羅宏成　溫旺榮　李珉珉　韋穎　譚曇　韋葉生★

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miR-196a2基因多態(tài)性在廣西人群中的分布

羅宏成1溫旺榮1李珉珉1韋穎2譚曇2韋葉生2★

［摘要］目的探討廣西人群miR-196a2 T＞C（rs11614913）等位基因及基因型頻率分布情況，分析其與不同民族種族之間的差異性。方法利用單堿基延伸PCR技術(shù)（polymerase chain reactionsingle base extension，PCR-SBE）和DNA測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)303例廣西人群中miR-196a2 T＞C的基因型，并比較其與人類基因組計(jì)劃（human genome project，Hapmap）數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的非洲人、歐洲人、日本人和中國(guó)北京人群的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）數(shù)據(jù)，揭示這5個(gè)不同民族種族人群的等位基因及基因型頻率分布規(guī)律。結(jié)果miR-196a2T＞C等位基因和基因型頻率在廣西男女間分布無(wú)差異性（P＞0.05）。廣西人群miR-196a2 T＞C多態(tài)性基因型及等位基因頻率與非洲人、歐洲人、日本人比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義（P＜0.05），但與北京人群無(wú)差異性（P均＞0.05）。結(jié)論廣西人群miR-196a2T＞C存在基因多態(tài)性，與別的民族種族人群比較有明顯的差異性，這種差異性對(duì)于基因組水平上疾病的研究可能會(huì)起到積極重要作用。

［關(guān)鍵詞］miR-196a2；單核苷酸多態(tài)性；種族

★通訊作者：韋葉生，E-mail：wysh22@163.com

微小核糖核酸（miRNAs）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。miRNAs主要通過部分互補(bǔ)結(jié)合到目的基因信使RNA（mRNA）的3′非編碼區(qū)（3′UTRs），部分降解靶基因或者抑制其翻譯表達(dá)［1］。miRNAs參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡、胰島素分泌、腫瘤發(fā)生發(fā)展過程等多種生物學(xué)行為［2-5］。前體miRNAs （pre-miRNAs）可以影響成熟miRNAs的形成和表達(dá)水平，從而可能影響疾病的發(fā)展和歸化。最近存在前體miRNAs的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）序列（miR-196a2T＞C ［rs11614913；chromosome 12，54385599］）被發(fā)現(xiàn)參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制［6-8］。目前有關(guān)廣西人群分布miR-196a2基因多態(tài)性在與疾病之間易感性未見報(bào)道。因此本文運(yùn)用單堿基延伸PCR和DNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)303例廣西人群miR-196a2基因型進(jìn)行檢測(cè)研究，為研究廣西人群SNP與疾病易感性提供理論知識(shí)基礎(chǔ)，也為深入認(rèn)識(shí)miR-196a2基因在人類疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

隨機(jī)選擇2014年1月至2015年12月到右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的無(wú)血緣關(guān)系健康人群303例，其中男性181例，女性122例，年齡21～86歲，平均年齡57±0.68歲。臨床實(shí)驗(yàn)室各檢查指標(biāo)均正常，排除嚴(yán)重感染、心腦血管疾病及腫瘤的體檢者。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取

抽取健康體檢者靜脈血3 mL于含EDTA-K2抗凝的管中；采用亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司全血DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說明書提取全血基因組DNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中Genebank基因庫(kù)包含人miR-196a2 T＞C（rs11614913）SNP位點(diǎn)的全長(zhǎng)序列，用在線軟件primer3.0設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-196a2 T＞C （rs11614913）上游引物序列：5′-CCCCTTCCCTT CTCCTCCAGAT-3′，下游引物序列為：5′-TTGTTCTGCAACCCCACTCACA-3′，延伸引物序列：5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTG-3′。

1.2.3PCR擴(kuò)增

miR-196a2 T＞C（rs11614913）位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系20 μL體系包含有PCR緩沖液1x GC buffer I（TAKARA，寶生物工程（大連）有限公司）2 μL，0.2 mmol/L dNTP 2.0 μL（GENERAY BIOTECH，上海捷瑞生物工程有限公司），0.2 μmol/L上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA 1.0 μL，若體積不足20 μL用滅菌雙蒸水補(bǔ)足。PCR產(chǎn)物用德國(guó)Qiagen公司的Hot-StarTaq進(jìn)行多重PCR獲得，8 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.5U蝦堿酶（SAP）（Promega，美國(guó)）和4U外切酶I （EXO I）（Epicentre，美國(guó)）純化后，再用美國(guó)ABI公司的SNaPshot Multiplex kit技術(shù)于37℃孵育60 min，緊接著75℃孵育15 min進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸產(chǎn)物用蝦堿酶（SAP）（Promega，美國(guó)）純化后用美國(guó)ABI3730XL測(cè)序儀電泳測(cè)序。SNP分型用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems，美國(guó)）來分析。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2 min；擴(kuò)增階段為：94℃預(yù)變性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)11次；94℃預(yù)變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)24次；最后階段72℃延長(zhǎng)2 min。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，基因型和等位基因頻率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，采用χ2檢驗(yàn)比較各組間基因型及等位基因頻率，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1miR-196a2 T＜C基因型檢測(cè)結(jié)果

miR-196a2 T＜C基因均具有多態(tài)性，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小為：276 bp。miR-196a2 T＜C基因有CC、CT、TT 3種基因型。基因測(cè)序儀ABI3730測(cè)序證實(shí)了我們的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果見圖1。

2.2miR-196a2 T＞C基因多態(tài)性在廣西健康人群中的分布

miR-196a2 T＞C基因型和等位基因頻率，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，所有基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，樣本來源具有群體代表性。miR-196a2多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西人群男女之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2分別為0.119和0.023，P值分別為0.942和0.879，P均大于0.05），miR-196a2 T＞C基因以CT雜合子基因型多見，占52.5%，等位基因T多見，占51.0%，結(jié)果見表1。

表1　廣西人群miR-196a2 T＞C（rs11614913）基因型和等位基因頻率分布比較Table 1　The distribution of allele and genotype frequences of miR-196a2 T＞C（rs11614913）gene in Guangxi population

2.3miR-196a2 T＞C基因在不同種族人群間的比較

miR-196a2 T＞C基因多態(tài)性分布頻率分別與人類基因組計(jì)劃公布（human genome project，Hap-Map）公布非洲人、歐洲人、日本人和中國(guó)北京人4個(gè)人群的SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。廣西人群miR-196a2 T＞C多態(tài)性基因型及等位基因頻率與非洲人、歐洲人、日本人比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義（χ2分別為141.34、7.73、8.43和148.23、4.45、6.64；P均小于0.05），但與中國(guó)北京人比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別1.91和0.05；P均大于0.05），見表2。

3　討論

miRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA（前體miRNA），長(zhǎng)度大約為300～1 000個(gè)堿基，pri-miRNA經(jīng)過一次加工后，成為pre-miRNA即miRNA前體，長(zhǎng)度大約為70～90個(gè)堿基，pre-miRNA再經(jīng)過Dicer酶酶切后，成為長(zhǎng)約20～24核苷酸（nucleotide，nt）的成熟miRNA。每個(gè)miRNA可能有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNA也可同時(shí)調(diào)節(jié)同一個(gè)靶基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNA的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因，備受科學(xué)研究人員的關(guān)注。SNP主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。越來越多的研究表明，存在于前體miRNA的SNP會(huì)影響成熟miRNA的表達(dá)水平以及人類疾病易感性［9-10］。最近很多研究表明，miR-196a2 T＞C （rs11614913）基因多態(tài)性與許多疾病的易感性有關(guān)，miR-196a2（rs11614913）與北印度人乳腺癌、肺癌等風(fēng)險(xiǎn)性密切相關(guān)［11-12］，miR-196a2基因多態(tài)性會(huì)改變成熟miR-196a2的表達(dá)量而引起非霍奇金淋巴瘤［13］。刁吉東等［14］研究認(rèn)為miR-196a2內(nèi)的SNP rs11614913與中國(guó)皖南地區(qū)漢族人群支氣管哮喘的發(fā)生有相關(guān)性。肖茗淵等［15］研究發(fā)現(xiàn)miR-196a2（rs11614913）與中國(guó)華東地區(qū)人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）遺傳易感性有關(guān)。miR-196a2基因多態(tài)性通過結(jié)合到其同源異型基因C8（HOXC8）靶基因就會(huì)增加中國(guó)兒童患急性淋巴細(xì)胞白血病的危險(xiǎn)［16］。因此，深入分析miR-196a2基因多態(tài)性在不同民族種族的分布規(guī)律，有利于我們運(yùn)用基因多態(tài)性去認(rèn)識(shí)和解釋更多疾病在不同種族民族人群中的發(fā)病率和發(fā)病機(jī)制。

表2　不同地區(qū)民族及種族miR-196a2 T＞C（rs11614913）基因多態(tài)性頻率分布比較Table 2 The comparison of frequency distribution of miR-196a2 T＞C（rs11614913）gene Polymorphism among different ethnic and regional groups

本文采用單堿基延伸PCR技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)303例廣西健康人群miR-196a2基因多態(tài)性進(jìn)行研究，統(tǒng)計(jì)其各自基因型和等位基因分布情況。分析結(jié)果表明miR-196a2均存在基因多態(tài)性，miR-196a2 T＞C（rs11614913）存在CC、CT、TT 3種基因型。miR-196a2 T＞C（rs11614913）以CT雜合子多見，占52.5%，等位基因T多見，占51.0%，miR-196a CT（52.5%）均高于非洲人（25.7%）、歐洲人（44.2%）、日本人（45.3%）、北京人（44.2%），原因可能是miR-196a基因多態(tài)性受各民族生活習(xí)慣及環(huán)境影響。miR-196a2基因在廣西健康男女人群中基因型和等位基因分布均無(wú)差異（χ2分別為（0.269和0.023，P均＞0.05）。miR-196a2 T＞C多態(tài)性基因型及等位基因頻率與非洲人、歐洲人、日本人比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義（χ2分別為141.34、7.73、8.43和148.23、4.45、6.64；P均小于0.05），但與中國(guó)北京人群無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2分別為1.910 和0.050，P均大于0.05），與人類遺傳學(xué)有關(guān)人類親緣關(guān)系越近，其基因型分布規(guī)律相似程度越高相符合。

以上研究表明，廣西健康人群miR-196a2基因型及等位基因與其他民族種族存在差異性，正確分析其基因型在不同地區(qū)人群的分布特點(diǎn)，為今后更深一步研究miR-196a2基因多態(tài)性在不同民族種族人群相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制以及疾病的防治提供科學(xué)有效途徑，也為人類群體遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

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Distribution of genetic polymorphism of miR-196a2 gene in Guangxi population

LUO Hongcheng1，WEN Wangrong1，LI Minmin1，WEI Ying2，TAN Tan2，WEI Yesheng2★
（1.Department of Laboratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou，Guangdong，China，510632；2.Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise，Guangxi，China，533000）

［ABSTRACT］ObjectiveTo study the frequencies of allele and genotype distribution of miR-196a2 T＜C（rs11614913）gene，and to analyze the statistical differences between different races and nationalities. MethodsThe gene of single nucleotide polymorphisms（SNP）miR-196a2T＜C were detected using polymerase chain reaction-single base extension（PCR-SBE）technique and DNA sequencing methods in 303 Chinese Guangxi populations，and compared with differences SNPs date among the European，African，Japanese and Chinese populations in Beijing from the human genome project（HapMap），and the distribution of allele and genotype frequencies of 5 nationalities were revealed.ResultsThere were no statistical differences of allele and genotype distribution in miR-196a2T＜C between female and male group（P＞0.05）. There were significantly different frequencies of allele and genotype distributions of miR-196a2 T＜C when compared with Europeans，Africans and Japanese，but no statistical differences when compared with Chinese in Beijing from China.ConclusionThere were significant differences in allele frequencies and genotype distributions of the gene polymorphism miR-196a2T＜C when compared with other racial and nationalities，and this difference in genome level may play a positive role in the research of disease.

［KEY WORDS］miR-196a2；single nucleotide polymorphisms（SNP）；Ethnic

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560552，81060243）

作者單位：1.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科，廣東，廣州510632 2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西，百色533000