陳正崗??唐永平??童磊??王瑩??周元??王奇民??韓金宏??何宗軒??廖奕翔樊兵??鄒榮海??張健??孫曉峰??嚴國鑫.青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，青島?26607；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科，上海?2000；.濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，濰坊?2602；.無錫市第二人民醫(yī)院口腔科，無錫?2002

?

體外RNA干擾RhoA基因對舌癌細胞侵襲的影響

陳正崗1,2唐永平1童磊1王瑩3周元3王奇民1韓金宏1何宗軒1廖奕翔1樊兵4鄒榮海4張健4孫曉峰4嚴國鑫4
1.青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學中心，青島?266071；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科，上海?200011；3.濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，濰坊?261021；4.無錫市第二人民醫(yī)院口腔科，無錫?214002

[摘要]目的 ?應用RNA干擾技術抑制人舌癌細胞株Tca8113和SCC-4中RhoA基因的表達，探討RhoA基因表達下調對舌癌細胞侵襲的影響。方法 ??登錄Genbank數據庫確定人RhoA基因序列，針對RhoA的基因序列設計短鏈RNA，利用Lipofectamine2000介導法將RhoA-siRNA轉染至舌癌Tca8113和SCC-4細胞。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測轉染后的舌癌細胞中RhoA?mRNA的表達，蛋白質印跡法檢測RhoA、半乳糖凝集素-3（galectin-3）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表達，Transwell小室檢測細胞的侵襲能力。結果 ??舌癌細胞轉染RhoA-siRNA后，RhoA的基因和蛋白表達下降，galectin-3和MMP-9蛋白表達下降，細胞體外侵襲能力降低。結論 ??RhoA-siRNA可以有效地抑制舌癌Tca8113和SCC-4細胞中RhoA的表達，通過降低galectin-3和MMP-9的表達從而降低細胞的侵襲能力。RhoA在舌癌的侵襲和轉移中可能發(fā)揮重要的作用。

[關鍵詞]RhoA基因； 半乳糖凝集素-3； 基質金屬蛋白酶-9； RNA干擾； 舌癌； 侵襲

舌癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一。發(fā)病率要遠高于其他部位的口腔癌[1-4]，并且近年來舌癌發(fā)病率逐漸增加，發(fā)病年齡呈年輕化的趨勢[5-6]。舌癌的主要臨床特點是局部呈浸潤性或外生性生長，極易在病變的早期發(fā)生局部淋巴結轉移[7]。由于惡性腫瘤的侵襲和轉移是多步驟、多階段、多因素和多基因綜合作用的結果，因此侵襲和轉移機制成為目前舌癌的研究熱點。

Rho家族蛋白是小G蛋白Ras超家族成員，是一組具有三磷酸鳥苷（guanosine?triphosphate，GTP）酶活性、相對分子質量為20×103～30×103的鳥苷酸結合蛋白，主要包括RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2和Cdc42。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族成員尤其是RhoA在多種腫瘤組織中如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、腸癌等表達增加，并與腫瘤的惡性程度、發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移及臨床預后有關，而對于RhoA在舌癌中的作用，目前的研究相對較少。本研究應用RNA干擾（RNA?interference，RNAi）技術，以人舌癌細胞株Tca8113和SCC-4作為研究對象，利用體外合成針對RhoA基因的特異小干擾RNA（small?interfering?RNA，siRNA）將其轉染舌癌細胞，觀察siRNA對RhoA基因的抑制作用，探討其對舌癌Tca8113和SCC-4細胞侵襲的影響及可能的作用機制，為舌癌的治療提供新的思路。

1??材料和方法

1.1??材料

人舌癌細胞株Tca8113購自中國科學院上海生化細胞研究所，人舌癌細胞株SCC-4由山東大學口腔醫(yī)學院饋贈。DMEM高糖培養(yǎng)基、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic?acid，EDTA）/胰蛋白酶、Trizol、陽離子脂質體試劑Lipofectamine2000 （Invitrogen公司，美國），胎牛血清、青霉素、鏈霉素（Gibco公司，美國），SYBR?Premix?Ex?Taq （Perfect?Real?Time）試劑盒（Takara公司，日本），RhoA鼠抗人單克隆抗體（Santa?Cruz公司，美國），辣根過氧化物酶（horseradish?peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），放射免疫沉淀法（radio?immunoprecipitation?assay，RIPA）蛋白裂解液（江蘇碧云天生物技術研究所）。siRNA序列合成及基因測序購自上海博尚生物技術有限公司。

1.2??細胞培養(yǎng)

Tca8113和SCC-4細胞用含10%胎牛血清、青霉素100?mg·mL-1和鏈霉素100?mg·mL-1的DMEM培養(yǎng)基在37?℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，向培養(yǎng)瓶（25?cm2）內加入2?mL胰蛋白酶。消化在37?℃環(huán)境下進行，消化2～5?min后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后，立即加入5?mL含有血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用彎頭吸管吸取瓶內培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，吹打過程按順序進行，確保所有底部均被吹到。動作輕柔，盡可能避免出現(xiàn)泡沫。細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。計數，按1︰1比例傳代接種在新的培養(yǎng)瓶中。

1.3??RhoA?siRNA的合成

登錄Genbank數據庫確定人RhoA基因序列，序列號為NM_001664，針對RhoA的基因序列設計2條RhoA-siRNA和1條陰性對照序列（NC-siRNA）（表1）。

表 1 ?針對RhoA基因序列設計的2條RhoA-siRNA和1條陰性對照序列?Tab 1 Sequences of two RhoA-siRNA and one negative control based on RhoA gene

1.4??siRNA轉染沉默RhoA基因

轉染前1?d按照每孔1×105個分別將舌癌Tca8113 和SCC-4細胞接種于不同的24孔板中，每孔培養(yǎng)基500 μL，不含抗生素。貼壁細胞融合率達30%～50%時進行轉染。用50 μL Opti-MEI低血清（或無血清）培養(yǎng)基稀釋20?pmol?siRNA（轉染時siRNA終濃度為33?nmol·L-1），輕輕混勻；使用前輕輕搖勻Lipofec-tamine2000，然后取1 μL Lipofectamine2000在50 μL Opti-MEI培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5?min。將前兩步所稀釋的siRNA和Lipofectamine2000混合（使總體積為100 μL），輕輕混勻，室溫放置20?min。每孔細胞中加入100 μL轉染液，輕輕搖勻。37?℃培養(yǎng)48?h后檢測基因表達。實驗組為轉染RhoA-siRNA組，脂質體轉染RhoA-siRNA，其中實驗1組和實驗2組分別對應序列1的RhoA-siRNA和序列2的RhoA-siRNA；陰性對照組為轉染NC-siRNA組，脂質體轉染NC-siRNA；空白對照組為轉染脂質體Lipo組，僅加入轉染混合液，不轉染任何的siRNA。

1.5??實時定量聚合酶鏈反應（polymerase?chain?reac-?????tion，PCR）檢測各組RhoA?mRNA的表達

按照Trizol試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量，取5 μL總RNA，在M-MLV反轉錄酶作用下合成cDNA，再取5 μL反轉錄產物進行PCR擴增反應，以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde?phosphate?dehydrogenase，GAPDH）為內參照。RhoA基因的引物序列，上游：5’-TTCCATCGACAGCCCTGATAGTTTA-3’，下游：5’-CACGTTGGGACAGAAATGCTTG-3’；GAPDH基因的引物序列，上游：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR反應條件：95?℃?30?s；然后95?℃?5?s，60?℃?34?s，40個循環(huán)。熒光信號實時監(jiān)測和數據分析由Stratagene熒光定量PCR儀自動完成，采用2-??Ct公式計算RhoA?mRNA的相對表達水平，其中Ct值為循環(huán)閾值。

1.6???蛋白質印跡法（Western?blot）檢測目的蛋白的表達

棄培養(yǎng)液后PBS沖洗細胞3次，用RIPA蛋白裂解液裂解，操作于冰上進行，4?℃下10?000?r·min-1（離心半徑為4?cm）離心5?min取上清液，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic?acid，BCA）法測蛋白濃度后，100?℃變性10?min。用12%聚丙烯酰胺凝膠分離，再電轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2?h后，單克隆抗體RhoA（1︰200）、半乳糖凝集素-3 （galectin-3）（1︰500）、基質金屬蛋白酶（matrix?metalloproteinase，MMP）-9（1︰1?000）、β-actin （1︰1?000）4?℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（triethanolamine?buffered?saline，TBS-T）洗滌，辣根過氧化物酶（horseradish?peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠二抗（1︰5?000）室溫孵育2?h，PBS洗滌，加入電化學發(fā)光（electrochemiluminesce nce，ECL）溶液顯色曝光。

1.7??細胞體外侵襲能力的檢測

將質量濃度為0.5?g·L-1的Matrigel人工基質膠20 μL鋪于Transwell侵襲小室聚碳酯微孔膜（孔徑8 μm）的上表面，置37?℃?30?min使其聚成凝膠。Transwell上室中分別加入已消化重懸的各組細胞100 μL（1× 108個·mL-1），下室中分別加入對應的條件培養(yǎng)上清液，每孔600 μL。每個孔重復3次。37?℃、5%CO2孵育48?h后取出，PBS清洗，棉簽去除濾膜上層細胞，將已經侵入并貼附于微孔膜下層的細胞固定并采用瑞氏染色法（Wright’s?stain）對貼附在聚酯膜上的侵襲細胞進行染色，顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數。隨機選擇5個視野，計數每個視野內穿過8 μm微孔的細胞數。以侵襲細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.8??統(tǒng)計學分析

采用SPSS?12.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 ?結果

2.1???實時熒光定量PCR檢測RNAi轉染后各組RhoA基因的表達

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組Tca8113和SCC-4細胞轉染RhoA-siRNA后，RhoA?mRNA表達明顯下降（P＜0.05，圖1）。

圖 1??轉染RhoA-siRNA后RhoA?mRNA的表達Fig?1??Expression?of?RhoA?mRNA?after?RhoA-siRNA?transfection

2.2???Western?blot檢測RNAi轉染后各組RhoA、gale-??????ctin-3和MMP-9的蛋白表達

Western?blot檢測結果表明，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組Tca8113和SCC-4細胞轉染RhoA-siRNA后，RhoA、galectin-3和MMP-9蛋白的表達均明顯下降（P＜0.05，圖2、3）。

2.3??RhoA?siRNA對舌癌細胞體外侵襲能力的影響

與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組Tca8113 和SCC-4細胞轉染RhoA-siRNA后，穿膜細胞的數量明顯減少（P＜0.05，表2，圖4），表明轉染RhoA-siRNA后降低了舌癌Tca8113和SCC-4細胞的體外侵襲能力。

圖 2??轉染RhoA-siRNA后galectin-3和MMP-9蛋白的表達?Fig?2??Expression?of?galectin-3?and?MMP-9?protein?after?RhoA-??siRNA?transfection

圖 3??轉染RhoA-siRNA后RhoA蛋白的表達Fig?3??Expression?of?RhoA?protein?after?RhoA-siRNA?transfection

表 2 ?轉染RhoA-siRNA后各組的穿膜細胞數?Tab 2 Cells number of transmembrane after RhoA-siRNA transfection

圖 4??轉染RhoA-siRNA后細胞侵襲能力的檢測 ?倒置相差顯微鏡 ?×?100Fig?4??Evaluation?of?cell?invasion?after?RhoA-siRNA?transfection??inverted?phase?contrast?microscope??×?100

3??討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤最為顯著的生物學特征。舌癌浸潤和轉移的程度是影響其臨床預后的主要因素，也是臨床上患者死亡的主要原因，但舌癌發(fā)生浸潤轉移的具體分子機制目前尚未完全闡明。Rho蛋白的激活可引起一系列的效應器反應，如細胞黏附和細胞運動的變化、肌動蛋白細胞骨架結構改變、基因轉錄的調控變化、細胞周期的調控變化等[8]，而細胞骨架在細胞之間以及細胞與細胞外基質之間的黏附中發(fā)揮著重要的作用，細胞骨架、細胞間黏附以及細胞與基質黏附的改變是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉移的先決和重要條件。

本實驗以舌癌細胞系Tca8113和SCC-4為研究對象，將RhoA?siRNA轉染至舌癌細胞中，采用RNA干擾技術特異性沉默RhoA基因，使RhoA的基因和蛋白水平表達下調。結果顯示利用siRNA可以有效地抑制RhoA基因在舌癌細胞Tca8113和SCC-4中的表達，并且可以抑制細胞的侵襲，而惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉移包括基質降解、細胞遷移和血管生成等一系列步驟，因此推測RhoA基因與舌癌的侵襲和轉移有關。本實驗還證實，RhoA基因的表達下降，可以使galectin-3和MMP-9的表達下調。

gaglectin-3是一種β-半乳糖苷結合蛋白，是半乳糖凝集素（galectins）家族中的重要成員之一。galectin-3具有多種生物學功能，如促進細胞的增殖、促進腫瘤的侵襲和轉移、調節(jié)細胞的黏附，參與免疫調節(jié)、參與炎癥反應及血管生成等[9-10]。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族中的一員，屬于Ⅳ型膠原酶，可以降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等成分。MMP-9可通過降解細胞外基質和基底膜來影響組織的重塑，從而促進腫瘤的浸潤、轉移和血管的生成，在腫瘤的浸潤和轉移過程中發(fā)揮著極為重要的作用[11]。細胞外基質和基底膜的降解以及新生血管的形成則是腫瘤發(fā)生侵襲和轉移必需且又極其重要的步驟。已有研究證實[12]，galectin-3與MMP-9之間可以相互發(fā)生作用，在腫瘤細胞的遷移過程中發(fā)揮重要功能。galectin-3作為MMP-9的底物，可被MMP-9選擇性地進行蛋白分解，產生一個分子量為22?kU的糖識別域和一個分子量為9?kU的氨基酸殘基組成的galectin-3末端片段。裂解之后的galectin-3更容易發(fā)揮作用，從而促進細胞的侵襲。galectin-3表達較低時，腫瘤細胞與細胞外基質有正常的黏附作用；而表達較高時，腫瘤細胞與細胞外基質的黏附作用減弱，腫瘤細胞極易穿過基底膜發(fā)生局部浸潤和侵襲。MMP-9除了可以降解細胞外基質之外，還能促進腫瘤新生血管的生長[13-14]。血管生成是腫瘤生長、轉移過程中的關鍵因素。其存在的機制可能是通過啟動血管基底膜的蛋白降解，為內皮細胞的轉移打開通路從而形成新的血管；另外可能與活化血管內皮生長因子有關。此外，MMP-9還可能通過裂解基質有利于淋巴管內皮細胞遷移從而促進淋巴管新生，而新生的毛細淋巴管僅由單層淋巴內皮細胞組成，管壁薄、基底膜不完整，因而腫瘤細胞更易于進入淋巴管道，進而產生淋巴結轉移[15]。

目前已經證實RhoA與胰腺癌[16]、結直腸癌[17-18]、肝癌[19]等惡性腫瘤的侵襲、遷移能力等密切相關；在舌癌的研究中，通過激活RhoA的上游調控基因蛋白激酶A（protein?kinase?A，PKA）可以活化RhoA，進而發(fā)現(xiàn)舌癌細胞的黏附及遷移能力增強[20]，因此證實了RhoA可以正性調控舌癌細胞的侵襲和遷移，但該研究并未對RhoA調控下游效應基因的分子機制進行探討[20-21]。RhoA對舌癌細胞運動的調節(jié)可能與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）有關[22]，而β-catenin是Wnt信號通路下游的重要效應蛋白。本研究不僅證實了RhoA與舌癌細胞的侵襲和轉移呈正相關，而且證實了RhoA可能通過調控galectin-3與MMP-9來發(fā)揮作用。至于galectin-3、MMP-9與β-catenin之間的相互調節(jié)機制，尚有待進一步證實。

綜上，RhoA-siRNA可以有效地干擾或降低RhoA基因的表達，從而抑制舌癌Tca8113和SCC-4細胞的侵襲，這有可能成為一種新的舌癌基因治療方法。本實驗研究結果提示，RhoA可能通過galectin-3與 MMP-9來調控舌癌細胞的遷移與侵襲，推測RhoA-siRNA在一定程度上可以阻止舌癌細胞的黏附、侵襲和遷移運動，干擾細胞的浸潤和轉移，其作用機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]?德維塔.?癌—腫瘤學原理和基礎[M].?徐從高,?譯.?5版.?濟南:?山東科學技術出版社,?2001:688-798. DeVita?VT.?Cancer?principled?and?practice?of?oncology[M].?Xu?CG,?translated.?5th?ed.?Jinan:?Shandong?Science?and?Technology?Publishing?House,?2001:688-798.

[2]?王兆元,?李俊林.?口腔內癌腫396例臨床病理分析[J].?口腔醫(yī)學,?1999,?19(1):26-27. Wang?ZY,?Li?JL.?Clinical?and?pathological?analysis?of?396?cases?of?oral?cancer[J].?Stomatology,?1999,?19(1):26-27.

[3]?于世鳳.?口腔組織病理學[M].?4版.?北京:?人民衛(wèi)生出版社,?2000:198-215. Yu?SF.?Oral?histology?and?pathology[M].?4th?ed.?Beijing:?People’s?Medical?Publishing?House,?2000:198-215.

[4]?吳軍正,?陳建元,?李峰,?等.?舌癌腦轉移細胞系的Tb建立及形態(tài)和生長特性[J].?實用口腔醫(yī)學雜志,?1999,?15(6): 452-453. Wu?JZ,?Chen?JY,?Li?F,?et?al.?Establishment?of?a?metastatic?cell?line?from?brain?metastasis?induced?by?injection?of?tongue?cancer?Tca8113?cells?in?nude?mouse[J].?J?Pract?Stomatol,?1999,?15(6):452-453.

[5]?Myers?JN,?Elkins?T,?Roberts?D,?et?al.?Squamous?cell?carcinoma?of?the?tongue?in?young?adults:?increasing?incidence?and?factors?that?predict?treatment?outcomes[J].?Otolaryngol?Head?Neck?Surg,?2000,?122(1):44-51.

[6]?Mathew?Iype?E,?Pandey?M,?Mathew?A,?et?al.?Squamous?cell?carcinoma?of?the?tongue?among?young?Indian?adults[J].?Neoplasia,?2001,?3(4):273-277.

[7] Wyganowska-?wi?tkowska M, Jankun J. Plasminogen activation?system?in?oral?cancer:?relevance?in?prognosis?and?therapy[J].?Int?J?Oncol,?2015,?47(1):16-24.

[8]?Rath?N,?Olson?MF.?Rho-associated?kinases?in?tumorigenesis:?re-considering?ROCK?inhibition?for?cancer?therapy[J].?EMBO?Rep,?2012,?13(10):900-908.

[9]?Funasaka?T,?Raz?A,?Nangia-Makker?P.?Galectin-3?in?angiogenesis?and?metastasis[J].?Glycobiology,?2014,?24(10):886-891.

[10]?Xin?M,?Dong?XW,?Guo?XL.?Role?of?the?interaction?between?galectin-3?and?cell?adhesion?molecules?in?cancer?metastasis [J].?Biomed?Pharmacother,?2015,?69:179-185.

[11]?Vandooren?J,?Van?den?Steen?PE,?Opdenakker?G.?Biochemistry?and?molecular?biology?of?gelatinase?B?or?matrix?metalloproteinase-9?(MMP-9):?the?next?decade[J].?Crit?Rev?Biochem?Mol?Biol,?2013,?48(3):222-272.

[12]?Mauris?J,?Woodward?AM,?Cao?Z,?et?al.?Molecular?basis?for?MMP9?induction?and?disruption?of?epithelial?cell-cell?contacts?by?galectin-3[J].?J?Cell?Sci,?2014,?127(Pt?14):3141-3148.

[13]?Jayasooriya?RG,?Park?SR,?Choi?YH,?et?al.?Camptothecin?suppresses?expression?of?matrix?metalloproteinase-9?and?vascular?endothelial?growth?factor?in?DU145?cells?through?PI3K/Akt-mediated inhibition of NF-κB activity and Nrf2-dependent?induction?of?HO-1?expression[J].?Environ?Toxicol?Pharmacol,?2015,?39(3):1189-1198.

[14]?Tang?YL,?Liu?X,?Gao?SY,?et?al.?WIP1?stimulates?migration?and?invasion?of?salivary?adenoid?cystic?carcinoma?by?inducing?MMP-9?and?VEGF-C[J].?Oncotarget,?2015,?6(11): 9031-9044.

[15]?黃榕權,?謝燕清,?張雅潔.?MMP-2、MMP-9和VEGF-D在乳腺癌中的表達及其與腫瘤淋巴管新生的關系[J].?廣東醫(yī)學,?2014,?35(13):2072-2074. Huang?RQ,?Xie?YQ,?Zhang?YJ.?Expression?of?MMP-2,?MMP-9?and?VEGF-D?in?human?breast?cancer?and?their?correlation?with?lymphangiogenesis[J].?Guangdong?Med?J,?2014,?35 (13):2072-2074.

[16]?李金海,?戴華衛(wèi),?張海峰.?RhoA基因在胰腺癌組織中的表達及其與腫瘤臨床病理特征的關系[J].?溫州醫(yī)科大學學報,?2014,?44(2):130-133. Li?JH,?Dai?HW,?Zhang?HF.?RhoA?gene?expression?and?clinicopathology?parameters?in?pancreatic?carcinoma[J].?J?Wenzhou?Med?Univ,?2014,?44(2):130-133.

[17]?劉相萍,?王海波,?劉延軍,?等.?RhoA、RhoC基因在結直腸癌組織中的表達及其意義[J].?中華實驗外科雜志,?2008,?25(7):888-890. Liu?XP,?Wang?HB,?Liu?YJ,?et?al.?Expression?and?significance?of?RhoA?and?RhoC?in?colorectal?carcinoma[J].?Chin?J?Exp?Surg,?2008,?25(7):888-890.

[18]?楊開焰,?陳道瑾,?李小榮,?等.?靶向RhoA基因的shRNA對結直腸癌細胞黏附和遷移的影響[J].?中國老年學雜志,?2011,?31(15):2890-2892. Yang?KY,?Chen?DJ,?Li?XR,?et?al.?Effect?of?shRNA?targeted?against?RhoA?on?the?human?colonic?cancer?cells?adhesion?and?migration[J].?Chin?J?Gerontol,?2011,?31(15):2890-2892.

[19]?董偉,?竇科峰,?楊薛康,?等.?RhoA基因沉默對肝癌HepG2細胞增殖和遷移能力的影響[J].?中華消化外科雜志,?2010,?9(3):216-219. Dong?W,?Dou?KF,?Yang?XK,?et?al.?Effect?of?RhoA?gene?silencing?on?proliferation?and?migration?of?HepG2?cells[J].?Chin?J?Dig?Surg,?2010,?9(3):216-219.

[20]?周峻,?何勇,?金巖,?等.?舌癌細胞遷移過程中RhoA和蛋白激酶A的作用[J].?中國口腔頜面外科雜志,?2007,?5(2):118-121. Zhou?J,?He?Y,?Jin?Y,?et?al.?Effects?of?PKA?and?RhoA?on?migration?of?squamous?cell?carcinoma?of?the?tongue[J].?Chin?J?Oral?Maxillofac?Surg,?2007,?5(2):118-121.

[21]?周峻,?何勇,?董紹忠,?等.?RhoA小干擾RNA對舌癌細胞Tca8113增殖、侵襲影響的體外實驗[J].?中華口腔醫(yī)學雜志,?2010,?45(9):520-524. Zhou?J,?He?Y,?Dong?SZ,?et?al.?Effects?of?RhoA?siRNA?on?the?proliferation,?adhesion,?migration?and?invasion?of?tongue?squamous?cell?carcinoma?Tca8113?cells?in vitro[J].?Chin?J?Stomatol,?2010,?45(9):520-524.

[22]?Saito?S,?Yamamoto?H,?Mukaisho?K,?et?al.?Mechanisms?underlying?cancer?progression?caused?by?ezrin?overexpression?in?tongue?squamous?cell?carcinoma[J].?PLoS?ONE,?2013,?8(1):e54881.

（本文編輯 ?李彩）

[中圖分類號]Q?78

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.016

[收稿日期]2015-09-16；?[修回日期] ?2015-12-18

[基金項目]國家自然科學基金（81372908）；南京醫(yī)科大學科技發(fā)展基金重點項目（2012NJMU248）；青島市衛(wèi)計委計劃項目（2014-WJZD009，2013-WSZD011）

[作者簡介]陳正崗，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：chenzhg1973@163. com

[通信作者]嚴國鑫，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail：yanguo_xin2015@ 163.com

Effects of RhoA gene silencing by RNA interference on invasion of tongue carcinoma

Chen Zhenggang1,2, Tang Yongping1, Tong Lei1, Wang Ying3, Zhou Yuan3, Wang Qimin1, Han Jinhong1, He Zongxuan1, Liao Yixiang1, Fan Bing4, Zou Ronghai4, Zhang Jian4, Sun Xiaofeng4, Yan Guoxin4. (1. Center of Stomatology, Qingdao Municipal Hospital Affiliated to Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China; 3. College of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261021, China; 4. Dept. of Stomatology, Wuxi No 2. People’s Hospital, Wuxi 214002, China)

Supported by: Natural Science Foundation of China (81372908); Science and Technology Developing Major Project of Nanjing Medical University (2012NJMU248); Science and Technology Planning Project of Qingdao Municipal Health and Family Planning Commission (2014-WJZD009, 2013-WSZD011). Correspondence: Yan Guoxin, E-mail: yanguo_xin2015@ 163.com.

[Abstract]Objective ?To?study?the?effects?of?RhoA?down-regulation?by?RNA?interference?on?the?invasion?of?tongue?carcinoma?Tca8113?and?SCC-4. Methods ?Determination?of?the?human?RhoA?sequence?as?well?as?the?design?and?construction?of?a?short?specific?small?interfering?RNAs?(siRNA)?were?performed.?The?siRNA?of?RhoA?gene?was?transfected?into?human?tongue?squamous?cell?carcinoma?Tca8113?and?SCC-4?cells?line?by?Lipofectamine?2000.?Quantitative?real-time?polymerase? chain?reaction?was?used?to?examine?the?mRNA?expression?levels?of?RhoA.?Protein?expressions?of?mRNA,?galectin-3,?and?matrix?metalloproteinase?(MMP)-9?were?evaluated?by?Western?blot.?Transwell?invasion?assay?was?performed?to?assess?the?invasion?ability?of?tongue?carcinoma.?Results ?RhoA?expressions?in?Tca8113?and?SCC-4?cells?were?reduced?significantly?after?transfection?of?RhoA-siRNA.?Protein?levels?of?galectin-3?and?MMP-9?were?also?down-regulated?significantly.?Invasion?ability?was?inhibited?as?well.?Conclusion ?RhoA-siRNA?can?effectively?inhibit?RhoA?expression?in?Tca8113?and?SCC-4?cells.?The?invasion?ability?of?tongue?carcinoma?cells?decreased?with?down-regulation?of?the?protein?expressions?of?galectin-3?and?MMP-9,?indicating?that?RhoA-siRNA?can?inhibit?invasion?of?tongue?carcinoma.?Results?show?that?RhoA?may?play?an?important?role?in?the?processes?of?invasion?and?metastasis?of?tongue?carcinoma.

[Key words]RhoA?gene;??galectin-3;??matrix?metalloproteinase-9;??RNA?interference;??tongue?carcinoma;??invasion