李 鑫，史金儒，羊夢詩，魯 燚，陳 亮，曹華茹,2*

1. 浙江農(nóng)林大學工程學院，浙江 臨安 311300

2. 浙江省林業(yè)生物質(zhì)化學利用重點實驗室，浙江 臨安 311300

3. 鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450001

胡椒生物堿提取、幾何結構以及紅外光譜的研究

李 鑫1，史金儒3，羊夢詩1，魯 燚1，陳 亮1，曹華茹1,2*

1. 浙江農(nóng)林大學工程學院，浙江 臨安 311300

2. 浙江省林業(yè)生物質(zhì)化學利用重點實驗室，浙江 臨安 311300

3. 鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450001

以海南胡椒果為原料，95%乙醇溶液為溶劑，采用回流法提取胡椒生物堿。通過調(diào)節(jié)pH值除去胡椒酸，乙醚除去脂溶物，用丙酮為溶劑重結晶純化胡椒生物堿，并用高效液相色譜儀檢測其純度，以及對胡椒生物堿進行了紅外光譜表征。同時運用密度泛函B3LYP/6-31G(d, p)方法，對胡椒生物堿的結構進行優(yōu)化、頻率和能量的計算，得到四種構型(構型Ⅰ胡椒堿、構型Ⅱ異胡椒堿、構型Ⅲ異胡椒脂堿和構型Ⅳ胡椒脂堿)的64種構象的穩(wěn)定結構，并利用吉布斯自由能計算常溫(298.15 K)下四種構型分子體系穩(wěn)定構象的熱力學平衡分布。并對實驗紅外光譜與理論紅外光譜的特征峰進行了對比。結果表明，所提取的胡椒生物堿主要以構型Ⅰ中的構象1結構存在，即胡椒堿結構； 經(jīng)純化后得到胡椒堿含量為7%，純度達99%。經(jīng)分析建立的胡椒生物堿提取、分離和純化方法效果良好，建立的胡椒生物堿模型能與實驗結果相吻合。該研究對指導胡椒生物堿的提取、結構模型的建立、表征和應用有重大意義。

胡椒生物堿； 分離純化； 結構模型； 熱力學分布； 紅外光譜

引 言

胡椒作為重要的熱帶香辛料植物，在各種方面都廣泛的應用[1-2]。1951年初就引進到我國海南瓊?？h和興隆都有華僑農(nóng)場種植[3]。胡椒果不僅可以做成許多藥劑[4]，而且胡椒中的胡椒堿由于獨特的性質(zhì)，藥用價值更大，具有抗菌殺蟲[5]、抗氧化[6-9]、治療腹瀉[10-12]、抗抑郁癥[13-14]、增強免疫[15-16]和抗癌[17]等功效。胡椒果中的主要成分為生物堿，揮發(fā)性油脂，蛋白質(zhì)類，樹脂油脂質(zhì)，礦物成分和淀粉等[18-19]。其中，胡椒堿是從胡椒中提取、分離后得到的最具有實用價值的成分。胡椒堿的藥用價值主要歸功于分離得到含哌啶的生物堿成分。在抗腫瘤作用方面，胡椒堿有著獨特的功效[17]。實驗證明，在患有黑色素腫瘤的細胞上，胡椒堿可有效的抑制基質(zhì)金屬蛋白的產(chǎn)生，抑制NF-kappaB，CREB，c-Fos，ATF-2以及導致炎癥的細胞因子的表達[20]。胡椒堿可降低促進腫瘤細胞增殖物質(zhì)和多胺類的合成，其原理是保護蛋白質(zhì)不受損傷，又有效抑制腫瘤細胞的增殖[21]。Sunila等[22]證明胡椒堿可以抑制埃利希氏腹水癌細胞和腹水淋巴瘤的細胞毒作用，抑制腫瘤的產(chǎn)生，還可增加Bal b/c 小鼠的白細胞和血小板數(shù)量。胡椒堿還可增加藥物的生物利用度，但其原理仍不明確，Khajuria等[23]認為可能與改變膜質(zhì)的動力學，或改變腸道中某些酶的構型，而促進藥物的利用價值。

胡椒生物堿的提取包括有溶劑提取法[24-25]，酸水提取法[26]，超聲波提取法[27]，微波提取法[28]，超臨界流體二氧化碳提取法[29]，超聲波離子液體提取法[30]等。提取的胡椒生物堿按結構可分為4種構型異構體[31-32]，胡椒堿是從胡椒中提取的這4類生物堿中活性最強，最具醫(yī)用價值的。林子敬等[33-37]用密度泛函理論對多種氨基酸的構型性質(zhì)，構型平衡分布，紅外光譜性質(zhì)和分子內(nèi)相互作用進行了詳細研究。于文博等[38-41]分析了五種類型的二肽分子構型的性質(zhì)，氨基酸與二肽穩(wěn)定構型的相關性以及對比了理論計算和實驗的紅外光譜圖，通過新找到的構型完善前期實驗結果的解釋。本研究組前期運用密度泛函理論方法對寡肽鏈、低聚殼聚糖和丙烯腈單體[42-46]的幾何結構、紅外光譜、態(tài)密度和電子性質(zhì)等物理化學屬性進行了研究。

本文以95%的乙醇溶液為溶劑，采用溶劑提取法中的回流法提取胡椒生物堿，并用丙酮為溶劑對其進行了重結晶和純化，用高效液相色譜儀檢測胡椒生物堿的純度，以及對胡椒生物堿進行了紅外光譜表征。同時也通過密度泛函理論對實驗提取胡椒生物堿的四種異構體的結構模型進行優(yōu)化、能量和構型平衡分布的計算，并對每種構型中穩(wěn)定構象的紅外光譜分析。結合實驗和理論分析，表明研究結果對胡椒生物堿的提取純化，結構模型建立，紅外特性表征，性能應用以及驗證實驗提取的胡椒生物堿的成分結構分析有著重要的作用。

1 實驗部分

1.1 儀器及材料

海南胡椒果(海南特產(chǎn)黑胡椒粒，紅土種植)； 6.0 mol·L-1鹽酸； 2.8 mol·L-1氫氧化鈉； 95%乙醇(分析純)； 無水乙醇(分析純)； 甲醇(色譜純)； 乙醚(分析純)； 丙酮(分析純)； TG16G臺式高速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)； SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)； LC-2000高壓液相色譜儀(上海天美科學儀器廠)； BS224S電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)； UV-2550紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)； DGG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)； DK-S22恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)； Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀(賽默飛世爾科技分子光譜部)。

1.2 理論方法及模型

應用密度泛函理論B3LYP方法在6-31G(d,p)水平對胡椒生物堿4種構型的各種構象結構分別進行幾何優(yōu)化、頻率、能量和熱力學性質(zhì)的計算。胡椒生物堿四種構型分別為構型Ⅰ胡椒堿(反，反)，構型Ⅱ異胡椒堿(反，順)，構型Ⅲ異胡椒脂堿(順，反)和構型Ⅳ胡椒脂堿(順，順)。其中構型Ⅰ胡椒堿分子的一系列構象結構由分子內(nèi)的4個內(nèi)在單鍵旋轉(zhuǎn)決定，如C—Cα，C—Cβ，C—Cγ和C—N單鍵，如圖1。經(jīng)優(yōu)化后得到四種構型的64種穩(wěn)定構象，通過對穩(wěn)定構象的能量和熱力學平衡分布的比對，選出每種構型中平衡分布最多和能量最低的一種構象。同時分析胡椒生物堿四種構型理論紅外光譜與實驗光譜的特征峰，說明本實驗中提取的胡椒生物堿的構型與構象。密度泛函理論采用的模型為托馬斯-費米-狄拉克模型(1)[47]

(1)

B3LYP方法中交換能以Becke形式表示[48]，相關能以LYP形式表示[49]。本文的計算和結果分析均使用Gaussian09[50]軟件包。

圖1 胡椒堿單鍵旋轉(zhuǎn)自由度示意圖

經(jīng)優(yōu)化得到了胡椒生物堿的四種構型中64種穩(wěn)定構象，其幾何結構如圖2所示。物質(zhì)的結構決定其物理化學性質(zhì)，研究胡椒生物堿的功能首先需要確定其穩(wěn)定的構象。所討論的胡椒生物堿分子體系的穩(wěn)定結構，對尋找胡椒生物堿可能最穩(wěn)定的構型和構象以及分析其紅外光譜、藥理性質(zhì)和構型構象變化等的研究都有著重要意義。

圖2 胡椒生物堿優(yōu)化后的4種構型64種穩(wěn)定構象的結構模型

1.3 方法

1.3.1 胡椒生物堿的提取

以胡椒果為原料，將其研磨成60目粉末，取10 g胡椒粉末加入100 mL 95%乙醇溶液于80 ℃溫度下回流2 h。進行抽濾收集濾液，將濾液進行減壓蒸餾濃縮，對得到的濾渣用40 mL 95%乙醇浸泡和再次回流，回流條件與上述條件相同。將兩份濾液合并進行減壓蒸餾濃縮，濃縮至10～15 mL，用6 mol·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)pH 4，靜置4 h。離心后過濾，除去不溶于酸的胡椒酸，濾液用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 11，靜置2 h，然后在熱水浴中緩慢加入20 mL蒸餾水，溶液變渾濁狀，加適量蒸餾水，待有黃色沉淀析出，將溶液置于冰水中充分冷卻4 h，在1 200轉(zhuǎn)下離心10 min得到的黃色粉狀固體，即粗胡椒生物堿。

1.3.2 胡椒生物堿的純化

在得到的粗胡椒生物堿中加入25 mL丙酮，微熱溶解。若有固體析出則進行熱過濾； 若沒有固體析出則加入與丙酮等量的蒸餾水，待有大量固體析出，進行離心、過濾得到固體，再向濾液中加入與丙酮等量的蒸餾水，待固體析出，再離心、過濾得到固體，重復此步驟2～3次。將得到的固體用乙醚去除脂溶性物質(zhì)，經(jīng)干燥得到較高純度的淡黃色粉末胡椒生物堿，稱量計算其產(chǎn)率。

1.3.3 胡椒生物堿的表征

(1)高壓液相色譜表征

稱0.1 g的胡椒生物堿溶解在20 mL甲醇中，用微濾膜過濾后測液相色譜。色譜柱為Diamonsil C18柱，流動相為甲醇，流速為0.25 mL·min-1，檢測器為紫外檢測器，柱溫25 ℃，進樣量為0.2 μL，檢測波長為341 nm(紫外光譜測得的最大吸收波長)。

(2)紅外光譜表征

壓制溴化鉀的空白片和含有胡椒生物堿的溴化鉀樣品片。先將100～200 mg干燥的KBr在瑪瑙研缽中研磨，壓成空白片； 再取純化后干燥好的胡椒生物堿約1 mg，與100～200 mg干燥的KBr在瑪瑙研缽中研磨，壓成樣品片。將溴化鉀空白片放入光譜儀樣品架上，采集參比背景光譜。再放入含有胡椒生物堿的樣品片進行測定。得到胡椒生物堿的紅外光譜，并在圖譜庫中進行了檢索比對。

2 結果與討論

2.1 胡椒生物堿的含量及純度測定

由計算式(2)可求得胡椒生物堿在胡椒粉中的含量

樣品中胡椒生物堿含量=

(2)

實驗中所用的胡椒粉質(zhì)量為10 g，經(jīng)回流法提取和重結晶處理，得到純度較高的胡椒生物堿為0.7 g。由上式計算可得胡椒粉中的胡椒生物堿含量為7%。對胡椒生物堿的液相色譜圖進行了表征，根據(jù)面積歸一法求得純化后的胡椒生物堿的純度。圖3為胡椒生物堿的液相色譜圖，根據(jù)紫外光譜所得結果，液相色譜檢測的最大吸收波長為341 nm。由上式計算得到胡椒生物堿的純度高達99.96%。

圖3 胡椒生物堿的高效液相色譜圖

上述結果表明本實驗方法能夠提取到較高產(chǎn)率的胡椒生物堿，是一種可用于提取胡椒生物堿的良好方法，且避免了傳統(tǒng)提取方法中常用有機溶劑(如甲醇、氯仿等有毒性)的不足之處，也避免了酸提取法對水環(huán)境的污染。因此，該實驗方法對胡椒生物堿的提取和開發(fā)應用有著重要的參考意義。

2.2 胡椒生物堿的能量和平衡分布

由于分子的構型和構象對偶極矩也非常敏感，因而分別計算了四種構型的64種構象的總能量(經(jīng)零點能校正)、熱力學數(shù)據(jù)和偶極矩，并計算了不同構象的相對能和同種構型的不同構象的熱力學分布計算結果見表1。

表1 在298.15 K溫度下不同構象的相對能、熱力學平衡分布和偶極矩

Table 1 The relative energy, thermodynamic distribution and dipole moment of different conformations from different configurations at 298.15 K

構型構象異構體相對能/(kcal·mol-1)熱力學平衡分布/%偶極矩/(a u )Ⅰ10 00041 6781 52220 02328 4351 52250 58315 1731 35960 57714 4361 401Ⅱ11 68033 9770 70121 69329 7630 79752 15719 9220 89762 20416 0170 774Ⅲ14 16630 9920 82054 13825 1020 89824 10624 7850 80864 09618 4440 871Ⅳ26 35827 4491 37316 39218 4901 37366 39217 1691 283136 44612 8031 28056 44912 4291 280146 45410 9001 265

注： 含量小于1%的未在表中列出。

根據(jù)統(tǒng)計學原理，利用體系準確計算的熱力學數(shù)據(jù)可以計算出298.15 K溫度下的吉布斯自由能數(shù)據(jù)，由此計算出常溫下(298.15 K)胡椒生物堿的4種構型的64種構象的熱力學平衡分布。如表1列出的含量大于1%的穩(wěn)定構象的相對能、偶極矩和同種構型不同構象的平衡分布數(shù)據(jù)。Stepanian[51]等利用實驗的紅外光譜和各穩(wěn)定構型的計算光譜估算出了實驗條件下的纈氨酸分子結構的分布。本文運用另一種與林子敬[34]等同樣的方法計算了常溫下胡椒生物堿不同構型體系下的構象的分布情況。由表1中所有胡椒生物堿構象的相對能ER可知，胡椒生物堿四種構型中構型Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的能量依次增高，其中構型Ⅰ中構象1的能量最低。由同種構型不同構象的熱力學分布可知，在構型Ⅰ中有構象1，2，5，6這四種重要的構象共占整體99.722%的含量，其中構象1的分布最多為41.678%； 在構型Ⅱ中有構象1，2，5，6這四種重要的構象共占整體99.679%的含量，構象1的分布最多為33.977%； 構型Ⅲ中有構象1，5，2，6這四種重要的構象共占整體99.323%，構象1的分布最多為30.992%； 構型Ⅳ中有構象2，1，6，13，5，14這六種重要的構象共占整體99.240%的含量，構象2的分布最多為27.449%。由此可以得出胡椒生物堿能量越低的構型中的某一構象的分布含量越高，構象分布越集中，能量越高的構型中的某一構象的分布含量越低，構象分布越分散； 其中構型Ⅰ中的構象1的幾何結構最穩(wěn)定。

胡椒生物堿的穩(wěn)定性與其幾何結構有著重要的聯(lián)系。由表1可知，胡椒生物堿四種構型中都以構象1的結構較穩(wěn)定，結合圖2所示，胡椒生物堿四種構型中構象1結構的共軛體系原子在同一平面內(nèi)，這類構象比扭曲共軛鍵形成了氫鍵的構象結構更穩(wěn)定。

2.3 胡椒堿紅外光譜表征與對比

上述實驗從胡椒果中提取到了純度高達99.96%的胡椒生物堿，并用壓片法對胡椒生物堿進行了紅外光譜圖的表征，如圖4(a)為實驗提取的胡椒生物堿的紅外光譜圖。此外也利用密度泛函理論建立了穩(wěn)定的胡椒生物堿模型，計算得出四種構型中分布最多的構象分別為構型Ⅰ構象1、構型Ⅱ構象1、構型Ⅲ構象1和構型Ⅳ構象2，圖4(b)為這四種結構胡椒生物堿的理論模擬的紅外光譜圖。

圖4 (a) 實驗中提取的胡椒生物堿的紅外光譜圖； (b) 理論模擬的胡椒生物堿四種構型的紅外光譜圖

Fig.4 (a) IR spectra of pepper alkaloid extracted in this experiment； (b) IR spectra of 4 kinds of pepper alkaloid configurations in the simulation

由圖4(a)可知，實驗所提取的胡椒生物堿在418.2 cm-1存在一個弱吸收峰； 在1 580～1 700 cm-1之間存在三個吸收峰，兩個強吸收峰和一個中強吸收峰。圖4(b)中構型Ⅰ構象1在424.44 cm-1處存在一個弱吸收峰； 在1 656.67和1 725.56 cm-1處存在羰基與六氫吡啶環(huán)振動的強吸收峰以及在1 681.08 cm-1處存在共軛體系的伸縮振動的中強吸收峰。由此說明實驗提取的胡椒生物堿結構主要是以構型Ⅰ構象1的幾何結構存在，即胡椒堿結構。將實驗譜圖4(a)與胡椒堿的標準譜圖相比較，得到匹配度為88.61%。

綜上所述，從胡椒生物堿的構型構象、能量、平衡分布以及紅外光譜圖可知，從實驗中所提取胡椒生物堿的結構主要是以構型Ⅰ構象1的幾何結構存在，即胡椒堿結構。同時也說明了實驗提取的胡椒堿類物質(zhì)為四種構型異構體的混合物。

3 結 論

采用回流法提取胡椒生物堿，并對其進行重結晶純化以及紅外光譜的表征。同時運用密度泛函B3LYP/6-31G(d, p)方法，對胡椒生物堿的結構進行優(yōu)化、頻率和能量的計算，并利用吉布斯自由能計算常溫(298.15 K)下胡椒生物堿體系穩(wěn)定構象的熱力學平衡分布。對實驗紅外光譜與理論紅外光譜的特征峰進行了對比。結果表明： (1)經(jīng)理論模擬得到胡椒生物堿的四種構型(構型Ⅰ胡椒堿、構型Ⅱ異胡椒堿、構型Ⅲ異胡椒脂堿和構型Ⅳ胡椒脂堿)的64種構象的穩(wěn)定模型； (2)構型Ⅰ的構象1的能量最低、幾何結構最穩(wěn)定； (3)實驗所提取的胡椒生物堿為四種構型異構體的混合物，但主要以構型Ⅰ中的構象1結構存在，即胡椒堿結構； (4)采用以95%乙醇為溶劑的回流法提取胡椒堿，經(jīng)丙酮為溶劑重結晶純化后得到胡椒堿含量為7%，純度達99%； (5)本文改進的提取胡椒生物堿的高效方法，能提取到含量較高的強活性和具有良好醫(yī)用價值的胡椒堿。改進的胡椒堿提取、分離和純化方法效果良好，建立的胡椒生物堿模型能與實驗結果相吻合。本研究對指導胡椒生物堿的提取、結構模型的建立、表征和應用有重要意義。

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*Corresponding author

(Received Apr. 24, 2015; accepted Aug. 16, 2015)

Study on the Extraction, Geometry Structure and Spectral Characterization of Piperine Alkaloid

LI Xin1，SHI Jin-ru3，YANG Meng-shi1，LU Yi1，CHEN Liang1，CAO Hua-ru1,2*

1. School of Engineering, Zhejiang A&F University, Lin’an 311300, China

2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Chemical Utilization of Forestry Biomass, Zhejiang A&F University, Lin’an 311300, China

3. College of Life Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

Using pepper fruit of Hainan as raw material and 95% ethanol as solvent, the alkaloid in pepper is extracted with reflux method in this paper. The piperonylic acid is removed by adjusting the pH; the fat-soluble substance being removed by adding ethyl ether; the piperine alkaloid being purified with acetone by recrystallization anddetected with HPLC, as well as characterized with IR. The characterizations of piperine are discussed. Meanwhile, B3LYP/6-31G (d,p) method of DFT is applied to optimize the structure, calculate frequency and energy of pepper alkaloid, then obtain four kinds of configurations (configuration Ⅰ as Piperine, configuration Ⅱ as Iso Piperine, configuration Ⅲ as Iso Chavicine, configuration Ⅳ as Chavicine) with 64 kinds of stability conformational structure. The distribution of the thermodynamic equilibrium of stable conformations of four kinds of configurations of the molecular is calculated with Gibbs free energy at room temperature (298.15 K). And IR spectra of the experimental were compared with the IR spectra of the theoretical. The results show that the alkaloid extracted from pepper is mainly conformer 1 in configuration Ⅰ, that is, Piperine; after purifying, the content of piperine is 7% with the purity of 99%. With analysis, the methods of extraction, separation and purification of piperine in this paper achieve good results. Established models are in good agreement with the experimental results. This research is of great significance in guiding extracting process, building structural model and the characterization and application of piperine.

Piperine alkaloid; Separation and purification; Structural model; Thermodynamic distribution; IR spectrum

2015-04-24，

2015-08-16

國家自然科學基金項目(51103136)和浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃(新苗人才計劃)項目(2014R412010)資助

李 鑫，1991年生，浙江農(nóng)林大學高分子材料與工程專業(yè)本科生 e-mail: xin_li1991@foxmail.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: caohuaru@yeah.net

O641, O656.4

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)07-2082-07