楊 祎　邵晨霞　劉惠知　唐少軍　譚明輝　吳勝蓮

（湖南省微生物研究院，湖南　長沙　410009）

?

茯苓菌種不同保藏法的效果比較

楊 祎邵晨霞劉惠知唐少軍譚明輝吳勝蓮*

（湖南省微生物研究院，湖南長沙410009）

摘 要對茯苓1號和茯苓8號兩個菌種的斜面保藏、木屑管保藏和液體石蠟保藏效果作試驗比較。結(jié)果液體石蠟保藏法保藏茯苓1號可達4年，茯苓8號可達5年；木屑管保藏法保藏茯苓1號可達3年，茯苓8號可達4年；斜面低溫保藏方法保藏的2個茯苓菌種均可達1年以上。指出短期保藏菌種可選用斜面低溫保藏法，長期保藏可選擇液體石蠟保藏法或木屑管保藏法。

關(guān)鍵詞茯苓菌種；斜面保藏；木屑管保藏；液體石蠟保藏；時間

茯苓是最早納入《中國藥典》的藥用食用菌之一，具有健胃、祛濕、健脾、安神、增強免疫力、抗癌等功效。據(jù)統(tǒng)計目前中藥配方中茯苓配伍率達80％。近年來茯苓已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品和食品領(lǐng)域。我國湖北、湖南、安徽、云南和福建等地都有較大種植規(guī)模，茯苓產(chǎn)量也不斷增加。茯苓優(yōu)良菌種是栽培生產(chǎn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，但目前國內(nèi)推廣的茯苓菌種來源單一，長期使用導(dǎo)致退化嚴(yán)重，直接影響產(chǎn)量和質(zhì)量。目前食用菌的菌種保藏常用斜面法、甘油法、木屑管法、礦物油法、冷凍干燥法、液氮保藏法等［1］，每種菌種保藏方法都有其優(yōu)點和缺點。本研究通過對茯苓菌種的斜面、木屑管、液體石蠟保藏效果進行比較，旨在找出易操作的適合茯苓菌種保藏的方法，為茯苓菌種的生產(chǎn)和栽培提供基礎(chǔ)保障。

1　材料與方法

1.1供試菌種

茯苓1號由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種中心提供，茯苓8號由湖南靖州茯苓菌核分離獲得，湖南省微生物研究院菌種保藏中心保藏。

1.2試驗方法

（1）斜面保藏法。斜面菌種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，自然pH。培養(yǎng)基注入玻璃試管，試管口加棉塞，121℃滅菌20 min，60℃烘干棉塞后擺斜面，長度為1/3試管高，接種茯苓菌種，26℃培養(yǎng)，待菌絲長滿斜面，塞子換成已滅菌的橡皮塞，固體石蠟封口，再用塑料薄膜包封，4℃保藏。

（2）木屑管保藏法。木屑管菌種培養(yǎng)基配方：木屑1 000 g，麩皮200 g，蔗糖5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，含水量60％。培養(yǎng)基裝入玻璃試管，容量為管高的2/3，保持培養(yǎng)基松緊適中，擦凈管口塞緊棉塞，用牛皮紙包扎管口后121℃高壓滅菌60 min，60℃烘干棉塞，接種茯苓菌種，26℃培養(yǎng)，待菌絲長1/2管時，塞子換成已滅菌的橡皮塞，固體石蠟封口，再用塑料薄膜包封，4℃保藏。

（3）液體石蠟保藏法。取化學(xué)純的液體石蠟裝于試管，加棉塞，瓶口包牛皮紙，121℃高壓滅菌60 min，取出置140℃烘箱中3 h，除去液體石蠟的水分。將上述液體石蠟冷卻至室溫，加入培養(yǎng)好的茯苓斜面菌種試管，液面高出培養(yǎng)基1 cm，塞子換成已滅菌的橡皮塞，用石蠟封口，再用塑料薄膜包封，直立于試管架，4℃保藏。

（4）茯苓菌絲萌發(fā)情況測定。對 3種方法保藏的2個茯苓菌種，在保藏5年期間每年進行測試，將菌種接至斜面，26℃培養(yǎng)，觀察菌絲是否萌發(fā)，設(shè)4個重復(fù)。

（5）菌絲生長特性研究。對 3種方法保藏的2個茯苓菌種，在保藏期間的第1周、1年、2年、3年分別進行測試，設(shè)4個重復(fù)。菌種轉(zhuǎn)接至9 cm玻璃平皿，菌塊接種在正中央，26℃培養(yǎng)，待處理長滿培養(yǎng)皿時測定各處理菌絲直徑，觀察菌絲長勢，計算菌絲日均生長速度。日均生長速度（cm/d）=菌絲直徑/培養(yǎng)天數(shù)。

（6）菌絲酯酶同工酶試驗。對 3種方法保藏1年的2個茯苓菌種，取培養(yǎng)皿培養(yǎng)的菌絲0.5 g，液氮研磨后加入0.5 mL磷酸緩沖液（pH 7.5），4℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液，進行酯酶同工酶電泳試驗。方法參考文獻［2］，采用聚丙酞胺凝膠電泳，點樣量20 μL，電泳結(jié)束后攝像分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同保藏方法、時間的茯苓菌種萌發(fā)情況

菌種保藏1年，茯苓1號和茯苓8號的斜面、木屑管和液體石蠟保藏菌種，接種新斜面后菌絲能正常萌發(fā)（表1）。保藏2年，斜面保藏菌種接種新斜面后不能萌發(fā)，表明斜面保藏茯苓菌種的期限在1～2年之間。保藏3年后，木屑管和液體石蠟保藏茯苓1號和茯苓8號均萌發(fā)。茯苓1號菌種保藏第4年，木屑管菌種未萌發(fā)，液體石蠟菌種保藏第5年菌絲仍萌發(fā)，說明1號菌種木屑管保藏時間為3～4年，液體石蠟可保藏5年以上。茯苓8號菌種保藏第4年，木屑管和液體石蠟保藏的菌種均萌發(fā)；保藏第5年，木屑管和液體石蠟保藏的菌種均未萌發(fā)。兩個菌種測試結(jié)果表明，木屑管保藏茯苓菌種可達3年以上，液體石蠟保藏茯苓菌種至少可達4年。

表1　不同保藏方法、時間的茯苓菌種菌絲萌發(fā)情況

表2　不同保藏方法、時間的茯苓菌種菌絲長勢和日均生長速度

2.2不同保藏方法、時間的茯苓菌種生長特性

不同保藏方法、時間茯苓菌種菌絲生長特性試驗表明（表2），菌種保藏1周，三種保藏方法的菌絲日均生長速度較快，達1 cm以上，長勢旺盛，其中液體石蠟的菌絲萌發(fā)晚，日均生長速度稍慢。茯苓1號和茯苓8號菌種保藏1年后，菌絲生長速度以木屑管保藏種較快，日均分別為1.12 cm和1.09 cm，菌絲長勢旺盛；斜面和液體石蠟保藏種菌絲生長速度較慢，長勢一般，與保藏1周的相比菌絲生長速度有所減慢。茯苓1號和茯苓8號菌種保藏2年，木屑管保藏菌種菌絲日均生長速度高于液體石蠟保藏菌種，菌絲長勢較好，液體石蠟菌種長勢一般。保藏3年后，木屑管和液體石蠟保藏菌種的日均生長速度接近，菌絲長勢都較弱。茯苓1號和茯苓8號菌種菌絲生長特性表現(xiàn)趨勢為：菌種保藏時間越長，菌絲生長速度越慢；同時期木屑管菌種比液體石蠟保藏種的菌絲生長速度快，長勢好，原因可能是由于液體石蠟粘在菌塊上，在一定程度上影響菌絲的萌發(fā)和生長。

2.3不同保藏方法茯苓菌種菌絲酯酶同工酶譜

茯苓菌種保藏1年菌絲酯酶同工酶譜帶分析結(jié)果（圖1），茯苓1號和茯苓8號2個菌種的譜帶基本相同，均為4條，兩邊2條譜帶顏色深且較寬，中間2條譜帶顏色淺且窄。

3種菌種保藏方法的菌絲譜帶相比，斜面和木屑管保藏種的菌絲顏色和寬窄基本相同，液體石蠟保藏菌種的顏色較淺，尤其是茯苓8號，液體石蠟保藏菌種明顯比另外2種保藏法的譜帶窄，顏色淺。

圖1　2個茯苓菌種菌絲酯酶同工酶譜帶及模式圖

3　討論

食用菌菌種在長期保藏中不可避免地出現(xiàn)退化、染雜等情況。因此應(yīng)依據(jù)實際情況、針對保藏目的合理選擇保藏方法。Ryan研究發(fā)現(xiàn)，對于同一種的不同菌株來說，同一保藏方法處理得到的保藏結(jié)果可能不一樣［3］。本研究茯苓1號菌種液體石蠟保藏5年萌發(fā)，茯苓8號未萌發(fā)；茯苓8號木屑管保藏4年萌發(fā)，茯苓1號未萌發(fā)，兩菌種不同保藏方法的效果存在差異。周龍洋等研究認為石蠟油保藏法對菌絲活力有影響，但適合長時間保藏，反復(fù)轉(zhuǎn)接2～3次便可得到活力較好的菌絲［4］。本研究結(jié)果證明，液體石蠟保藏茯苓菌種時間長，但保藏1年菌絲長勢不如斜面保藏和木屑管保藏法，并且保藏1年酯酶同工酶活性也較低。斜面低溫保藏法比較適合大型真菌的短期保藏，操作簡單，茯苓栽培基地用于生產(chǎn)的常規(guī)菌種可選這種保藏方法。李羿等研究認為，斜面保藏法需4～6個月轉(zhuǎn)接一次［5］，頻繁轉(zhuǎn)接發(fā)生變異的幾率較高，真空冷凍干燥保藏法適合茯苓母種的長期保藏，但設(shè)備和技術(shù)要求均較高。專業(yè)的菌種保藏中心需要根據(jù)不同的菌種，選擇兩種以上的保藏方法，木屑管保藏茯苓菌種可作為備選。對于獲得的野生菌株，應(yīng)盡量減少傳代次數(shù)，較好保藏其基因型等信息，有條件選擇超低溫保藏，可酌情選擇液體石蠟保藏法。

根據(jù)茯苓1號和8號菌種保藏1年酯酶同工酶試驗結(jié)果，2個菌種的酶譜帶相同，可能兩菌種遺傳關(guān)系相近或相同。由于我國茯苓菌種遺傳背景單一，很有可能是同種異名情況。有研究利用比較SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對國內(nèi)的大部分主要栽培品種茯苓種質(zhì)資源進行親緣關(guān)系評價，結(jié)果表明供試的主要栽培品種間整體親緣關(guān)系較近［6］。張金霞等研究認為酯酶同工酶譜是鑒定草菇菌種保藏效果的可利用的生化標(biāo)志［2］。本研究 3種保藏方法保藏1年菌絲酶譜相同，可能是因未改變菌種的遺傳特性，但未開展保藏1年之后的驗證試驗。因此保藏若干年后是否發(fā)生遺傳特性改變尚待進一步研究。

參考文獻

［1］孔維麗，袁瑞奇，孔維威，等.食用菌菌種保藏歷史、現(xiàn)狀及研究進展概述［J］.中國食用菌，2015，34（5）:1-5.

［2］張金霞，張樹庭.草菇菌種保藏效果鑒定的研究［J］.中國食用菌，1992，11（4）:3-9.

［3］Ryan，M.J..The effect of preservation regime on the physiology and genetic stability of economically important fungi［D］.University of Kent，1999.

［4］周龍洋，霍光華，羅貴祥，等.3種保藏方法對66種大型真菌活力影響［J］.生物災(zāi)害科學(xué)，2013，36（2）:130-136.

［5］李羿，萬德光.茯苓菌種保藏的研［J］.藥生物技術(shù)，2010，17（6）:516-518.

［6］蔡志欣，蔡丹鳳，陳美元，等.32個茯苓菌株的SRAP分析［J］.食藥用菌，2013，21（2）:96-98.

中圖分類號：S567.3+1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-0934（2016）03-176-04

作者簡介：楊祎，助理研究員。E-mail：52073200@qq.com

*通訊作者：吳勝蓮，高級農(nóng)藝師。E-mail：648289145@qq.com