.55±0.27abc52.82 ＜0.000?1 24 1 1.36±0.34ce3.17±0.81abe1.66±0.69cdef11.71 0.000?7

2.3??細(xì)胞上清液中RANTES和分形素蛋白質(zhì)量濃度2.3.1??RANTES蛋白質(zhì)量濃度 ?不同質(zhì)量濃度LPS刺激HUVEC細(xì)胞后RANTES蛋白的表達(dá)變化見表3。在刺激的12?h內(nèi)，細(xì)胞上清液中RANTES質(zhì)量濃度隨LPS刺激濃度增高呈增加趨勢，除1?h時(shí)200?ng·mL-1組外，其余各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。刺激6?h后，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞上清液中RANTES質(zhì)量濃度較之前呈下降趨勢；24?h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組RANTES質(zhì)量濃度均略微高于對照組，僅500?ng·mL-1組與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同一時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組間比較顯示：1、6、12?h時(shí)，隨著LPS質(zhì)量濃度增加，RANTES表達(dá)量相應(yīng)增高，1?000?ng·mL-1組和200、500?ng·mL-1組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表 3??LPS刺激HUVEC后細(xì)胞上清液中RANTES的質(zhì)量濃度變化Tab 3 RANTES protein levels in the supernatant of HUVEC stimulated by LPS pg·mL-1,±s

表 3??LPS刺激HUVEC后細(xì)胞上清液中RANTES的質(zhì)量濃度變化Tab 3 RANTES protein levels in the supernatant of HUVEC stimulated by LPS pg·mL-1,±s

注：a：與相同時(shí)間點(diǎn)對照組相比，P＜0.05；b：與相同時(shí)間點(diǎn)2?00?ng·mL-1組相比，P＜0.05；c：與相同時(shí)間點(diǎn)500?ng·mL-1組相比，P＜0.05；d：與相同質(zhì)量濃度1?h組相比，P＜0.05；e：與相同質(zhì)量濃度6?h組相比，P＜0.05；f：與相同質(zhì)量濃度12?h組相比，P＜0.05。

LPS質(zhì)量濃度/（ng·mL-1）時(shí)間/h F值 P值0 200 500 1?000 1 1?227.50±71.12 1?309.39±51.47cef1?471.59±34.02abe1?629.47±34.40abce50.63 ＜0.000?1 6 1?201.05±44.50 1?566.81±51.21acdf1?698.93±36.56abdf1?826.73±40.31abcdf154.1 ＜0.000?1 12 1?252.21±20.48 1?413.77±51.31ade1?489.81±33.10ae1?633.71±34.00abce76.19 ＜0.000?1 24 1?265.21±31.75 1?339.70±34.43ce1?440.99±46.50abe1?344.83±41.15cdef13.74 0.000?3

2.3.2??分形素蛋白質(zhì)量濃度 ?不同質(zhì)量濃度LPS刺激HUVEC細(xì)胞后分形素蛋白的表達(dá)變化見表4。不同質(zhì)量濃度LPS刺激后細(xì)胞上清液中分形素質(zhì)量濃度與對照組相比較沒有明顯的變化，僅刺激6、12?h時(shí)1?000?ng·mL-1組與其他各組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表 4 LPS刺激HUVEC后細(xì)胞上清液中分形素的質(zhì)量濃度變化Tab 4 Fractalkine protein levels in the supernatant of HUVEC stimulated by LPS pg·mL-1,±s

表 4 LPS刺激HUVEC后細(xì)胞上清液中分形素的質(zhì)量濃度變化Tab 4 Fractalkine protein levels in the supernatant of HUVEC stimulated by LPS pg·mL-1,±s

注：a：與相同時(shí)間點(diǎn)對照組相比，P＜0.05；b：與相同時(shí)間點(diǎn)2?00?ng·mL-1組相比，P＜0.05；c：與相同時(shí)間點(diǎn)500?ng·mL-1組相比，P＜0.05；d：與相同質(zhì)量濃度1?h組相比，P＜0.05；e：與相同質(zhì)量濃度6?h組相比，P＜0.05；f：與相同質(zhì)量濃度12?h組相比，P＜0.05。

LPS質(zhì)量濃度/（ng·mL-1）時(shí)間/h F值 P值0 200 500 1?000 986.60±24.13 1?038.19±38.43 1?055.24±43.41 1?078.43±61.10e3.17 0.063?7 6 993.49±10.99 1?052.15±46.25 1?076.08±52.92 1?178.41±36.46abcd14.91 0.000?2 12 989.86±12.14 1?034.05±36.93 1?062.60±42.05 1?161.37±39.06abc17.10 0.000?1 24 960.80±48.60 1?025.05±29.84 1?047.51±58.37 1?057.78±43.53ef3.543 0.048?1 1

3??討論

牙周炎和心血管疾病聯(lián)系密切。牙周炎癥能導(dǎo)致血液中的重要冠心病相關(guān)生物標(biāo)志物濃度升高，而經(jīng)過牙周治療后其濃度下降[8-9]。研究[10]顯示，牙周炎臨床指標(biāo)與動脈瓣膜狹窄，頸動脈粥樣硬化，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等有關(guān)，牙周治療可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。牙齦卟啉單胞菌是目前公認(rèn)的引起牙周炎的主要致病菌之一，LPS是其最重要的毒力因子之一。研究[11]表明，亞臨床內(nèi)毒素血癥使AS和CVD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加3倍。目前為止，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道牙齦卟啉單胞菌LPS引起亞臨床膿毒血癥的濃度范圍參考值。以往在體外研究中，牙齦卟啉單胞菌LPS的質(zhì)量濃度多選擇為1~5?000?ng·mL-1[12-13]。結(jié)合本研究細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中LPS刺激質(zhì)量濃度選擇為0、200、500、1?000?ng·mL-1。

AS是CVD的基本病變，動脈壁上形成粥樣硬化斑塊是AS的主要特點(diǎn)，斑塊中含有大量炎癥細(xì)胞，其中單核細(xì)胞約占80%左右。單核細(xì)胞通過對血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用而進(jìn)入血管壁變成巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步吞噬脂質(zhì)后變?yōu)榕菽?xì)胞，成為粥樣硬化斑塊的主要組成成分。其中趨化因子在單核細(xì)胞黏附、侵入血管內(nèi)皮以及AS的形成和發(fā)展中起重要作用。趨化因子家族主要分為四大類：C、CC、CXC、CX3C，其中具有單核細(xì)胞趨化功能的是CC類和CX3C類趨化因子。

RANTES是CC類趨化因子亞家族中的一員，其受體為CCR1、CCR3和CCR5，具有典型的趨化效應(yīng)，與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后可引起短暫的鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致受體極化和細(xì)胞遷移，增加細(xì)胞表面細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular?adhesion?molecule-1，ICAM-1）、CD43、CD44及CD45等的表達(dá)，誘導(dǎo)白細(xì)胞向炎癥部位浸潤[14]。趨化因子RANTES可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，參與AS發(fā)生發(fā)展過程。流行病學(xué)調(diào)查[15]顯示，RANTES受體CCR5的基因多態(tài)性與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)。研究人員在AS病變中檢測到RANTES存在[16]。用多肽拮抗劑抑制RANTES受體后可以抑制白細(xì)胞浸潤，AS病變形成及發(fā)展[1]。動物實(shí)驗(yàn)[2]顯示，血清RANTES濃度與粥樣斑塊不穩(wěn)定性呈正相關(guān)。另外Gamonal等[17]研究表明，牙周炎患者局部炎癥位點(diǎn)齦溝液（gingival?crevicular?fluid，GCF）中可檢測到趨化因子RANTES的存在，但在牙周健康者的齦溝液中無法檢測到。Johnson等[18]發(fā)現(xiàn)牙周炎患者牙齦組織中RANTES表達(dá)增加，且與牙周袋的探診深度有一定的關(guān)系。這些研究結(jié)果提示，牙周炎引起的RANTES表達(dá)水平變化可能是牙周炎與CVD相關(guān)的橋梁分子之一。本研究的結(jié)果顯示，200、500、1?000?ng·mL-1的LPS均能影響HUVEC?RANTES蛋白和mRNA表達(dá)，且在12?h內(nèi)，RANTES蛋白和mRNA表達(dá)量隨LPS刺激的質(zhì)量濃度增高呈增加趨勢，在6?h時(shí)的表達(dá)量最高。這提示LPS可能通過上調(diào)RANTES的表達(dá)影響單核細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化功能，進(jìn)而影響AS形成。Bodet等[19]利用不同的牙齦卟啉單胞菌（ATCC33277、ATCC53977、W83）感染人全血，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌可呈濃度依賴性促進(jìn)RANTES表達(dá)，且ATCC53977的刺激作用更強(qiáng)，這與本研究結(jié)果一致。

分形素是趨化因子CX3C亞家族目前的唯一成員，具有膜結(jié)合型和分泌型兩種形式，是一種兼具黏附功能的趨化因子，不僅能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞的定向遷移，還能介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密黏附。研究[20]發(fā)現(xiàn)，分形素及其受體參與AS形成及去穩(wěn)定化的過程。Rius等[3]研究表明，吸煙可以增加人動脈內(nèi)皮細(xì)胞分形素的表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞對其的黏附。Stolla等[4]研究發(fā)現(xiàn)，分形素在人動脈粥樣硬化斑塊的早、晚期都可檢測到，并且可促進(jìn)單核細(xì)胞的趨化作用。Park等[21]研究表明，100?ng·mL-1的LPS刺激鼠腎小球膜細(xì)胞4h后，分形素的mRNA表達(dá)量是空白對照組的2.2倍。Hosokawa等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在正常的人牙齦組織中未檢測到分形素表達(dá)，而炎性牙齦組織中可檢測到其表達(dá)，且主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞；進(jìn)一步用1?000?ng·mL-1的牙齦卟啉單胞菌LPS刺激HUVEC，結(jié)果表明，LPS可上調(diào)分形素的mRNA表達(dá)，8?h時(shí)表達(dá)量最高。本研究結(jié)果表明，200、500、1?000?ng·mL-1的Pg-LPS均能影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分形素的mRNA表達(dá)，且在12?h內(nèi)，分形素的mRNA表達(dá)量隨LPS質(zhì)量濃度增高呈增加趨勢，6?h時(shí)的表達(dá)量最高。這一結(jié)果類似Hosokawa 等[22]的研究結(jié)果。但是本研究中LPS對分形素蛋白水平表達(dá)的影響并不明顯，這可能是由于分形素具有膜結(jié)合型和分泌型兩種形式，而本實(shí)驗(yàn)利用ELISA法測量細(xì)胞上清液中分形素質(zhì)量濃度僅能測得其分泌形式，測量結(jié)果可能欠缺對膜結(jié)合型分形素表達(dá)變化的分析。本課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot進(jìn)一步分析LPS對HUVEC表面膜結(jié)合型分形素表達(dá)的影響。

[參考文獻(xiàn)]

[1]?Braunersreuther?V,?Steffens?S,?Arnaud?C,?et?al.?A?novel?RANTES?antagonist?prevents?progression?of?established?atherosclerotic?lesions?in?mice[J].?Arterioscler?Thromb?Vasc?Biol,?2008,?28(6):1090-1096.

[2]?Lv?YB,?Jing?J,?Li?JM,?et?al.?Assessment?of?RANTES?levels?as?the?indicators?of?plaque?vulnerability?in?rabbit?models?of?atherosclerosis[J].?Pathol?Res?Pract,?2014,?210(12):1031-1037.

[3]?Rius?C,?Company?C,?Piqueras?L,?et?al.?Critical?role?of?fractalkine?(CX3CL1)?in?cigarette?smoke-induced?mononuclear?cell?adhesion?to?the?arterial?endothelium[J].?Thorax,?2013,?68(2):177-186.

[4]?Stolla?M,?Pelisek?J,?von?Brühl?ML,?et?al.?Fractalkine?is?expressed?in?early?and?advanced?atherosclerotic?lesions?and?supports?monocyte?recruitment?via?CX3CR1[J].?PLoS?ONE,?2012,?7(8):e43572.

[5]?鄧輝,?吳亞菲,?丁一,?等.?四種牙周致病菌侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞能力的體外研究[J].?中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,?2010,?45(4): 203-206.?Deng?H,?Wu?YF,?Ding?Y,?et?al.?Invasion?of?four?common?periodontal?pathogens?into?vascular?endothelial?cells?in vitro [J].?Chin?J?Stomatol,?2010,?45(4):203-206.

[6]?黃瑋,?趙蕾,?賈岳,?等.?牙齦卟啉單胞菌脂多糖對單核細(xì)胞THP-1表達(dá)CC類趨化因子受體2的影響[J].?中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,?2013,?48(7):393-397.?Huang?W,?Zhao?L,?Jia?Y,?et?al.?Effect?of?Porphyromonas gingivalis?lipopolysacchearide?on?the?expression?of?CC?chemokine?receptor?2?in?monocytes[J].?Chin?J?Stomatol,?2013,?48(7):393-397.

[7]?Hashizume?T,?Kurita-Ochiai?T,?Yamamoto?M.?Porphyromonas gingivalis?stimulates?monocyte?adhesion?to?human?umbilical?vein?endothelial?cells[J].?FEMS?Immunol?Med?Microbiol,?2011,?62(1):57-65.

[8]?Paraskevas?S,?Huizinga?JD,?Loos?BG.?A?systematic?review?and?meta-analyses?on?C-reactive?protein?in?relation?to?periodontitis[J].?J?Clin?Periodontol,?2008,?35(4):277-290.

[9]?鄧林凱,?李春潔,?李茜,?等.?牙周治療對心血管疾病危險(xiǎn)因素控制效果的系統(tǒng)評價(jià)[J].?華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,?2013,?31(5):463-467.?Deng?LK,?Li?CJ,?Li?Q,?et?al.?Periodontal?treatment?for?cardiovascular?risk?factors:?a?systematic?review[J].?West?China?J?Stomatol,?2013,?31(5):463-467.

[10]?Hayashi?C,?Gudino?CV,?Gibson?FC?3rd,?et?al.?Review:?pathogen-induced?inflammation?at?sites?distant?from?oral?infection:?bacterial?persistence?and?induction?of?cell-specific?innate?immune?inflammatory?pathways[J].?Mol?Oral?Microbiol,?2010,?25(5):305-316.

[11]?Wiedermann?CJ,?Kiechl?S,?Dunzendorfer?S,?et?al.?Association?of?endotoxemia?with?carotid?atherosclerosis?and?cardiovascular?disease:?prospective?results?from?the?Bruneck?Study[J].?J?Am?Coll?Cardiol,?1999,?34(7):1975-1981.

[12]?Honda?T,?Oda?T,?Yoshie?H,?et?al.?Effects?of?Porphyromonas gingivalis?antigens?and?proinflammatory?cytokines?on?human?coronary?artery?endothelial?cells[J].?Oral?Microbiol?Immunol,?2005,?20(2):82-88.

[13]?Tarozzo?G,?Campanella?M,?Ghiani?M,?et?al.?Expression?of?fractalkine?and?its?receptor,?CX3CR1,?in?response?to?ischaemiareperfusion?brain?injury?in?the?rat[J].?Eur?J?Neurosci,?2002,?15(10):1663-1668.

[14]?Marino?AP,?Silva?AA,?Santos?PV,?et?al.?CC-chemokine?receptors:a?potential?therapeutic?target?for?Trypanosoma cruzi-elicited?myocarditis[J].?Mem?Inst?Oswaldo?Cruz,?2005,?100(Suppl?1):93-96.

[15]?Balistreri?CR,?Candore?G,?Caruso?M,?et?al.?Role?of?polymorphisms?of?CC-chemokine?receptor-5?gene?in?acute?myocardial?infarction?and?biological?implications?for?longevity [J].?Haematologica,?2008,?93(4):637-638.

[16]?Veillard?NR,?Steffens?S,?Burger?F,?et?al.?Differential?expression?patterns?of?proinflammatory?and?antiinflammatory?mediators?during?atherogenesis?in?mice[J].?Arterioscler?Thromb?Vasc?Biol,?2004,?24(12):2339-2344.

[17]?Gamonal?J,?Bascones?A,?Jorge?O,?et?al.?Chemokine?RANTES?in?gingival?crevicular?fluid?of?adult?patients?with?periodontitis[J].?J?Clin?Periodontol,?2000,?27(9):675-681.

[18]?Johnson?RB,?Wood?N,?Serio?FG.?Interleukin-11?and?IL-17?and?the?pathogenesis?of?periodontal?disease[J].?J?Periodontol,?2004,?75(1):37-43.

[19]?Bodet?C,?Chandad?F,?Grenier?D.?Porphyromonas gingivalisinduced?inflammatory?mediator?profile?in?an?ex vivo?human?whole?blood?model[J].?Clin?Exp?Immunol,?2006,?143(1): 50-57.

[20]?Dam?s?JK,?Boullier?A,?Waehre?T,?et?al.?Expression?of?fractalkine?(CX3CL1)?and?its?receptor,?CX3CR1,?is?elevated?in?coronary?artery?disease?and?is?reduced?during?statin?therapy [J].?Arterioscler?Thromb?Vasc?Biol,?2005,?25(12):2567-2572.

[21]?Park?J,?Song?KH,?Ha?H.?Lipopolysaccharide?increases?monocyte?binding?to?mesangial?cells?through?fractalkine?and?its?receptor[J].?Transplant?Proc,?2012,?44(4):1029-1031.

[22]?Hosokawa?Y,?Nakanishi?T,?Yamaguchi?D,?et?al.?Expression?of?fractalkine?(CX3CL1)?and?its?receptor,?CX3CR1,?in?periodontal?diseased?tissue[J].?Clin?Exp?Immunol,?2005,?139(3): 506-512.

（本文編輯 ?吳愛華）

[中圖分類號]R?780.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.018

[收稿日期]2015-09-30；?[修回日期] ?2015-11-21

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金（30973323，81371150）

[作者簡介]漆曉玲，碩士，E-mail:?815655244@qq.com

[通信作者]吳亞菲，教授，博士，E-mail：yafeiwu@tom.com

Effects of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide on the expression of RANTES and fractalkine in human um-bilical vein endothelial cells

Qi Xiaoling1,2, Zhao Lei3, Chen Shanshan1, Meng Shu3, Wu Yafei3. (1. State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Periodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; 3. State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Periodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: Natural Science Foundation of China (30973323, 81371150). Correspondence: Wu Yafei, E-mail: yafeiwu@ tom.com.

[Abstract]Objective A?study?was?conducted?to?investigate?the?effects?of?Porphyromonas gingivalis?lipopolysaccharide?(Pg-LPS)?on?the?expression?of?regulated?upon?activation?normal?T-cell?expressed?and?secreted?(RANTES)?and?fractalkine?in?human?umbilical?vein?endothelial?cells?(HUVECs).?Methods??HUVECs?were?incubated?with?different?concentrations?of?Pg-LPS?(200,?500,?and?1?000?ng·mLˉ1)?for?1,?6,?12,?and?24?h,?respectively.?Then?real?time?quantitative?polymerase?chain?reaction?(RT-PCR)?and?enzyme-linked?immunosorbent?method?(ELISA)?were?adopted?to?detect?the?protein?levels?and?mRNA?levels?of?RANTES?and?fractalkine.?Results??The?RANTES?protein?levels?and?mRNA?levels,?as?well?as?fractalkine?mRNA?levels,?were?significantly?higher?in?all?experimental?groups?of?1,?6,?and?12?h?than?in?the?control?group?(P<0.05),?except?the?expression?of?RANTES?mRNA?in?200?ng·mLˉ1group?of?12?h?and?RANTES?protein?in?200?ng·mLˉ1group?of?1?h.?The?expression?levels?of? RANTES?mRNA?and?fractalkine?mRNA?were?highest?in?1?000?ng·mLˉ1group?of?6?h?and?were?4.88-?and?6.20-fold?higher,?respectively,?than?those?in?the?control?group.?The?expression?levels?of?RANTES?protein,?mRNA,?and?frac-talkine?mRNA?decreased?6?h?after?stimulation,?and?were?significantly?higher?than?those?in?the?control?group?(P<0.05)?in?the?500?ng·mLˉ1group?of?24?h.?There?was?a?significant?difference?between?the?expression?of?fractalkine?mRNA?in?1?000?ng·mLˉ1group?of?6?and?12?h?than?in?the?control?group?(P<0.05).?Conclusion??Pg-LPS?infection?might?up-regulate?the?expression?of?RANTES?and?fractalkine?in?HUVEC,?and?such?expression?is?important?in?the?development?of?atherosclerosis.

[Key words]atherosclerosis;??periodontitis;??chemokines;??Porphyromonas gingivalis;??lipopolysacchearide