過(guò)丹丹　盧鑫鑫　黃肖利　陳喜軍　張彪　鄭佳瑩　伍嚴(yán)安，★

?

·論著·

一例Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病患者的NF1突變檢測(cè)及家系分析

過(guò)丹丹1盧鑫鑫1黃肖利2陳喜軍2張彪1鄭佳瑩1伍嚴(yán)安1，2★

［摘要］目的對(duì)1例臨床擬診為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 1，NF1）患者進(jìn)行致病基因突變研究。方法提取先證者及其家系成員外周全血基因組DNA，通過(guò)目標(biāo)捕獲二代測(cè)序技術(shù)（targeted next-generation sequencing，TNGS）對(duì)先證者Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤蛋白基因（neurofibromin 1，NF1）的全部編碼區(qū)外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)可疑突變，并用Sanger測(cè)序法進(jìn)一步驗(yàn)證；對(duì)其家系成員NF1相同突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序檢測(cè)。結(jié)果基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)先證者NF1第45號(hào)外顯子1個(gè)已知致病突變c.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter），有類(lèi)似臨床表現(xiàn)的父親和姐姐檢出相同突變，表型正常的母親和妻子未檢測(cè)到此突變，其4歲兒子也檢測(cè)出該突變。結(jié)論NF1的c.6790_ 6791insA（p.Tyr2264Ter）突變存在與該家系NF1的發(fā)病密切相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］突變檢測(cè)；Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤??；NF1基因；目標(biāo)捕獲二代測(cè)序

★通訊作者：伍嚴(yán)安，E-mail：wyaslyy@126.com

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 1，NF1）（MIM#162200）是源于神經(jīng)嵴細(xì)胞分化異常而導(dǎo)致多系統(tǒng)損害的常染色體顯性遺傳病，患病率約為1/2 500～1/3 000［1］。該病的臨床表現(xiàn)為皮膚咖啡牛奶斑、雀斑、多發(fā)神經(jīng)纖維瘤、虹膜Lisch結(jié)節(jié)、虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨骼異常等［2］。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）于1988年提出了NF1的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括其中2項(xiàng)或2項(xiàng)以上即可診斷為NF1［3］。該病是由于Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤蛋白基因（neurofibromin 1，NF1）（MIM#613113）突變及表達(dá)異常所致［4-5］。本研究用目標(biāo)捕獲二代測(cè)序技術(shù)（targeted next-generation sequencing，TNGS）對(duì)一個(gè)NF1家系進(jìn)行NF1突變的檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象

先證者，男，32歲，漢族，于2015年因全身皮膚多發(fā)性結(jié)節(jié)到福建省立醫(yī)院皮膚科就診，按照NIH的診斷標(biāo)準(zhǔn)擬診為NF1。先證者的母親、妻子表型正常，父親和姐姐均有類(lèi)似的皮膚表現(xiàn)。有一4歲兒子。家系圖見(jiàn)圖1。

1.2方法

1.2.1基因組DNA抽提

獲得研究對(duì)象知情同意后，抽取該先證者、父母、姐姐、妻子及兒子的外周靜脈血2 mL，均用EDTA抗凝。用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，德國(guó)）抽提全血基因組DNA。檢測(cè)所提取DNA的濃度及純度，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：DNA濃度＞100 ng/μL，總量＞5 μg，A260/A280比值范圍在1.8～2.0之間。

1.2.2TNGS及數(shù)據(jù)處理

檢測(cè)先證者合格的1 μg基因組DNA，使用超聲波儀（Covaris S2，美國(guó)）進(jìn)行隨機(jī)打斷，產(chǎn)生200～250 bp的隨機(jī)片段。在片段兩端加接頭，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。使用定制的2.1 M芯片（customized capture array）（Roche NimbleGen，美國(guó)）進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲。該芯片已經(jīng)過(guò)大規(guī)模平行測(cè)序（massive parallel sequence，MPS）應(yīng)用，顯示有良好的敏感性和檢測(cè)效率［6］。該芯片基因檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域捕獲范圍包括NF1全部外顯子區(qū)域及其鄰近10 bp的側(cè)翼區(qū)。富集的 DNA庫(kù)在 Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行擴(kuò)增并高通量測(cè)序。分別用SOAPsnp軟件和Samtools分析單堿基變異和插入/缺失。建庫(kù)、雜交、測(cè)序、序列比對(duì)及基因拷貝數(shù)變異分析的方法都與之前文章方法一致［6-7］。通過(guò)國(guó)際千人基因組計(jì)劃（the 1000 genome project）、NCBI單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI dbSNP）、華大基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（BGI-DB）、人類(lèi)基因突變協(xié)會(huì)（Human Genome Variation Society，HGVS）命名規(guī)則、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（the human gene mutation database，HGMD）等數(shù)據(jù)庫(kù)，明確是否存在突變及其性質(zhì)。

1.2.3Sanger測(cè)序驗(yàn)證

采用常規(guī)Sanger測(cè)序方法對(duì)先證者二代測(cè)序檢出的可疑突變所在外顯子區(qū)域進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。第45號(hào)外顯子的上游引物序列：5′-CCGAGATTCAGTTTAGGAGTTA-3′；下游引物序列：5′-CGCTTGAGAACATACTATCCAT-3′，產(chǎn)物片段大小為376 bp。PCR反應(yīng)體系：10×ExTaq buffer（Mg2+Plus）5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、20 μmol/L上下游引物各2 μL、DNA模板2 μL、ExTaq DNA聚合酶0.25 μL（TaKaRa，日本），去離子水補(bǔ)足至50 μL。用TP600PCR儀（TaKaRa，日本）進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸50 s，共36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取2.5 μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)電泳顯示在相應(yīng)位置為清晰單一條帶的PCR產(chǎn)物，用ABI3730測(cè)序儀（ABI，美國(guó)）進(jìn)行DNA雙向測(cè)序。用同樣方法對(duì)先證者父母、姐姐、妻子及兒子進(jìn)行45號(hào)外顯子的Sanger測(cè)序。

2　結(jié)果

2.1臨床特征

先證者自出生時(shí)即在軀干四肢發(fā)現(xiàn)幾處褐色斑，隨著年齡的增長(zhǎng)，褐色斑逐漸增多增大，部分斑面增大發(fā)展為褐色斑片。青春期時(shí)，全身皮膚出現(xiàn)大量大小不一，呈粉紅色或膚色的孤立性結(jié)節(jié)，半球形，質(zhì)地軟硬不等，部分有蒂，在面部、軀干、四肢均有分布，在軀干較多。曾因軀干部位結(jié)節(jié)摩擦導(dǎo)致疼痛多次手術(shù)切除治療。體檢在軀干四肢可見(jiàn)數(shù)百枚腫物，大小約為0.3～2.5 cm，觸之柔軟。在腋窩處可見(jiàn)大量大小不一的雀斑（圖2A、B、C）。眼科檢查在裂隙燈下雙眼虹膜均可見(jiàn)2個(gè)以上的Lisch結(jié)節(jié)，患者身高1.51 m，智力正常，視力與聽(tīng)力正常，頭顱及脊柱磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）未見(jiàn)明顯神經(jīng)系統(tǒng)異常，未見(jiàn)其他系統(tǒng)疾病。姐姐皮膚有類(lèi)似表現(xiàn)，另曾于6年前因左外耳后神經(jīng)纖維瘤進(jìn)行手術(shù)切除，現(xiàn)又復(fù)發(fā)（圖2DE），MRI顯示左側(cè)外耳軟組織浸潤(rùn)性病變。兒子4歲，軀干及四肢發(fā)現(xiàn)多處褐色斑，但無(wú)皮膚結(jié)節(jié)（圖2F）。

2.2TNGS結(jié)果及生物信息學(xué)分析

對(duì)NF1全部編碼區(qū)外顯子捕獲測(cè)序，目標(biāo)區(qū)覆蓋度達(dá)到100.00%，平均測(cè)序深度（×）約為597，目標(biāo)區(qū)平均深度＞30×位點(diǎn)所占比例約為99%（圖3）。在第45號(hào)外顯子檢測(cè)到一突變c.6790_ 6791insA（p.Tyr2264Ter），造成突變位點(diǎn)編碼酪氨酸的密碼子UAC變?yōu)榻K止密碼子UAA，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的翻譯提前終止，形成由2 264個(gè)氨基酸組成的截短多肽。經(jīng)檢索為報(bào)道過(guò)的突變［8］。

2.3Sanger測(cè)序驗(yàn)證及突變性質(zhì)分析

Sanger測(cè)序證實(shí)了先證者存在c.6790_6791insA突變，其父親、姐姐及4歲兒子也檢測(cè)出該突變。表型正常的母親和妻子未檢測(cè)出此突變（圖4）。

3　討論

NF1定位于染色體17q11.2，包含57個(gè)組成性外顯子和3個(gè)可變剪接外顯子，全長(zhǎng)283 kb，有3個(gè)大小為11～13 kb的成熟轉(zhuǎn)錄本。其蛋白產(chǎn)物為神經(jīng)纖維瘤素，由2 818個(gè)氨基酸組成，大量表達(dá)于神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、許旺細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、性腺細(xì)胞和白細(xì)胞。NF1是腫瘤抑制基因，其突變可干擾Ras循環(huán)的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而引發(fā)腫瘤［9］。NF1表達(dá)的丟失導(dǎo)致神經(jīng)纖維素RasGAP功能的喪失，最終導(dǎo)致RAS活性的增加、細(xì)胞增生以及腫瘤的形成［10］。本研究通過(guò)TNGS和Sanger測(cè)序驗(yàn)證確定先證者家系存在遺傳學(xué)病因——c.6790_6791insA突變。c.6790_ 6791insA造成突變位點(diǎn)編碼酪氨酸的密碼子UAC→UAA（終止密碼子），導(dǎo)致蛋白質(zhì)的翻譯提前終止，形成僅有2 264個(gè)氨基酸組成的截短多肽，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。NF1是常染色體顯性遺傳性疾病，由于負(fù)顯性效應(yīng)機(jī)制導(dǎo)致患者患病。

NF1患者易患視神經(jīng)膠質(zhì)瘤和髓白血病，并可能出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、血管畸形和骨骼畸形，NF1與多種組織和疾病的進(jìn)展有關(guān)［11］。NF1異常增加了5倍的患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，有10%～13%NF1會(huì)發(fā)展為惡性外周神經(jīng)鞘瘤［12］。本研究中先證者姐姐左外耳后神經(jīng)纖維瘤手術(shù)切除后又復(fù)發(fā)，MRI顯示左側(cè)外耳軟組織浸潤(rùn)性病變，不能排除惡變，因此需繼續(xù)隨訪(fǎng)。其兒子目前只是軀干和四肢有多處褐色斑，沒(méi)有皮膚結(jié)節(jié)。但由于經(jīng)Sanger測(cè)序確定了其也存在NF1的c.6790_6791insA突變，因此可以預(yù)測(cè)到青春期，該患兒將會(huì)出現(xiàn)與先證者類(lèi)似的皮膚結(jié)節(jié)臨床表現(xiàn)。

NF1基因龐大、外顯子多、缺乏明顯的突變熱點(diǎn)，在還沒(méi)有TNGS技術(shù)以前，國(guó)內(nèi)外有一些文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)PCR擴(kuò)增NF1基因全部外顯子，再逐一Sanger測(cè)序檢測(cè)突變，該方法較為繁瑣。近年來(lái)出現(xiàn)的TNGS通過(guò)芯片對(duì)目標(biāo)基因編碼區(qū)及鄰近剪接區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集，使用高通量測(cè)序平臺(tái)可對(duì)多外顯子基因和多種遺傳病的相關(guān)基因進(jìn)行突變檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外已有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)TNGS對(duì)NF1進(jìn)行突變檢測(cè)［13-15］，顯示該方法具有高效、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。本研究用TNGS準(zhǔn)確地檢測(cè)出了患者的NF1突變位點(diǎn)。這一結(jié)果提示，該技術(shù)是NF1診斷的有效手段，值得在臨床應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)對(duì)NF1患者進(jìn)行基因檢測(cè)只有少量報(bào)道。臨床很少對(duì)NF1患者進(jìn)行基因診斷的原因可能是因?yàn)槠涓鶕?jù)臨床表現(xiàn)易于診斷，但對(duì)患者做基因檢測(cè)有明顯的益處。NF1作為常染色體顯性遺傳性疾病，有50%的遺傳率?；驒z測(cè)不僅可以在基因水平明確病因，還可以為患者及其家系成員提供產(chǎn)前診斷的依據(jù)，為其提供生育無(wú)NF1健康孩子的機(jī)會(huì)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Williams VC，Lucas J，Babcock MA，et al.Neurofibromatosis type 1 revisited［J］.Pediatrics，2009，123（1）：124-133.

［2］ Jett K，F(xiàn)riedman JM.Clinical and genetic aspects of neurofibromatosis 1［J］.Genet Med，2010，12（1）：1-11.

［3］ National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement：neurofibromatosis.Bethesda，Md，USA，July 13-15，1987［J］.Neurofibromatosis， 1988，1（3）：172-178.

［4］ Buchberg AM，Cleveland LS，Jenkins NA，et al.Sequence homology shared by neurofibromatosis type-1 gene and IRA-1 and IRA-2 negative regulators of the RAS cyclic AMP pathway［J］.Nature，1990，347（6290）：291-294.

［5］ Xu GF，O’Connell P，Viskochil D，et al.The neurofibromatosis type 1 gene encodes a protein related to GAP ［J］.Cell，1990，62（3）：599-608.

［6］ Wei X，Ju X，Yi X，et al.Identification of sequence variants in genetic disease-causing genes using targeted next-generation sequencing［J］.Plos One，2011，6（12）：e29500.

［7］ Wei X，Dai Y，Yu P，et al.Targeted next-generation sequencing as a comprehensive test for patients with and female carriers of DMD/BMD：a multi-population diagnostic study［J］.Eur J Hum Genet，2014，22（1）：110-118.

［8］ Upadhyaya M，Spurlock G，Monem B，et al.Germline and somatic NF1 gene mutations in plexiform neurofibromas［J］.Hum Mutat，2008，29（8）：E103-111.

［9］ Upadhyaya M，Osborn MJ，Maynard J，et al.Mutational and functional analysis of the neurofibromatosis type 1 （NF1）gene［J］.Hum Genet，1997，99（1）：88-92.

［10］Cappione AJ，F(xiàn)rench BL，Skuse GR.A potential role for NF1 mRNA editing in the pathogenesis of NF1 tumors［J］.Am J Hum Genet，1997，60（2）：305-312.

［11］Ferner RE，Huson SM，Thomas N，et al.Guidelines for the diagnosis and management of individuals with neurofibromatosis 1［J］.J Med Genet，2007，44（2）：81-88.

［12］Evans DG，Baser ME，McGaughran J，et al.Malignant peripheral nerve sheath tumours in neurofibromatosis 1 ［J］.J Med Genet，2002，39（5）：311-314.

［13］Pasmant E，Parfait B，Luscan A，et al.Neurofibromatosis type 1 molecular diagnosis：what can NGS do for you when you have a large gene with loss of function mutations？［J］.Eur J Hum Genet，2015，23（5）：596-601.

［14］Uusitalo E，Hammais A，Palonen E，et al.Neurofibromatosis type 1 gene mutation analysis using sequence capture and high-throughput sequencing［J］.Acta Derm Venereol，2014，94（6）：663-666.

［15］朱鐵山，黃尚志，伍建，等.一例神經(jīng)纖維瘤病Ⅰ型患者NF1基因新的插入缺失型突變［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2015，32（3）：318-322.

NF1 mutation detection and pedigree analysis in a patient with neurofibromatosis type 1

GUO Dandan1，LU Xinxin1，HUANG Xiaoli2，CHEN Xijun2，ZHANG Biao1，ZHENG Jiaying1，WU Yanan1，2★
（1.Provincial Clinical Medical College，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian，China，350004；2.Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)ujian Provincial Hospital，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian，China，350001）

［ABSTRACT］ObjectiveTo identify the genetic ecology in a patient with neurofibromatosis type 1 （NF1）.MethodsThe genomic DNA was extracted from peripheral blood of the proband and his family members.All coding exons and the flanking sequences of neurofibromin 1（NF1）from the proband were screened by targeted next-generation sequencing（TNGS），the suspected mutation was validated by Sanger sequencing.Finally，the same mutation site was detected in his family members by Sanger sequencing. ResultsA known pathogenic mutation c.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter）was identified in the exon 45 of NF1 in the proband，his father and sister had similar clinical manifestations，but his mother and wife were asymptomatic.The same mutation was also detected in his 4-year-old son.ConclusionThe mutation ofc.6790_6791insA（p.Tyr2264Ter）is closely related to the pathogenesis of the NF1 family.

［KEY WORDS］Mutation detection；Neurofibromatosis type 1；NF1 gene；Targeted next-generation sequencing

作者單位：1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建，福州350004 2.福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建，福州350001