陳志忠　李結(jié)敏　廖揚(yáng)勛　梁劍鋒　余文潮　譚曉穎　梁麗婷　黃鉅明　陸倩文　陳尚良

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某國產(chǎn)NAT試劑盒應(yīng)用于血液篩查的評價與應(yīng)用

陳志忠李結(jié)敏廖揚(yáng)勛梁劍鋒余文潮譚曉穎梁麗婷黃鉅明陸倩文陳尚良★

［摘要］目的評估、驗證某國產(chǎn)血液NAT試劑盒用于血液篩查的技術(shù)性能指標(biāo)。方法對某國產(chǎn)血液NAT試劑盒進(jìn)行了靈敏度、特異性、重復(fù)性、抗干擾能力和抗污染能力測試，并將其初步用于血液篩查。結(jié)果乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）RNA三者檢測靈敏度分別為不高于50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/mL；特異性、重復(fù)性、抗污染能力能滿足血站血液核酸檢測需求；混檢模式下，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出基本不受脂肪血顆粒的影響，但在單檢模式下會導(dǎo)致HIV RNA的漏檢，溶血對HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾。結(jié)論某國產(chǎn)NAT檢測分析系統(tǒng)的靈敏度、特異性、重復(fù)性、抗污染能力等指標(biāo)均達(dá)《血站核酸檢測質(zhì)量控制指南》要求，脂肪血、溶血樣本能明顯干擾HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA的檢出能力。

［關(guān)鍵詞］血液篩查；核酸檢測；HBV DNA；HCV RNA；HIV RNA

★通訊作者：陳尚良，E-mail：fimmu2000@163.com

為避免經(jīng)輸血傳播疾病，各國采供血機(jī)構(gòu)都對獻(xiàn)血者進(jìn)行了嚴(yán)格的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）病毒抗原或抗體檢測。但血清學(xué)檢測技術(shù)存在“窗口期”、病毒變異、免疫沉默等造成的漏檢，血液的病毒安全性問題是全球關(guān)注的焦點問題［1］。為保障輸血安全，世界各國不斷開發(fā)和引進(jìn)新的血液篩查技術(shù)［2-5］。為了進(jìn)一步保障血液安全，我們國家提出了“十二五”期末實現(xiàn)血液核酸檢測全覆蓋的目標(biāo)。然而，進(jìn)口核酸檢測（nucleic acid test，NAT）試劑成本較高，綜合考慮國家政策導(dǎo)向和自身實際情況，我們對國產(chǎn)產(chǎn)品—達(dá)安基因血液NAT試劑盒進(jìn)行了評估，并應(yīng)用于血液核酸檢測，現(xiàn)把研究報告如下。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

ChemagicSTAR核酸提取儀（HAMILTON，瑞士），ABI7500實時熒光定量PCR儀（Life Technologies，美國），核酸分離試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），核酸檢測試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），外部質(zhì)控品（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）。

1.2靈敏度試驗

按照廠家說明書要求，將外部質(zhì)控品分別稀釋至2倍檢測極限（limit of detection，LOD）、1倍LOD、0.5倍LOD，即濃度分別200 IU/mL、100 IU/ mL、50 IU/mL，單采用檢模式進(jìn)行3次檢測。檢測標(biāo)準(zhǔn)：1倍LOD處濃度應(yīng)100%檢出。

1.3特異性試驗

將8份陰性質(zhì)控品混合至一個pool檢測；將8份陽性質(zhì)控品混合至一個pool檢測，然后再進(jìn)行拆分檢測。檢測標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽性樣品應(yīng)該全部檢出。

1.4重復(fù)性試驗

將陽性質(zhì)控品每次隨機(jī)進(jìn)行混樣檢測，共檢測8次；將陰性質(zhì)控品采用單檢模式進(jìn)行8管檢測。檢測標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽性樣品應(yīng)該全部檢出。

1.5抗污染能力試驗

將8份陰性血漿樣本和8份陽性質(zhì)控品，按照一陰一陽交叉排列，進(jìn)行檢測（單檢模式）。檢測標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽性樣品應(yīng)該全部檢出。

1.6抗干擾能力試驗

將陽性質(zhì)控品（200 μL），添加至脂肪血或者溶血樣本（已確認(rèn)為陰性），制備為含相應(yīng)干擾物的陽性樣本，再進(jìn)行檢測（單檢模式）。檢測標(biāo)準(zhǔn)：陰性、陽性樣品應(yīng)該全部檢出。

1.7血液樣本NAT檢測

全血樣本進(jìn)行4項目［乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、HCV抗體（Anti-HCV）、HIV抗體（Anti-HIV）、梅毒抗體］2遍酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），全項陰性的樣本進(jìn)行NAT混樣檢測，呈反應(yīng)性的檢測pool再進(jìn)行拆分確認(rèn)試驗，檢測流程參見圖1。

2　結(jié)果

2.1靈敏度試驗

按照廠家說明書要求，將外部質(zhì)控品分別稀釋至2倍LOD、1倍LOD、0.5倍LOD，即濃度分別200 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL，進(jìn)行3次檢測（單檢模式），HBV DNA與HCV RNA在0.5倍LOD處均全部檢出，HIV RNA在1倍LOD處全部檢出，即HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者檢測靈敏度分別為50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/ mL，符合試劑說明書所描述的性能，滿足檢測要求，結(jié)果見表1。

2.2特異性試驗

將8份陰性質(zhì)控品混合至一個pool檢測，結(jié)果顯示為陰性；將8份陽性質(zhì)控品混合至一個pool檢測，結(jié)果顯示為陽性，然后再進(jìn)行拆分檢測，8管全部為陽性。

2.3重復(fù)性試驗

將陽性質(zhì)控品每次隨機(jī)進(jìn)行混樣檢測，共檢測8次，均為陽性；將陰性質(zhì)控品采用單檢模式進(jìn)行8管檢測，結(jié)果均為陰性。

表1　NAT檢測分析系統(tǒng)靈敏度試驗評價Table 1　The evaluation of sensitivity for NAT Kit

2.4抗污染能力試驗

將8份陰性血漿樣本和8份陽性質(zhì)控品按照一陰一陽交叉排列，進(jìn)行檢測（單檢模式），陰性和陽性樣本全部通過，交叉污染率為0。

2.5抗干擾能力試驗

將陽性質(zhì)控品（200 μL），添加至脂肪血或者溶血樣本（已確認(rèn)為陰性），制備為含相應(yīng)干擾物的陽性樣本，再進(jìn)行檢測（單檢模式）。結(jié)果顯示脂肪血對混檢模式下HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出均無影響，但在單檢模式下會導(dǎo)致HIV RNA的漏檢；溶血對HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾，結(jié)果見表2。

表2　干擾能力試驗Table 2　Interference ability test

2.6檢測拆分率與拆分陽性率評估

試運(yùn)行至今，共檢測樣本462份，20批次檢測，其中pool陽性2份，拆分陽性2份，均為HBV DNA陽性，拆分率和拆分陽性率分別為10%和100%，經(jīng)過全項血液篩查（ELISA法）后，HBV DNA檢出率為2/462（約4‰），結(jié)果見表3。

表3　血液NAT檢測試運(yùn)行結(jié)果Table 3　Results of Blood NAT screen at first stage

3　討論

血液及血液制劑的病毒安全性一直是輸血安全的熱點問題［1，6］。至上世紀(jì)90年代，對輸血傳播疾病的篩查完全依賴于血清學(xué)試驗，甚至今天，血清學(xué)篩查技術(shù)依然是血液篩查的重要手段。1998年德國紅十字獻(xiàn)血服務(wù)中心，將自己創(chuàng)建的NAT方法應(yīng)用于血液篩查，開啟了血液NAT新紀(jì)元。分子技術(shù)應(yīng)用于血液篩查，可將HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分別由56天、70天、22天縮短為41天、12天和11天，使輸血傳播相關(guān)病毒的風(fēng)險降到最低，更大程度地保障血液安全［7］。國外對血液NAT檢測的研究較早，積累了較多經(jīng)驗，技術(shù)也較成熟，但由于試劑成本較高等原因，一直難以在國內(nèi)全面推廣應(yīng)用［8-11］。為了貫徹實施國家衛(wèi)計委關(guān)于“十二五”實現(xiàn)血液核酸檢測全覆蓋的目標(biāo)以及響應(yīng)國家關(guān)于大型醫(yī)療裝備優(yōu)先采購國產(chǎn)產(chǎn)品的號召，我們對某國產(chǎn)品牌的血液NAT試劑盒進(jìn)行技術(shù)評價，并將其初步用于我站的血液篩查。

該國產(chǎn)品牌血液NAT試劑盒，采用混合8人份樣本進(jìn)行核酸提取，然后分別進(jìn)行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3項擴(kuò)增，最后通過實時讀取數(shù)據(jù)判斷是否具有反應(yīng)性；反應(yīng)性的pools再進(jìn)行拆分確認(rèn)試驗。為了驗證試劑盒的檢出靈敏度，我們采用外部質(zhì)控品對試劑盒進(jìn)行靈敏度進(jìn)行評價，結(jié)果顯示HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA檢測靈敏度分別為不高于50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/mL，均能達(dá)到國家相關(guān)要求。然而，與國際知名品牌相比，國產(chǎn)的試劑盒的靈敏度尚存在改進(jìn)空間。例如Roche的MPX檢測系統(tǒng)、Novarits的Tigris Ultrio Plus系統(tǒng)其HIV最低檢測限能達(dá)到不高于50 IU/mL，HBV、HCV的最低檢出限更是達(dá)到了不高于10 IU/mL的高靈敏度。

為了評估該國產(chǎn)品牌血液NAT檢測系統(tǒng)的抗污染能力，我們模擬日常工作，將強(qiáng)陽性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品按照一陰一陽交叉排列，采用單檢模式進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)展檢測試驗，結(jié)果顯示本檢測系統(tǒng)的抗污染能力滿足要求，只要操作規(guī)范，陽性樣本不會造成交叉污染導(dǎo)致樣品間或者實驗室污染。同時為了考察檢測系統(tǒng)的特異性，我們按前述樣本的排序，分別采用混檢和單檢模式進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)展檢測試驗，其實驗結(jié)果也與預(yù)期相符合，顯示了較好的特異性。

樣本的質(zhì)量是檢測結(jié)果的關(guān)鍵保證。在臨床檢測中，可以通過對患者下醫(yī)囑等措施，實施樣本采集前的質(zhì)量控制，而且不合符質(zhì)量控制要求的樣本，可以重新進(jìn)行樣本采集。相比之下，無償獻(xiàn)血行為大多為自發(fā)性行為，樣本采集難以做到很好的采集前質(zhì)量控制；同時考慮到血液制劑樣本朔源性等問題，對于脂肪血顆粒較多等不符合NAT檢測要求的樣本，也不可能仿效臨床檢測進(jìn)行重新采樣。因此，我們對血液篩查樣本中最常見的脂肪顆粒、輕度溶血等不合符要求的樣本進(jìn)行抗干擾試驗。我們的測試結(jié)果顯示：混檢模式下，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出基本不受脂肪血顆粒的影響，但在單檢模式下會導(dǎo)致HIV RNA的漏檢；溶血對HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾。基于上述結(jié)果以及血液檢測工作的特點，提示我們在實際工作中，應(yīng)該盡量避免溶血樣本，對于難以避免的脂肪血樣本，應(yīng)該評估脂肪顆粒的嚴(yán)重程度，謹(jǐn)慎對待其核酸檢測陰性結(jié)果。

通過前述的技術(shù)指標(biāo)評估，我們認(rèn)為該國產(chǎn)品牌血液NAT試劑盒能滿足我們對血液篩查的技術(shù)要求，因此試將其用于我站的血液篩查。參考兄弟單位的做法以及廠家的推薦意見，我們初步擬定按照圖1的流程進(jìn)行篩查。試運(yùn)行期間，共檢測樣本462份，20批次檢測，其中pool陽性2份，拆分陽性2份，拆分率和拆分陽性率分別為10%和 100%。2份陽性樣本均為HBV DNA陽性，為了進(jìn)一步確認(rèn)獻(xiàn)血者感染狀況，我們追蹤獻(xiàn)血者重新采樣進(jìn)行檢測，但由于各種原因，僅成功召回1號獻(xiàn)血者，采用HBV DNA定量檢測系統(tǒng)，能檢測到其體內(nèi)存在低拷貝HBV DNA，同時其e抗原也為陽性，定義為隱匿性HBV感染（occult HBV infection，OBI）感染。以已經(jīng)確認(rèn)的數(shù)據(jù)來計算，經(jīng)過ELISA過篩后，我們的HBV DNA檢出率為1/462；如果以2例陽性來計算，HBV DNA檢出率為2/462，與國內(nèi)報道大體相近［12-16］，但遠(yuǎn)高于國外的參與風(fēng)險［17］。當(dāng)然，我們試運(yùn)行期間所取得的數(shù)據(jù)為小樣本，更多的檢測效能驗證有待后續(xù)開展，但毫無置疑的是，應(yīng)用該國產(chǎn)品牌NAT試劑于血液篩查，將進(jìn)一步提升血液安全特別是HBV病毒性安全。

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·綜述·

Evaluation and application of a domestic NAT kit used for blood screening

CHEN Zhizhong，LI Jiemin，LIAO Yangxun，LIANG Jianfeng，YU Wenchao，TANG Xiaoying，LIANG Liting，HUANG Juming，LU Qianwen，CHEN Shangliang★
（Zhaoqing Blood Center，Zhaoqing，Guangdong，China，526020）

［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the capability of a domestic blood screening NAT kit. MethodsThe sensitivity，specificity，repeatability，anti-interference ability，and anti-pollution ability of the kit were analyzed.ResultsThe sensitivity of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA detection were not more than 50 IU/mL，50 IU/mL and 100 IU/mL respectively，and specificity，repeatability，anti-pollution ability met the demands for blood nucleic acid test.There was no interference due to fat particles in the analyses of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA in mini pool of 8 samples model，but HIV RNA was not detected in ID-NAT model due to fat particles.The detection of those 3 marks was interfered with by hemolysis. ConclusionsThe sensitivity，specificity，repeatability，anti-interference ability and anti-pollution ability of the kit could meet the demands for blood screen，but the interference from fat particles or hemolysis is a concern for the detection capability for HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA.

［KEY WORDS］Blood screening；Nucleic acid test；HBV DNA；HCV RNA；HIV RNA

基金項目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項目（A2015238）；肇慶市科技創(chuàng)新計劃（2014E1814）

作者單位：肇慶市中心血站，廣東，肇慶526020