肖天津　張樂平　古中東　黃延平

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Treg細(xì)胞和IL-12在肺結(jié)核合并老年慢性支氣管炎患者外周血中的表達(dá)及意義

肖天津1★張樂平2古中東1黃延平1

［摘要］目的研究CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）與白細(xì)胞介素12 （interleukin-12，IL-12）在肺結(jié)核合并老年慢性支氣管炎（老慢支）患者外周血中的表達(dá)變化及臨床意義。方法收集河源市人民醫(yī)院2012年1月至2015年6月新發(fā)肺結(jié)核合并老慢支的病人80例（觀察組），并以同期單純老慢支病人80例作為對照組1，健康體檢人群80例作為對照組2。分別在治療前、治療3月末和6月末，抽取外周血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測IL-12水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞的表達(dá)。采用SPSS 17.0軟件，配對t檢驗(yàn)比較各組間差異。結(jié)果治療前，觀察組患者外周血IL-12水平顯著低于兩組對照組（P＜0.05）；CD4+T細(xì)胞值低于兩組對照組（P＜0.05），Treg細(xì)胞水平高于兩組對照組（P＜0.05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療3、6個(gè)月末，觀察組患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯降低，而IL-12表達(dá)水平上升（P＜0.05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論外周血Treg細(xì)胞和IL-12表達(dá)水平與肺結(jié)核具有相關(guān)性，可以作為鑒別診斷、病情轉(zhuǎn)歸的的輔助指標(biāo)。

［關(guān)鍵詞］肺結(jié)核；老年慢性支氣管炎；CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；白細(xì)胞介素12

★通訊作者：肖天津，E-mail：1091870961@qq.com

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染病。由于MTB屬胞內(nèi)寄生菌，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機(jī)體抗結(jié)核感染中發(fā)揮主要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）是一類具有免疫抑制作用的T淋巴細(xì)胞亞群，膜表面高表達(dá)CD4和CD25，能識別靶細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子所提呈的抗原肽，通過接觸依賴或釋放細(xì)胞因子等多種機(jī)制參與機(jī)體免疫耐受、免疫自穩(wěn)等，近來在結(jié)核病等慢性感染性疾病中的作用日益受到關(guān)注。Treg細(xì)胞參與免疫抑制調(diào)節(jié)使它在結(jié)核病中具有雙重作用，一方面可以抑制可能對宿主機(jī)體組織有害的過度炎癥反應(yīng)，但同時(shí)也可能抑制了保護(hù)性的免疫反應(yīng)，反而有利于病原體的持留［1］。巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌后生成白細(xì)胞介素12（interleukin-12，IL-12），IL-12參與Thl細(xì)胞從前體的分化，調(diào)節(jié)Thl/Th2細(xì)胞的平衡［2］。而Thl/Th2失衡是結(jié)核病的免疫學(xué)特征，Th2型細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)和效應(yīng)因子分泌增加、炎癥介質(zhì)過度釋放又可能與支氣管炎癥相關(guān)。本研究選取肺結(jié)核并發(fā)老慢支患者，以老慢支患者和健康人群為對照，以了解Treg細(xì)胞以及IL-12與老年人慢性支氣管炎病人并發(fā)肺結(jié)核的意義，為輔助鑒別診斷和免疫治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對象

選取河源市人民醫(yī)院2012年1月至2015年6月期間新登記的菌陽肺結(jié)核合并老年慢性支氣管炎患者80例為觀察組，單純老年慢性支氣管炎患者80例為對照組1。并以同期健康體檢人群80例作為對照組2。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核診斷均按照中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會《肺結(jié)核診斷和治療指南》［3］，肺部X線有浸潤性病變，痰抗酸染色陽性或陰性，但痰培養(yǎng)抗酸桿菌陽性，經(jīng)對硝基苯甲酸培養(yǎng)基初步鑒定為結(jié)核分枝桿菌排除標(biāo)準(zhǔn)：已經(jīng)使用過抗結(jié)核藥物化療；合并肝炎、糖尿病及其他免疫相關(guān)性疾?。皇褂锰瞧べ|(zhì)激素及免疫抑制劑。剔除標(biāo)準(zhǔn)：凡治療6個(gè)月后痰菌涂片或培養(yǎng)不陰轉(zhuǎn)者剔除出組。最后納入80例中男性61例，女性18例，其中年齡60～80歲，平均年齡66.4歲。對照組1均X線檢測為慢性支氣管炎，結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性，排除標(biāo)準(zhǔn)同觀察組。納入80例中其中男性65例，女性15例。年齡61～80歲，平均年齡67.9歲。對照組2為健康體檢人群，結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性，排除標(biāo)準(zhǔn)同觀察組。男性65例，女性15例。年齡61～80歲，平均年齡67.0歲。所有研究均獲得患者知情同意。

1.2主要試劑和儀器

人淋巴細(xì)胞分離液購自美國Sigma公司；熒光標(biāo)記抗體抗人CD3-FITC、CD4-PE、CD25-PerCP、CD127-APC，同型對照小鼠IgGl抗體均購自美國BD公司；IL-12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒為法國DIACLONE公司產(chǎn)品。FACS Calibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。二氧化碳培養(yǎng)箱和Multiskan FC酶標(biāo)儀購自美國Forma Scientific公司。

1.3檢測方法

1.3.1標(biāo)本采集

分別在治療前、治療3月末和6月末，采集觀察組患者外周靜脈血6 mL。其中3 mL肝素抗凝，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中Treg細(xì)胞的比例。另3 mL于凝血管靜置30 min后，1 000 rpm/ min離心15 min，后分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。對照組一次性采集外周靜脈血6 mL，處理同上。

1.3.2Treg細(xì)胞檢測

人淋巴細(xì)胞分離液分離PBMCs，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌2次后計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度1×107個(gè)細(xì)胞/mL。每管取1×106個(gè)細(xì)胞，加入CD3-FITC、CD4-PE、CD25-PerCP、CD127-APC單抗，同時(shí)做同型對照管，孵育30 min，PBS洗滌3次后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。按規(guī)程操作，檢測結(jié)果以CD3+CD4+CD25+CD127-T細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的百分率表示。

1.3.3IL-12檢測

應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀上讀取吸光度（optical density，OD）值，波長為490 nm，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)血清樣品的OD值計(jì)算IL-12濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平變化

80例肺結(jié)核合并老慢支患者患者和對照組外周血CD4+T、CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞水平如下：治療前外周血PBMCs中的CD4+T細(xì)胞低于單純老慢支患者和健康對照人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為t=119.48，P＜0.05和t=203.20，P＜0.05）。外周血Treg細(xì)胞高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為t=164.04，P＜0.05和t=127.43，P＜0.05）。規(guī)范治療3個(gè)月、6個(gè)月后觀察組CD4+（%）水平上升，而Treg細(xì)胞/CD4+（%）下降。3月末、6月末CD4+T細(xì)胞比例上升，而Treg細(xì)胞/CD4+下降，與治療前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=13.845，P＜0.05、t=12.282，P＜0.05、t=3.311，P＜0.05、t=17.0765，P＜0.05），具體見表1。

表1　患者外周血CD4+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞及IL-12水平比較Table 1　CD4+T cell，regulatory T cells and IL-12 expression in peripheral blood from different groups

2.2外周血IL-12水平

治療前老慢支合并肺結(jié)核患者患者外周血IL-12水平明顯低于單純老慢支患者（t=68.156，P＜0.05）和健康對照組（t=67.641，P＜0.05），治療3月末、6月末明顯上升，與治療前有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 13.721，P＜0.05、t=10.100，P＜0.05）。完成6個(gè)月療程后觀察組與健康對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3　討論

T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在特異性免疫反應(yīng)中起重要作用。機(jī)體抗結(jié)核免疫機(jī)制主要由Th1、Th2、Treg細(xì)胞介導(dǎo)。Th1型免疫反應(yīng)主要介導(dǎo)機(jī)體對于結(jié)核病產(chǎn)生保護(hù)性免疫，已有研究表明，Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的過度下調(diào)和Th2細(xì)胞水平增加與結(jié)核病的進(jìn)展有關(guān)［4］。而Treg細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞表面T細(xì)胞受體激活后，可以抑制γδ T-細(xì)胞分泌結(jié)核特異性IFN-γ，抑制其他CD4+T-cell的反應(yīng)，使得結(jié)核分枝桿菌不能被清除，然而，Treg細(xì)胞在在宿主抗感染免疫中所扮演的角色利弊尚不完全清楚［5-7］。He和Pang等［8-9］報(bào)道Treg細(xì)胞在活動性結(jié)核患者表達(dá)增高，但也有報(bào)道在結(jié)核病患者中沒有發(fā)現(xiàn)這種上升［10］。本研究中結(jié)核合并老慢支患者治療前外周血中Treg細(xì)胞均比單純老慢支及健康對照組高，分析可能是由于Treg細(xì)胞具有免疫低反應(yīng)性和免疫抑制功能的特征，其升高導(dǎo)致免疫抑制作用增強(qiáng)，Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡，可能與結(jié)核病慢性發(fā)展病程相關(guān)。隨著抗結(jié)核治療，Treg細(xì)胞比例明顯下降，Th1/Th2免疫應(yīng)答恢復(fù)，證實(shí)Treg細(xì)胞參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。Treg細(xì)胞的深入研究為結(jié)核病的免疫治療提供了新的思路，Treg及相關(guān)免疫抑制性分子可以作為有前途的治療靶點(diǎn)。

結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的宿主免疫應(yīng)答和病原體免疫逃逸之間的相互作用取決于多種因素，其中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)平衡是關(guān)鍵因素之一。結(jié)核分枝桿菌早期感染后，DC細(xì)胞分泌IL-12，遷移到淋巴結(jié)，參與Th1細(xì)胞的成熟，誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生［11］，因此IL-12在早期抗結(jié)核反應(yīng)中是啟動保護(hù)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性調(diào)控細(xì)胞因子［12］。IL-12的高親合力受體IL-12R在Th1和Th2細(xì)胞表面都有表達(dá)，IL-12通過與其結(jié)合，促進(jìn)CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化與增殖，并促使兩者分泌IFN-γ，抑制IL-4的分泌，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡［13］。IL-12的表達(dá)水平可以在一定程度上反應(yīng)機(jī)體Th1/Th2偏移情況，但在結(jié)核病患者中有關(guān)IL-12的表達(dá)研究結(jié)果報(bào)道不一［14-15］，可能與病例納入與排除的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、樣本數(shù)偏少、有些僅為橫斷面分析等因素有關(guān)。本研究對80例新等級菌陽患者的檢測結(jié)果提示，結(jié)核合并老慢支患者外周血治療前IL-12的水平低于單純老慢支患者和健康人群，而治療3月末、6月末逐漸上升，6月末與健康對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明IL-12作為Th1型細(xì)胞因子，在患者治療前的低水平可能代表體內(nèi)細(xì)胞免疫功能的低下及機(jī)體抗結(jié)核保護(hù)性免疫力的降低，結(jié)核分枝桿菌不能清除或者抑制。有效治療后，IL-12的上升伴隨著Treg細(xì)胞水平的下降，表明經(jīng)抗結(jié)核治療后患者Th1/Th2免疫應(yīng)答逐漸恢復(fù)平衡。因此IL-12水平檢測對肺結(jié)核合并老慢支的鑒別診斷以及臨床病情轉(zhuǎn)歸有一定意義。

本文研究了Treg細(xì)胞、IL-12在肺結(jié)核合并老慢支患者外周血中與單純老慢支患者、健康人群的表達(dá)差異以及治療過程中的動態(tài)變化，這種差異進(jìn)一步證實(shí)了T細(xì)胞亞群失衡參與結(jié)核病發(fā)病。針對Treg細(xì)胞在結(jié)核病發(fā)生的作用，降低患者體內(nèi)Treg細(xì)胞的水平，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的活化狀態(tài)機(jī)免疫功能，可為結(jié)核病的免疫治療提供新的作用靶點(diǎn)。IL-12可作為判斷患者免疫狀態(tài)及肺結(jié)核活動性的臨床參考指標(biāo)，通過檢測老年人特別是患有慢性支氣管炎病人的細(xì)胞因子水平，對老年患者預(yù)防結(jié)核病有一定意義。

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Expression of regulatory T cells and interleukin-12 in aged patients with active pulmonary tuberculosis complicated with chronic bronchitis

XIAO Tianjin1★，ZHANG Leping2，GU Zhongdong1，HUANG Yanping1
（1.Department of Outpatient，Heyuan People’s Hospital，Heyuan，Guangdong China，517000；2.Department of Outpatient，Shenzhen Center for Chronic Disease Control，Shenzhen，Guangdong，China，518020）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of CD4+CD25+CD127-regulatory Tregulatory cell（Treg）and interleukin-12（IL-12）in the aged pulmonary tuberculosis complicated with chronic bronchitis. Methods80 cases of aged patients with active pulmonary tuberculosis complicated with chronic bronchitis were included in an observation group from January 2012 to December 2015 in the People’s Hospital of Heyuan city.80 cases with simple old chronic bronchitis and 80 healthy people from physical examination were chosen as the control group 1 and group 2，respectively.The levels of Treg cell（CD4+CD25+CD127-）ratio and peripheral blood IL-12 of the observation group were determined in 0，3 and 6 month intervals and compared with the control groups.ResultsIL-12 level of observation group was significantly lower than the control groups before treatment，the difference was statistically significant（P＜0.05），and CD4+T cells ratio in the peripheral blood is lower than the control groups（P＜0.05），meanwhile the level of Treg cells is higher than the control groups（P＜0.05）.Level of Treg cells decreased significantly and the expression of IL-12 increased after 3，6 month treatment（P＜0.05）.ConclusionExpression of Treg cells and IL-12 is associated with the aged pulmonary tuberculosis complicated with chronic bronchitis，and can be used as a indicators of differential diagnosis and clinical outcome of the disease.

［KEY WORDS］Tuberculosis；Old chronic bronchitis；CD4+CD25+CD127-regulatory T cell；Interleukin-12（IL-12）

作者單位：1.河源市人民醫(yī)院門診部，廣東，河源517000 2.深圳市慢性病防治中心門診部，廣東，深圳518020