劉雪梅　駱子義

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Gilbert綜合征及Crigler-Najjar綜合征診斷方法

劉雪梅駱子義★

［摘要］先天性高非結(jié)合膽紅素血癥包括Gilbert綜合征（Gilbert syndrome，GS）和Crigler-Najjar綜合征（Crigler-Najjar syndrome，CNS），目前研究表明其發(fā)病機制是尿甘二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1 （UDP-glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1）基因多態(tài)性導(dǎo)致酶的缺乏或活性降低，導(dǎo)致膽紅素代謝障礙。GS和CNS的診斷依賴UGT1A1的基因突變位點檢出。分子診斷是基因診斷的重要方式。本文就UGT1A1基因檢出方法研究進展作一綜述。

［關(guān)鍵詞］Gilbert綜合征；Crigler-Najjar綜合征；UGT1A1；基因診斷；基因多態(tài)性

★通訊作者：駱子義，E-mail：13501569621@163.com

Gilbert綜合征（Gilbert syndrome，GS）1901年最先被Gilbert和Lereboulet［1］報道，是一種具有家族性的先天性血清高膽紅素血癥，其血清總膽紅素水平為（1～6）mg/dL［（17.1～102.6）μmol/L］。Bosma等［2］報道GS的發(fā)病率為3%～7%，其在任何年齡均可發(fā)病，以男性多見。Crigler-Najjar綜合征（Crigler-Najjar syndrome，CNS）在1952年被Crigler和Najjar［3］報道，多見于新生兒，但其發(fā)病率極低，在100萬新生兒中約有1例［4］。1962年Arias等［5-6］提出CNS實際可以分為2型，即CNS-I［血清總膽紅素水平為（30～50）mg/dL（513～855）μmol/L］和CNS-II［血清總膽紅素水平為（6～20）mg/dL （102.6～342）μmol/L］。GS和CNS是未結(jié)合型高膽紅素血癥的2種表現(xiàn)形式，目前研究認為，尿甘二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（UDP-glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1）基因多態(tài)性對其發(fā)病有顯著影響。UGT1A1存在多態(tài)性導(dǎo)致酶的缺乏或活性降低，從而導(dǎo)致膽紅素代謝障礙［7］。而多種藥物亦有抑制UGT1A1活性的作用［8］，若用藥過程同時存在UGT1A1多態(tài)導(dǎo)致酶活性降低，則有用藥安全隱患。一直以來，GS作為一種良性疾病，并不需要特殊相關(guān)治療，而重點在于確立診斷并與其他原因引起的肝臟損害性疾病區(qū)分開來，為臨床用藥和遺傳咨詢作出積極參考，因此GS的診斷是臨床研究的重要內(nèi)容。本文就GS的診斷研究進展作如下綜述。

1　UGT1A1多態(tài)性

UGT1A1基因在1991年被首次克?。?］，GS、CNS-Ⅰ及CNS-Ⅱ中有大量突變點，目前被報道的UGT1A1基因突變有130種［10］，有91種為單核苷酸替換突變，21種為單核苷酸缺失，10種為單核苷酸插入，其余8種表現(xiàn)為基因啟動子和內(nèi)含子中。多數(shù)GS患者突變在啟動子、增強子及編碼區(qū)，UGT1A1酶的活性低于正常的30%［11］；大多數(shù)CNS-Ⅱ患者存在純合子錯義突變和多位點復(fù)合突變，導(dǎo)致酶的活性低于正常酶活性的10%［12］；而CNS-Ⅰ患者UGT1A1酶的活性則完全缺失。

2　基因診斷方式研究

2.1基因組直接測序

DNA測序是GS及CNS診斷的金標準，有直接測序和間接測序。直接測序是基因測序中最常用的方法，選取需要檢測的突變位點，根據(jù)UGT1A1多態(tài)性設(shè)計引物，提取全血基因組，以DNA為模板進行PCR擴增后直接測序［13］。目前基因組測序主要有第二代測序技術(shù)及第三代測序技術(shù)。第二代測序技術(shù)的基本原理是邊合成邊測序，通過捕捉新合成的末端標記來確定DNA序列；第三代測序技術(shù)主要有分子熒光測序及納米孔測序，與第二代相比，測序速度及精確度更高，不但可以直接測序DNA，還可以測序甲基化的DNA。基因測序方法雖可準確檢測出突變位點，明確診斷，但操作費時、測序機器昂貴、耗費大、效率低，不適于大規(guī)模臨床診斷應(yīng)用。

2.2基因間接測序

此法主要有變性高效液相色譜（denaturing high performance liguld chromatography，DHPLC），變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gelelectrophresis，DGGE）、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（polymerase chian reaction-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）［14］。DHPLC的原理：在控制升高溫度的條件下，部分解鏈及解鏈的DNA會有不同的性質(zhì)，雜合子個體的DNA經(jīng)PCR擴增后產(chǎn)生異源雙鏈，純合子DNA則產(chǎn)生同源雙鏈。但二者解鏈特征不同，在變性溫度下，異源雙鏈較同源更易解鏈形成Y型結(jié)構(gòu)，而在洗脫溫度時，單鏈片段分子的負電荷與雙鏈相比較少，故更早洗脫。由于異源雙鏈PCR產(chǎn)物比同源雙鏈含有更高的單鏈的比例，保留時間更短，因此異源雙鏈較同源雙鏈較早洗脫。突變的樣品呈異源及同源雙鏈混合物的峰型特點，未突變者則只有同源雙鏈峰型特點。此技術(shù)的關(guān)鍵在于解鏈溫度的控制及色譜柱的分離性能，其不但可以檢測已知突變，還可檢測未知突變。且與其他傳統(tǒng)的雜合雙鏈分析技術(shù)相比，耗時較短，自動化提高，可在幾分鐘內(nèi)分析一個樣品，無需使用凝膠劑放射性同位素；但其劣勢在于高效液相色譜儀器價格昂貴［15］。PCR-SSCP的原理是：根據(jù)DNA序列設(shè)計相應(yīng)引物，用PCR擴增靶向序列后將擴增片段變性為單鏈，由于單鏈DNA在中性條件下根據(jù)其堿基不同自身會折疊成不同的具有一定的空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，因此，相同長度的單鏈DNA所形成的構(gòu)象不同，遷移率也不同。在此基礎(chǔ)上，被PCR擴增變性為單鏈DNA的片段在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，由于產(chǎn)物DNA含單個堿基置換、插入或缺失，會發(fā)生遷移率的改變，從而影響電泳的位置改變，區(qū)分出變異DNA與正常的DNA，以此檢測微小到一個基因突變的差異。此法是比較靈敏的檢測技術(shù)，但研究認為，此方法在RNA的檢出率明顯高于DNA，原因可能是DNA次級結(jié)構(gòu)較相對RNA穩(wěn)定，可變性較小，若發(fā)生突變，構(gòu)象變化也較小，導(dǎo)致遷移率改變不明顯［16］。DGGE的原理主要是基于突變型和野生型核酸序列的不同而導(dǎo)致其變性濃度的差異，在聚丙烯酰氨凝膠電泳的基礎(chǔ)上加變性劑尿素或甲酰胺等區(qū)分同樣長度的DNA片段，此方法最初是用來檢測點突變。不同的DNA片段堿基組成差異導(dǎo)致其解鏈濃度不同，其中主要是GC堿基的含量影響DNA雙鏈的解鏈區(qū)域及解鏈行為。當變性濃度達到最低的解鏈區(qū)域時，該區(qū)域的序列解鏈，解鏈部分的DNA片段在凝膠中的遷移率會急劇下降。同樣長度的DNA片段序列不同，其在凝膠中達到最低解鏈濃度的位置也不同，因此可以被區(qū)分出來。本技術(shù)經(jīng)過發(fā)展，已衍生出溫度梯度凝膠電泳、恒定變性凝膠電泳、瞬時溫度梯度電泳等改良技術(shù)［17］。這種方法和PCR技術(shù)相結(jié)合被廣泛應(yīng)用于各種突變分析。澳洲學(xué)者［18］利用雙變性梯度凝膠電泳檢測Gilbert綜合征患者DNA樣本，可以快速檢測出TA插入異常，并能區(qū)分出TA雜合子和TA純合子。以上方法均是對基因組進行初步篩選后，對陽性標本進行測序，相比直接測序而言耗費較少，操作也較簡化，但總體來說，用于大量標本檢測仍較耗時。

2.3基因芯片技術(shù)

本技術(shù)的基本原理是雜交原理，將探針固定在芯片預(yù)先設(shè)定的區(qū)域內(nèi)，形成DNA微隊列，PCR擴增后的片段產(chǎn)物與芯片通過堿基配對原理進行雜交。反應(yīng)結(jié)果用化學(xué)熒光、化學(xué)發(fā)光或同位素法標記，通過檢測雜交信號的強弱并進行計算機分析，從而檢測對應(yīng)片段或某個位點的等位基因是否存在，以發(fā)現(xiàn)單核苷酸的插入、缺失、變換等?；蛐酒园l(fā)展以來，多用于掃描全基因組、基因功能的研究和疾病臨床檢測及診斷等多方面。有研究把基因芯片中加入特異性探針對108例GS患者的UGT1A1啟動子進行分析，成功識別其常見及罕見突變點，基因測序結(jié)果證實其準確率達100%［19］。基因芯片技術(shù)具有靈敏、準確、高通量及高自動化等優(yōu)點，是比較可靠而有前途的基因診斷技術(shù)，但其芯片制作成本昂貴、技術(shù)復(fù)雜，重復(fù)性差、分析范圍狹窄等缺點尚需改革。

2.4內(nèi)切酶酶切技術(shù)

在UGT1A1的診斷中用到的主要是聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymersae chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)，PCR-RFLP的基本原理是：用PCR擴增目標DNA序列，然后用限制性內(nèi)切酶酶切目的片段，內(nèi)切酶識別并切割相應(yīng)的序列片段，酶切產(chǎn)物進行電泳，根據(jù)對比酶切圖譜及片段多樣性特點，分析不同基因序列差異，不同的等位基因酶切位點不同，酶切產(chǎn)物電泳條帶也不同。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)操作簡單，基因分型的時間較短，目的DNA的含量和相對特異性都大大提高。有學(xué)者［20］提出用此檢測UGT1A1基因編碼的外顯子1的突變點211G＞A，準確性高，且與RFLP相比，以擴增替代了酶切，不需要克隆基因作探針，不依賴Southern blot技術(shù)，避免了RFLP繁瑣的DNA酶切、轉(zhuǎn)移、雜交等步驟。本項技術(shù)進過改良，可以同過添加創(chuàng)造酶切位點來提高酶切準確性，但其缺點是酶切位點的選擇較復(fù)雜、缺乏效率，且可能會由于酶切不完全等原因出現(xiàn)假陽性結(jié)果，多重酶切分析難度增加，難以實現(xiàn)高通量檢測。

2.5實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）技術(shù)

本項技術(shù)以熒光共振能量傳遞（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）為基礎(chǔ)，包括探針類和非探針類，探針類特異性較高，是基因突變檢測的常用類型，探針類型中最常用的是TaqMan探針，TaqMan探針屬于一種寡核苷酸探針，其序列只有一個堿基的差異，探針設(shè)計為與目的序列上下游引物之間的堿基配對，根據(jù)熒光探針的雜交原理，將目的DNA進行PCR擴增。探針完整時，熒光基團與淬滅基團分別在探針5′末端和3′末端，淬滅基團吸收熒光，故不會有熒光發(fā)出；PCR擴增時，產(chǎn)物與探針相結(jié)合，Taq外切酶活性將探針酶切降解，隨著熒光基團和淬滅劑分離，熒光基團在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光，PCR擴增與熒光信號累積完全同步，故熒光強度越高，擴增產(chǎn)物的數(shù)量越多，可在優(yōu)化體系的條件下使用多重熒光定量PCR。此技術(shù)的優(yōu)點在于簡便、準確、快速及污染小、無需DNA測序，并可實現(xiàn)大通量檢測。而缺點在于此法是對已知基因突變的檢測，引物及探針的設(shè)計都要依據(jù)已知DNA序列而定，目前已知UGT1A1基因的突變位點有130個之多，而探針價格昂貴，臨床中只能選擇常見突變點做檢測，在診斷時易忽略其他突變位點可能對檢測目標水平的影響，且所設(shè)計的探針僅有一個堿基的差異，檢測結(jié)果不能排除假陽性可能。

2.6高分辨率熔解曲線（high resolution melting curve，HRM）分析技術(shù)

HRM技術(shù)是近年來國內(nèi)外最新的分子診斷研究工具，其概念早在上世紀70年代提出［21］，是根據(jù)DNA特征性熔解曲線來研究DNA特征而發(fā)展起來的研究方法。此方法多為非探針標記，非探針標記的HRM是用特定的熒光染料插入DNA雙鏈中［22］，DNA熔解曲線的變化取決于擴增子序列的特異性，依據(jù)序列GC含量不同和堿基互補差異，在PCR升溫過程中，雙鏈DNA不互補的位點會先解鏈，熒光染料從解鏈的DNA上釋放出來，隨著PCR的擴增，可以通過熒光強度和時間曲線與標準品的比較來分辨是否有基因突變。其特點是無需設(shè)計使用特異性探針，只要設(shè)計一對相應(yīng)引物就可以分析等位基因的突變，同時HRM檢測不受堿基位點和種類的局限，因此，對已知突變和未知突變都能進行篩查分析。有研究者［22］用HRM技術(shù)對110名健康受試者全血提取DNA后進行UGT1A1啟動子和11個外顯子篩選，結(jié)果不僅確定了5個已知的變種的UGT1A1，還識別出8個未知的序列變異，并與基因組直接測序結(jié)果完全相符。也有人［23］用本技術(shù)有效診斷GS的TATA盒變異。此技術(shù)對診斷GS的UGT1A1突變，特別是TATA盒及G211A位點突變敏感性及特異性良好，有相當于直接測序的準確性，適用于亞洲人Gilbert綜合征的診斷［24］。此外，HRM已廣泛用于臨床病毒耐藥或細菌基因突變的掃描及發(fā)現(xiàn)［25］、基因序列匹配［26］、甲基化篩查［27］、基因分型［28］等各個方面，技術(shù)水平越來越成熟。雖然HRM對目的片段長度有限制，對溫度均一性及儀器精密度要求較高，使結(jié)果不夠穩(wěn)定，但隨著儀器和熒光染料的不斷改良，以及本項技術(shù)不斷進步，與其他技術(shù)聯(lián)合使用亦是未來發(fā)展趨勢。有研究表明通過與實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，可提高其精確性和穩(wěn)定性［25］。目前各方面的研究表明，HRM具有靈敏度高、特異性強、簡單快速、高效、成本低廉、高通量、閉管操作、無PCR反應(yīng)后電泳、測序等后續(xù)處理等優(yōu)點，有望成為臨床基因分子診斷常規(guī)檢查技術(shù)。

3　結(jié)語與展望

GS和CNS作為一種常染色體隱性遺傳性疾病，肝臟無器質(zhì)性病變，以血清非結(jié)合型膽紅素間歇性升高為主，臨床一般表現(xiàn)為皮膚鞏膜黃染、上腹部不適等消化道癥狀。血清膽紅素達GS或CNS的診斷水平值，排除肝炎等明確因素及其他遺傳性疾病，結(jié)合基因突變位點的檢出，苯巴比妥治療有效等可作出臨床診斷。由于經(jīng)濟條件的限制，基因突變的檢出較難施行，臨床常依靠苯巴比妥試驗、利福平試驗、肝組織活檢等來協(xié)助診斷，不能完全確診。目前基因診斷方式或因操作繁雜、效率低，或因試劑、機器價格昂貴，阻礙了臨床有效應(yīng)用。因此，隨著基因分子診斷研究進步，新的高靈敏高特異性、簡單快速、低成本、自動化、可大量施行的檢測方式亟待開發(fā)。

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Diagnostic methods in Gilbert and Crigler-Najjar syndromes

LIUXuemei，LUOZiyi★
（Department of Digestive Disease，the Third People’s Hospital affiliated to of Guangdong Medical College，Shenzhen，Guangdong，China，518020）

［ABSTRACT］Congenital unconjugated hyperbilirubinemias include Gilbert syndrome（GS）and Crigler-Najjar syndrome（CNS）.The present study indicates that the pathogenesis of the disease is the gene polymorphism of UDP-glucuronosyl transferase 1A1 gene（UGT1A1）leading to absence or lack of enzymatic activity，resulting in bilirubin metabolism disorders.Diagnosis of GS and CNS depend on the detection of UGT1A1 gene mutations.In this article，the progress of UGT1A1 gene detection methods will be reviewed.

［KEY WORDS］Gilbert syndrome（GS）；Crigler-Najjar syndrome（CNS）；UGT1A1；Gene diagnosis；Gene polymorphism

作者單位：廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東，深圳518020