楊勇　孫偉　李崢嶸　王丹

?

2014年廣州新塘地區(qū)手足口病病原體基因檢測(cè)結(jié)果分析

楊勇1★孫偉2李崢嶸3王丹1

［摘要］目的了解2014年廣州新塘地區(qū)手足口病病原體分布情況。方法采用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法對(duì)臨床診斷為手足口病的患兒進(jìn)行柯薩奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CoxA16）、腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）及腸道病毒（enterovirus，EV）基因檢測(cè)。結(jié)果病毒核酸陽性率為28.48%（1 225/4 301），其中CoxA16 占20.73%（254/1 225），EV71占23.51%（288/1 225），EV占55.76%（683/1 225）。5月份就診患兒最多，占22.20%（955/4 301）；5歲以下的患兒占89.98%（3 870/4 301），男孩與女孩比例為1.62∶1。結(jié)論2014年廣州新塘地區(qū)手足口病病原體以EV為主，其次是EV71，主要分布于5歲以下兒童，5月份就診患兒最多，男孩多于女孩。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法在手足口病病原體檢測(cè)中具有靈敏度高、簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果客觀等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)手足口病的臨床早期診斷、治療及預(yù)防、控制具有重要意義，臨床可推廣、應(yīng)用。

［關(guān)鍵詞］手足口??；柯薩奇病毒A組16型；腸道病毒71型；腸道病毒；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

★通訊作者：楊勇，E-mail：yangyong1993@126.com

手足口病（hand-foot and mouth disease，HFMD）臨床主要癥狀常表現(xiàn)為手、足、口腔等部位的斑丘疹、皰疹；多數(shù)呈良性過程，可治愈，少數(shù)可再發(fā)，但須高度警惕極少數(shù)中樞感染重癥病例，預(yù)后差［1］?？滤_奇病毒A16型病毒（coxsackievirus A16，CoxA16）為本病常見的病原微生物，腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和其他柯薩奇病毒（如A5、A7、A9、A10、B3、B5）也可引起［2］。近年來，各地報(bào)告的病例數(shù)迅速增加，手足口病已成為重要的公共衛(wèi)生問題。為了解廣州新塘地區(qū)手足口病病原體分布情況，本文對(duì)2014年1月1日至2014年12月30日到我院兒科門診及皮膚科門診就診臨床診斷為手足口病患兒進(jìn)行柯薩奇病毒A16型（CoxA16）、腸道病毒71型（EV71）及腸道病毒（enterovirus，EV）基因檢測(cè)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，為當(dāng)?shù)厥肿憧诓〉脑缙谂R床診斷、治療和預(yù)防、監(jiān)測(cè)、控制提供一定的參考。

1　資料與方法

1.1檢測(cè)對(duì)象及診斷標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)象為2014年1月1日至2014年12月30日在我院兒科及皮膚科就診臨床診斷為手足口病的患兒，年齡范圍2個(gè)月～8歲，平均年齡2.9歲，男孩2 661例，女孩1 640例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)衛(wèi)生部制訂的《手足口病診療指南》（2010年版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。鑒于重癥病例均轉(zhuǎn)上級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院，因此不在本研究范圍中。

1.2取材方法

采集患兒發(fā)病3天內(nèi)的咽拭子樣本，用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，避免觸及舌部及注意無菌操作。迅速將取材棉拭子置于采樣管中，密閉。采集后的標(biāo)本立即送檢，不能立即檢測(cè)的標(biāo)本置于-20℃保存。

1.3儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用儀器為DA7600基因擴(kuò)增儀。采用廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的柯薩奇病毒A16型核酸檢測(cè)試劑盒、腸道病毒71型核酸檢測(cè)試劑盒、腸道病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)。核酸檢測(cè)試劑盒以CoxA16、EV71、EV基因組編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，通過一步法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增對(duì)CoxA16 RNA、EV71 RNA、EV RNA進(jìn)行定性檢測(cè)。3個(gè)試劑盒所用引物及熒光探針序列信息見表1。

表1　3個(gè)試劑盒所用引物及熒光探針序列信息Table 1　Primers and fluorescent probe sequence information for 3 kits

1.4樣本處理與RNA提取

向無菌管中加入5 mL保存液，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子；充分振蕩后離心，去掉部分上層液體直至剩余100 μL，吸打混勻放置于1.5 mL滅菌離心管，加入200 μL Trizol試劑及100 μL氯仿，用振蕩器強(qiáng)力振蕩20 s后靜置3 min，然后12 000 rpm離心2 min；小心吸取無色上層液體，轉(zhuǎn)移至新滅菌的1.5 mL離心管，然后加入10 μL RNA提取液A（充分混勻后吸取），再用振蕩器充分混勻，8 000 rpm離心1 min后，小心棄去所有液體；加人溶液C 400 μL，充分振蕩混勻，8 000 rpm離心l min，盡可能將液體去除干凈；將裝有沉淀的離心管于加熱器中，60℃干燥5 min，待沉淀物完全烤干，然后加入30 μL DEPC H2O，吸打混勻管中沉淀，得到白色的懸濁液，可直接用于檢測(cè)。

1.5PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系：RT-PCR反應(yīng)液15 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL、Taq酶3 μL；上述PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、待測(cè)樣品混濁液、陽性質(zhì)控品各5 μL，3 000 rpm離心30 s，放入PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)條件：40℃ 25 min，1個(gè)循環(huán)；94℃3 min，1個(gè)循環(huán)；93℃ 15 s，55℃45 s，40個(gè)循環(huán)。

1.6試驗(yàn)結(jié)果的判定

每次試驗(yàn)均檢測(cè)陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品，滿足質(zhì)量控制要求時(shí)才進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判定。陰性質(zhì)控品：無典型S型擴(kuò)增曲線或無Ct值。陽性質(zhì)控品：呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤30。陰性檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：無典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值＞35.1。陽性檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增曲線呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤35.1。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1熒光定性RT-PCR檢測(cè)曲線圖

陽性檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)增曲線呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤35.1。陰性檢測(cè)結(jié)果無典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值＞35.1（圖1）。

2.22014年廣州新塘地區(qū)各月份及季節(jié)CoxA16、EV71、EV檢測(cè)結(jié)果

2014年共收集標(biāo)本4 301例，病毒核酸陽性率為28.48%（1 225/4 301），其中CoxA16占20.73% （254/1 225），EV71占23.51%（288/1 225），EV占55.76%（683/1 225）；5月份的就診患兒最多占22.20%（955/4 301）。春夏兩季就診患兒較多共計(jì)3 372例，秋冬兩季就診患兒較少共計(jì)929例。CoxA16在不同季節(jié)流行情況的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.20，P＜0.05），其中以春夏兩季最高；EV71在不同季節(jié)流行情況的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.26，P＜0.05），其中以春夏兩季最高；EV在不同季節(jié)流行情況的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.49，P＞0.05）。具體結(jié)果見表2、表3。

2.3手足口病不同性別感染情況

男孩2 611例，女孩1 640例，男孩多于女孩，男孩與女孩比例為1.62∶1。男孩陽性率為29.95% （797/2 661），女孩陽性率26.10%（428/1 640），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.40，P＜0.05）。CoxA16陽性率男孩與女孩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.07，P＞0.05），EV71陽性率男孩與女孩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.05，P＞0.05），EV陽性率男孩與女孩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.34，P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表2　2014年廣州新塘地區(qū)各月份CoxA16、EV71、EV檢測(cè)結(jié)果Table 2　The results of CoxA16、EV71 and EV during 2014 in Xintang，Guangzhou

表3　2014年廣州新塘地區(qū)各季節(jié)CoxA16、EV71、EV檢測(cè)結(jié)果Table 3　The results of CoxA16、EV71 and EV in different seasons during 2014 in Xintang，Guangzhou

表4　手足口病不同性別感染情況Table 4　The different sexes infection of HFMD

2.4手足口病不同年齡段分布情況

按照手足口病患兒的年齡（0～1、1～5、5～）進(jìn)行分組，在CoxA16病毒感染組中不同年齡組發(fā)病構(gòu)成由低到高依次為0～1（1.85%）、5～（1.86%）、1～5 （7.87%），χ2=61.75，P＜0.05；在EV71病毒感染組中不同年齡組發(fā)病構(gòu)成由低到高依次為0～1（2.16%）、5～（2.78%）、1～5（8.81%），χ2=63.31，P＜0.05；在EV病毒感染組中不同年齡組發(fā)病構(gòu)成由低到高依次為5～（6.50%）、1～5（15.47%）、0～1（21.25%），χ2= 49.82，P＜0.05。1歲以下患兒974例，1歲至5歲患兒2 896例，5歲以上患兒431例；5歲以下患兒3 870例，占89.98%（3 870/4 301）。結(jié)果見表5。

表5　手足口病不同年齡段分布情況Table 5　The distribution of different ages of HFMD

3　討論

手足口病于1957年新西蘭首次報(bào)道，1958年分離出該病的常見病原體之一柯薩奇病毒A組16型，1959年被正式命名為手足口病，是一種全球性的兒童常見傳染病之一。我國(guó)在2008年5月2日將該病作為第38種傳染病列入《傳染病防治法》按丙類傳染病進(jìn)行管理。

本次對(duì)廣州新塘地區(qū)4 301例手足口病病原體進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)手足口病病原體病毒核酸檢出率28.48%，其中CoxA16占20.73%，EV71占23.51%，EV占55.76%。EV71感染率略高于Cox16，以EV感染為主，這與近年來國(guó)內(nèi)［4］國(guó)外［5-8］的資料相一致，提示在今后的臨床工作中不能僅檢測(cè)CoxA16和EV71，有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該開展其他腸道病毒的檢測(cè)，以避免漏診誤診的發(fā)生。疾病主要分布于5歲以下兒童，所以應(yīng)該重視5歲以下兒童手足口病病毒檢測(cè)和分型，可對(duì)進(jìn)行疾病的早期診斷及治療，有利于防止疾病的進(jìn)一步惡化，能較好避免手足口病在本地區(qū)的流行爆發(fā)。男孩多于女孩（這可能與男孩生性好動(dòng)活潑，與外界接觸的途徑較多有關(guān)）比例為1.62∶1，與馬占忠等［9］報(bào)道較接近?；純簲?shù)從3月份開始增多，5月份最多，4～6月為高峰，春夏兩季就診患兒比秋冬兩季就診患兒多，9月份以后才開始逐漸下降，分析原因可能與人群聚集、氣溫波動(dòng)較大、陰雨天氣增加有關(guān)，與邱惠芳等［10］、楊興林等［11］報(bào)道相一致。其中重型病例按衛(wèi)生主管部門要求均轉(zhuǎn)上級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院治療。

目前檢測(cè)手足口病病原體有病毒分離、抗體檢測(cè)和核酸檢測(cè)等方法。病毒分離該法需時(shí)間長(zhǎng)、耗費(fèi)多，對(duì)標(biāo)本的運(yùn)送、保存等技術(shù)條件要求相當(dāng)高，只能在極少數(shù)大型的醫(yī)學(xué)研究中心應(yīng)用，絕大部分醫(yī)院不能開展，目前僅用于研究；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)抗體經(jīng)濟(jì)快速，但由于病毒感染到抗體出現(xiàn)需要一段時(shí)間，且需要急性期與恢復(fù)期雙份血清，用于疾病的早期診斷靈敏度不高［12］。RT-RCR利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，是一種相對(duì)比較簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、定性準(zhǔn)確、結(jié)果判斷更為客觀等優(yōu)點(diǎn)，能及時(shí)檢測(cè)手足口病病原體的特異性核酸，可滿足疾病流行期間及時(shí)處理大量樣本的需要，為手足口病的早期臨床診斷、治療和預(yù)防、監(jiān)測(cè)、控制提供重要參考，具有良好的臨床推廣應(yīng)用前景。

由于手足口病至今疫苗尚未研究成功，積極開展手足口病病原檢測(cè)，提高早期病原學(xué)檢測(cè)水平，有住于明確病原體不同時(shí)期分布特征及流行趨勢(shì)，幫助本地區(qū)進(jìn)行有針對(duì)性的控制預(yù)防。在手足口病流行季節(jié)，須加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)，重點(diǎn)在外來人群聚集區(qū)及托幼機(jī)構(gòu)。對(duì)家長(zhǎng)、幼兒園等托幼機(jī)構(gòu)進(jìn)行廣泛有效的衛(wèi)生知識(shí)宣傳，早期發(fā)現(xiàn)、隔離患兒，幫助兒童養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣，以減少手足口病的發(fā)生與流行。

參考文獻(xiàn)

［1］吳志華.臨床皮膚性病學(xué)第1版［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2011：187.

［2］張學(xué)軍，陸洪光，高興華.皮膚性病學(xué)第8版［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：70-71.

［3］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.手足口病診療指南（2010年版）［EB/OL］.http：//www.moh.gov.en/publicfiles/ business/htmlfiles/mohyzs/83586/201004/46884.htm，2010-04-21/2015-12-31.

［4］顧紅巖，劉志達(dá)，張玲，等.2013年北京地區(qū)手足口病住院患兒的病原分布及臨床特點(diǎn)［J］.中華兒科雜志，2015，53（6）：459-463.

［5］BrachoMA，González-Candelas F，ValeroA，et al.Enterovirus co-infections and onychomadesis after hand，foot，and mouth disease，Spain，2008［J］.Emerg Infect Dis，2011，17（12）：2223-2231.

［6］Feder HM，Bennett N，Modlin JF.Atypical hand，foot，and mouth disease：a vesiculobullous eruption caused by Coxsackie virus A6［J］.Lancet Infect Dis，2014，14（1）：83-86.

［7］Fujimoto T，Iizuka S，Enomoto M，et al.Hand，foot，and mouth disease caused by coxsackievirus A6，Japan，2011［J］.Emerg Infect Dis，2012，18（2）：337-339.

［8］Puenpa J，Chieochansin T，Linsuwanon P，et al. Hand，foot，and mouth disease caused by coxsackievirus A6，Thailand，2012［J］.Emerg Infect Dis，2013，19（4）：641-643.

［9］馬占忠，黃文波，何鳳屏，等.韶關(guān)市1190例手足口病病原體檢測(cè)結(jié)果分析［J］.分子診斷與治療雜志，2013，5（1）：30-31.

［10］ 邱惠芳，劉丹，劉青，等.浦東新區(qū)2012年手足口病檢測(cè)結(jié)果分析［J］.海軍醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（3）：176-178.

［11］ 楊興林，李麗，熊金鳳，等.2011年貴陽地區(qū)手足口病病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28 （12）：2081-2082.

［12］ 喬鳳嬌，劉紅，劉漢芬.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)手足口病EV71與CA16病毒核酸［J］.中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)，2011，10（3）：253.

Analysis on the gene detection results of hand-foot and mouth disease in the Guangzhou Xingtang area in 2014

YANG Yong1★，SUN Wei2，LI Zhengrong3，WANG Dan1
（1.Department of Dermatology，Hydropower Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，511340；2.Department of Clinical Laboratory，Hydropower Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，511340；3.Department of Paediatrics，Hydropower Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，511340）

［ABSTRACT］ObjectiveTo find out the distribution of hand-foot and mouth disease（HFMD）pathogens in the Guangzhou Xintang area in 2014.MethodsReverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to detect coxsackievirus A16（CoxA16），enterovirus 71（EV71）and enterovirus （EV）with HFMD.ResultsThe positive rate of the viral nucleic acid was 28.48%（1 225/4 301），CoxA16 accounted for 20.73%（254/1 225），EV71 accounted for 23.51%（288/1 225），EV accounted for 55.76%（683/1 225）.The peak of HFMD infection ratio was 22.20%（955/4 301）in May.Children under 5 years old accounted for 89.98%（3 870/4 301），the proportion of boys and girls was 1.62∶1.Conclusion EV was the major pathogen in the Guangzhou Xintang area in 2014，followed by EV71.The peak of HFMD was in May，mainly in children under the age of 5，and more prevalent in boys than girls.Real-time PCR can be used for pathogenic diagnosis of HFMD with the features of high sensitivity，simplicity，and efficiency，all of which play important roles in the early clinical diagnosis，treatment，prevention and control.

［KEY WORDS］Hand-foot and mouth disease；Coxsackie virus A16；Enterovirus 71；Enterovirus；Reverse transcription-polymerase chain reaction

作者單位：1.廣東省水電醫(yī)院皮膚科，廣東，廣州511340 2.廣東省水電醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東，廣州511340 3.廣東省水電醫(yī)院兒科，廣東，廣州511340