譚瀟 董憲喆 郭代紅 王石 李牧函 趙潤(rùn)清 劉屏

[摘要]研究雞血藤乙醇提取物及其活性成分兒茶素的抗輻射作用，并探討初步作用機(jī)制。采用6Gy 60Coγ射線一次性全身照射ICR小鼠造成亞急性輻射損傷模型， 隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（氨磷汀，436 mg·kg-1，iv）、雞血藤組（生藥10，20，40 g·kg-1）、兒茶素組（50，100，200 mg·kg-1），連續(xù)ig給藥28 d，每日1次。檢測(cè)給藥前1 d及給藥1，3，7，14，21，28 d后小鼠外周血WBC，RBC，PLT計(jì)數(shù)和HGB含量；觀察給藥7 d后小鼠胸腺及脾臟指數(shù)的變化；比色法測(cè)定給藥7 d血清SOD，GSHPx活性和MDA水平；采用半固體培養(yǎng)基測(cè)定給藥7 d后骨髓造血祖細(xì)胞集落形成能力；HE染色觀察給藥7，14 d股骨骨髓病理學(xué)改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)給藥7 d后骨髓細(xì)胞的凋亡，Western blot測(cè)定骨髓細(xì)胞中cleaved caspase3和Bcl2的表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)股骨骨髓中Bax的表達(dá)。結(jié)果表明，雞血藤醇提物和兒茶素均可促進(jìn)輻射小鼠外周血象的恢復(fù)，增加免疫器官胸腺和造血器官脾臟的臟器指數(shù)，提高血清抗氧化酶SOD和GSHPx活性、降低MDA水平，促進(jìn)骨髓造血祖細(xì)胞的增殖分化；增加骨髓腔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量、減輕立體支架結(jié)構(gòu)損傷，改善造血微環(huán)境；抑制骨髓細(xì)胞凋亡，使凋亡相關(guān)蛋白Bcl2的表達(dá)顯著上調(diào)，cleaved caspase3和Bax的表達(dá)顯著下調(diào)。雞血藤醇提物和兒茶素對(duì)亞急性輻射損傷小鼠有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與促造血、抗氧化、抗凋亡作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]雞血藤；兒茶素；輻射損傷；外周血象；造血祖細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

[Abstract]To study the antiradiation effect and mechanism of ethanol extracts from Spatholobus suberectus and its active component catechin， ICR mice were exposed to 6Gy irradiation and randomly divided into normal group， model group， positive control group （amifostine， 436 mg·kg-1， iv 30 min before irradiation）， SSD group （10， 20， 40 g·kg-1） and catechin group （50， 100， 200 mg·kg-1） The mice were administered the appropriate drugs once a day after irradiation for 28 consecutive days Blood samples were collected from the tail end and the number of peripheral blood cells was counted before irradiation and on day 1， 3， 7， 14， 21 and 28 using a microcell counter Changes of thymus and spleen index of mice on day 7 were observed The serum SOD， GSHPx activity and MDA level were detected by the colorimetric method The colony forming ability of bone marrow hematopoietic progenitor cells on day 7 was detected by semi solid culture method The HE staining was adopted to observe the pathological changes The apoptosis of bone marrow cells was detected by flow cytometry The expression of cleaved caspase3 and Bax of bone marrow cells were measured separately by westernblotting and immunohistochemistry method SSD and catechin can both significantly revert the irradiatedinduced decline in hematological parameters （RBC， WBC， PLT， Hb）， improve thymus and spleen index， significantly enhance serum SOD and GSHPx activity and decrease the MDA level The proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells in bone marrow were promoted， the apoptosis of bone marrow cells was significantly upregulated and the expression of cleaved caspase3 and Bax was significantly reduced in SSD and catechin group SSD and catechin have significant antiradiation effect and its mechanism may be related to hematopoietic promoting， antioxidant and antiapoptotic effects

[Key words]Spatholobus suberectus； catechin； irradiation injury； peripheral blood； hemopoietic progenitor cell； cell apoptosis

doi：10.4268/cjcmm20160924

輻射可直接導(dǎo)致多種DNA損傷，造成基因突變和染色體畸變；又會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性自由基，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷組織器官[1]。輻射危害累及血液、免疫、消化、生殖等多個(gè)系統(tǒng)，甚至?xí)T發(fā)癌癥[2]。臨床上約70%的惡性腫瘤病人需放射治療，但放療后造成的骨髓抑制、造血功能障礙、外周血細(xì)胞下降、免疫功能受損等已成為制約其療效的瓶頸[3]。從天然中草藥中尋找毒性低、不良反應(yīng)少的抗輻射作用有效成分具有重要意義。

雞血藤為豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖，有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、舒經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床上主治月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃等[4]。課題組以往研究表明[56]，雞血藤乙醇提取物用乙酸乙酯萃取后，經(jīng)色譜柱分離得到9個(gè)化合物，以兒茶素含量最多，其次為沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素等，并且兒茶素刺激造血祖細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，可通過(guò)誘導(dǎo)IL6和 GMCSF mRNA 的表達(dá)，使骨髓細(xì)胞跳出“G1期阻滯”進(jìn)入增殖周期。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)小鼠外周血象、臟器指數(shù)、抗氧化指標(biāo)、造血祖細(xì)胞增殖、骨髓病理學(xué)改變、骨髓細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3，Bcl2，Bax的表達(dá)變化，從促造血、抗氧化、抗凋亡3個(gè)方面探討雞血藤醇提物和兒茶素抗輻射作用及初步分子機(jī)制。

1材料

雞血藤中藥飲片（北京綠野藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地福建）；兒茶素（Sigma公司）；注射用氨磷?。ù筮B美羅大藥廠，04 g/支）；MethoCult M3434培養(yǎng)基（Stemcell公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清（HyClone公司）；紅細(xì)胞裂解液（Solarbio公司）；超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPX），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基生物）；cleaved caspase3，Bcl2抗體（美國(guó)Cell Signaling technology公司）；Bax抗體（SANTA CRUZ）；βactin和相應(yīng)的二抗（美國(guó)Abcam公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

SPF級(jí)ICR小鼠，6～8周，18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）20120001。實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后正式進(jìn)行。

BC2800Vet獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；60Coγ鈷源（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；MCO15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；IX51熒光倒置生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；VICTOR3多標(biāo)記微孔板分析儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；ABJ804NM電子天平（德國(guó)KERN）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD）；電泳儀，半干槽（美國(guó)BioRad）；UVP凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)EC3 Imaging Systems）。

2方法

21雞血藤乙醇提取物制備

雞血藤中藥飲片，8倍量體積75%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓旋蒸至浸膏，凍干，得雞血藤乙醇提取物粉末（SSD）。

22分組與給藥

將健康ICR小鼠216只，雌雄各半，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（氨磷汀，436 mg·kg-1，照射前30 min尾靜脈注射給藥）、雞血藤組（生藥濃度10，20，40 g·kg-1）、兒茶素組（50，100，200 mg·kg-1），每組24只。除正常組外，各組均接受60Gy劑量60Coγ射線一次性全身照射（劑量率11729 cGy·min-1，時(shí)間4 min 50 s）。自照射當(dāng)日起， 每只灌胃給予相應(yīng)藥物02 mL，正常組、輻射組給予等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥28 d。

23外周血象檢測(cè)

于照射前及給藥1，3，7，14，21，28 d后剪尾尖采血20 μL，測(cè)定外周血白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)及血紅蛋白（HB）水平，觀察給藥28 d內(nèi)小鼠外周血象的變化。

根據(jù)外周血象結(jié)果，分別選擇雞血藤組和兒茶素組中促進(jìn)外周血象恢復(fù)作用最佳的劑量組，觀察其對(duì)抗氧化、造血祖細(xì)胞增殖、骨髓病理學(xué)、骨髓細(xì)胞凋亡及抗體表達(dá)等的影響，進(jìn)行作用機(jī)制的研究。

24臟器指數(shù)和抗氧化指標(biāo)測(cè)定

給藥7 d后取每組動(dòng)物的胸腺、脾臟，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=器官質(zhì)量/體重×1 000。同時(shí)摘眼球取血，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定給藥7 d后小鼠血清中SOD，GSHPX活性和MDA水平。

25HE染色檢測(cè)股骨骨髓病理改變

給藥7，14 d后，各取每組動(dòng)物單側(cè)股骨，剝離肌肉組織后于4%多聚甲醛固定24 h，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨骨髓病理形態(tài)學(xué)改變。

26造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)

給藥7 d后各取每組動(dòng)物單側(cè)股骨，吸取RPMI 1640培養(yǎng)基沖出骨髓至培養(yǎng)皿中，正反各沖洗3次，直至沖洗液變清亮后停止。沖出的骨髓細(xì)胞1 000 r·min-1離心5 min，去上清，加入紅細(xì)胞裂解液裂解15 min，1 000 r·min-1離心10 min，去上清，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取5×104個(gè)細(xì)胞于6孔板中，每孔加入15 mL M3434培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于第10天記錄粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位（CFUGM）、爆式紅細(xì)胞集落形成單位（BFUE）和混合細(xì)胞集落形成單位（CFUMix）集落數(shù)，多于50個(gè)細(xì)胞判為一個(gè)集落。

27流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓細(xì)胞凋亡

方法同上制得骨髓單個(gè)核細(xì)胞。每組取5×105細(xì)胞，用PBS洗滌2次（2 000 r·min-1離心5 min），加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加5 μL Annexin VFITC混勻后，再加5 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

28Western blot法檢測(cè)cleaved caspase3的表達(dá)

將27項(xiàng)中每組剩余的骨髓單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑充分裂解，4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min。取上清，BCA試劑盒蛋白定量，細(xì)胞總蛋白加上樣緩沖液煮沸變性。用10% SDSPAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫雜交2 h，洗膜后，加入ECL發(fā)光液，進(jìn)行檢測(cè)。

29免疫組化法檢測(cè)Bax的表達(dá)

將25項(xiàng)中小鼠股骨骨髓蠟塊切片，烘干，逐步脫蠟和水化，而后進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加山羊血清于37 ℃溫箱中封閉20 min。取出切片加一抗Bax，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，再加入二抗37 ℃溫箱孵育30 min，DAB顯色復(fù)染后脫水，封片，晾干。切片隨機(jī)選10個(gè)視野于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞分布程度，用Image Pro軟件進(jìn)行半定量分析，Bax的蛋白表達(dá)以IOD值表示。

210數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果均用±s表示，多組間比較采用單因子方差分析，P<005表示有顯著性差異。

3結(jié)果

31雞血藤醇提物和兒茶素對(duì)輻射小鼠外周血象的影響

與正常組比，輻射組小鼠WBC，RBC，PLT，HGB水平均有所下降，而雞血藤醇提物組和兒茶素小鼠外周血象均有不同程度的改善，其中雞血藤醇提物和兒茶素高劑量組對(duì)小鼠外周血象恢復(fù)的作用最好。兒茶素高劑量組WBC從第7天，雞血藤高劑量組從第21天起明顯高于輻射組（P<001），至第28天仍有顯著性差異。雞血藤高劑量組RBC從第7天，兒茶素高劑量組從第14天開(kāi)始明顯高于模型組（P<001），至第28天接近正常組水平。雞血藤高劑量組PLT從第14天到第21天，兒茶素高劑量組從第7天到第21天明顯高于模型組（P<001）。雞血藤兒茶素高劑量組HGB均從第7天到第21天顯著高于模型組（P<001）（圖1）。

32外周血象恢復(fù)作用最好的雞血藤醇提物組和兒茶素組促造血、抗氧化、抗凋亡作用

321對(duì)臟器指數(shù)的影響給藥7 d后，模型組與正常組比，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低

323對(duì)小鼠股骨骨髓病理學(xué)影響HE染色顯示，給藥7 d后，正常組小鼠骨髓結(jié)構(gòu)完整，骨髓細(xì)胞密集，充滿于骨髓腔內(nèi)，造血細(xì)胞增殖活躍；模型組骨髓細(xì)胞大量減少，僅殘存少量有核細(xì)胞，核染色質(zhì)固縮或碎裂，骨髓網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)的立體支架破碎，呈現(xiàn)空洞狀；與模型組比，雞血藤組和兒茶素組中骨髓細(xì)胞數(shù)有所增多，細(xì)胞核固縮減輕，空洞狀結(jié)構(gòu)減少，立體支架結(jié)構(gòu)損傷程度減輕；給藥14 d后，雞血藤組和兒茶素組骨髓結(jié)構(gòu)改善更加明顯，骨髓細(xì)胞數(shù)顯著增多，可見(jiàn)明顯的造血細(xì)胞再生灶，立體支架結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)（圖2）。

324對(duì)造血祖細(xì)胞集落形成的影響給藥7 d后，模型組小鼠骨髓造血祖細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，CFUGM，BFUE和CFUMix數(shù)量與正常組比顯著降低（P<005）。與模型組比，雞血藤組小鼠骨髓形成CFUGM，BFUE和CFUMix的數(shù)量顯著

4討論

目前抗輻射藥物主要包括含硫化合物、激素類、細(xì)胞因子等[7]。含硫化合物抗輻射作用最強(qiáng)，但毒副作用明顯；細(xì)胞因子在促進(jìn)造血干細(xì)胞（hemato

增殖和分化的同時(shí)也消減了其自我更新能力，加速HSCs的耗竭，加重骨髓遠(yuǎn)期損傷[89]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多天然藥物成分如多糖、生物堿、黃酮類等有一定的抗輻射損傷作用，可作用于不同時(shí)期的造血干/祖細(xì)胞，在蛋白質(zhì)和基因水平參與增殖分化的調(diào)控，促進(jìn)骨髓造血功能重建。由于中藥還具有藥源廣、毒性作用低等特點(diǎn)，中藥抗輻射活性成分的研究已成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。

雞血藤為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，課題組通過(guò)前期研究[1011]，闡明了雞血藤的主要活性部位，從中提取、分離、鑒定了以茶多酚類化合物為代表的主要活性成分，如兒茶素（catechin），表兒茶素（epicatechin），沒(méi)食子兒茶素（gallocatechin），表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）等化合物，單體中活性最強(qiáng)的是兒茶素。兒茶素在植物中分布廣泛，以豆科、茜草科、薔薇科、山茶科居多，可有效清除人體內(nèi)多種自由基，延緩衰老。綠茶中也含有豐富的兒茶素類成分，其抗輻射作用多有研究報(bào)道[12]。造血系統(tǒng)，尤其骨髓是電離輻射主要的靶器官之一，機(jī)體受輻射后最明顯的變化是外周血象的降低。本研究結(jié)果顯示，輻射后小鼠WBC，RBC，PLT，HGB水平均有不同程度下降，其中降低最為顯著的為WBC。與輻射組比，雞血藤組和兒茶素組可以加速外周血象各項(xiàng)指標(biāo)的恢復(fù)。外周血象的變化提示從給藥7 d起，各給藥組與輻射組WBC，RBC，PLT，HGB均開(kāi)始有顯著性差異，給藥7 d左右是血象恢復(fù)的關(guān)鍵點(diǎn)，因此本文選擇給藥7 d的時(shí)間點(diǎn)研究其促造血、抗氧化、抗凋亡的作用。

造血干細(xì)胞是原始的全能造血細(xì)胞，可進(jìn)一步分化為各系造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cells，HPCs），進(jìn)而在特定造血微環(huán)境及造血調(diào)控下增殖分化為各類血細(xì)胞[13]。骨髓造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中集落形成數(shù)量可在一定程度上反映造血祖細(xì)胞的內(nèi)在增殖活力[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與輻射組比，雞血藤組和兒茶素組可顯著提高骨髓造血祖細(xì)胞CFUGM和BFUE的集落形成能力，兒茶素組更易促進(jìn)CFUGM的形成，而雞血藤組更易促進(jìn)BFUE的形成，這與7 d后外周血象的變化相符。骨髓病理學(xué)結(jié)果顯示，給藥7 d后，雞血藤組和兒茶素組骨髓損傷已經(jīng)有所減輕，給藥14 d后，骨髓細(xì)胞數(shù)顯著增多，造血細(xì)胞增殖活躍，骨髓微環(huán)境明顯改善。因此，雞血藤醇提物和兒茶素具有明顯的促進(jìn)輻射小鼠造血功能恢復(fù)的作用。

輻射還會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致機(jī)體的抗氧化體系失去平衡，破壞DNA結(jié)構(gòu)，損傷造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，還可攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸而引起脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙[15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，輻射后機(jī)體中活性氧（reactive oxygen species， ROS）升高，會(huì)使造血系統(tǒng)應(yīng)激能力下降而出現(xiàn)HSCs衰老，影響造血功能。體內(nèi)SOD，GSHPx等能清除自由基，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，三者的水平可間接反映出細(xì)胞氧化損傷的程度[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤醇提物和兒茶素均能不同程度地降低輻射引起的MDA含量升高，提高血清SOD，GSHPx活性，減輕氧化損傷；同時(shí)，使造血器官脾臟和免疫器官胸腺的臟器指數(shù)增加，說(shuō)明對(duì)造血和免疫系統(tǒng)也有一定的保護(hù)作用。

caspase3是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，細(xì)胞凋亡的最后通路均與caspase3的活化有關(guān)[18]。caspase3的激活需要從沒(méi)有活性的全長(zhǎng)35 kDa剪切有活性的17 kDa亞基和13 kDa亞基，即cleaved caspase3[19]。Bcl2和Bax是線粒體凋亡信號(hào)通路中的主要蛋白，線粒體途徑過(guò)程中，Bcl2被抑制而B(niǎo)ax和Bak等凋亡蛋白釋放，移位插入到線粒體外膜的Bax可引起線粒體膜通透性改變，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，激活A(yù)paf1，caspase9和caspase3，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2021]。本研究發(fā)現(xiàn)，輻射可導(dǎo)致骨髓細(xì)胞中cleaved caspase3和Bax的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)骨髓細(xì)胞凋亡。與輻射組比，雞血藤組和兒茶素組在下調(diào)cleaved caspase3和Bax，上調(diào)Bcl2表達(dá)方面有顯著性差異，雞血藤組下調(diào)2種蛋白的表達(dá)更明顯，這與雞血藤組骨髓細(xì)胞凋亡率最低也相一致。

綜上所述，雞血藤醇提物和其活性單體兒茶素可通過(guò)提高造血祖細(xì)胞內(nèi)在增殖活力促進(jìn)造血，改善外周血象；又可通過(guò)提高血清抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生，減輕機(jī)體氧化損傷；還能下調(diào)cleaved caspase3和Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl2的表達(dá)抑制骨髓細(xì)胞的凋亡。本文從促造血、抗氧化、抗凋亡3個(gè)方面探討了雞血藤和兒茶素的抗輻射作用及其初步機(jī)制，但具體通過(guò)哪種通路發(fā)揮了造血調(diào)控還需進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯馬超一]