武　順，閆寅卓，韓興林，王德良（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

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響應面優(yōu)化細菌產吡嗪類工藝

武順，閆寅卓，韓興林，王德良
（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

摘要：對細菌產吡嗪類化合物的工藝進行研究。以從酒曲中篩選的細菌出發(fā)，考察不同因素對細菌產吡嗪的影響。采用單因素實驗和響應面法對影響細菌產吡嗪的4個主要影響因素即葡萄糖、搖床轉速、時間和裝液量進行分析優(yōu)化。結果表明，影響細菌產吡嗪的工藝因素按主次順序排列為葡萄糖＞轉速＞時間＞裝液量；確定細菌產吡嗪的最佳工藝條件為葡萄糖70 g/L、轉速165 r/min、時間40 h、裝液量70 mL。在此最佳條件下吡嗪類的產量提高23.5%。本研究采用酒曲中篩選的高產蛋白酶活性和3-羥基丁酮的雙高細菌，相對于只研究單一活性高的細菌具綜合性且產量顯著。

關鍵詞：吡嗪；響應面；工藝優(yōu)化；白酒

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1451.011.html。

吡嗪類是中國白酒中的重要風味化合物，國外的研究表明，吡嗪類的化合物有預防心血管疾病的作用［1］。其中四甲基吡嗪（tetram-ethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪（Ligustrazine），川芎嗪的藥理作用主要有擴張血管、調節(jié)脂質代謝等作用，具有堅果、烘烤香氣［2］，被廣泛應用于食品加工行業(yè)［3］。作為中國白酒中健康的風味成分，其來源得到了極大的關注。吡嗪類化合物是1位、4位含2個氮雜原子的六元雜環(huán)化合物，并有氣味強度高、閾值低、風味獨特、特殊藥理功能和保健功能等特點，廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中，具有類似于炒堅果、烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對其他香味有顯著的烘托和疊加作用［4-5］。

本實驗以從酒曲中篩選的蛋白酶活性和3-羥基丁酮雙高的細菌為基礎，對其產吡嗪量進行實驗優(yōu)化。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

1.1.1材料

基礎培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L、玉米粉16 g/L、氯化錳0.05 g/L、氯化鎂0.15 g/L、氯化鋅0.1 g/L、氯化鐵0.05 g/L。

1.1.2儀器與設備

氣質聯(lián)用儀，美國PerkinElmer公司，購于上海安譜科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-50KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DHZ-B高溫全溫振蕩器，太倉市豪成實驗儀器制造有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計，島津公司。

1.1.3主要化學試劑

肌酸，北京雅安達生物技術有限公司；甲萘酚，國藥集團化學試劑有限公司；3-羥基丁酮，百靈威科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 L-酪氨酸標準曲線［6-8］的繪制

（1）稱取預先以105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，準確至0.0002 g，用1 mol/L鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL，即為1 mg/mL L-酪氨酸標準溶液。

（2）吸取1 mg/mL酪氨酸標準溶液10.00 mL，用0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL，即得100 μg/mL L-酪氨酸標準溶液。

（3）分別取上述溶液各1.00 mL（3個平行實驗），各加0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.0 mL，福林試劑溶液1.00 mL，置于40℃±0.2℃水浴中顯色20 min，用分光光度計于波長680 nm下，10 mm比色皿，以不含酪氨酸的0號管為空白，分別測定其吸光度，以吸光度為縱坐標，酪氨酸的濃度為橫坐標，繪制標準曲線（曲線應通過零點）。操作見表1。

表1　　L-酪氨酸標準曲線制作

1.2.2 3-羥基丁酮標準曲線的繪制

3-羥基丁酮在堿性介質中可以與肌酸反應生成紅色的化合物，甲蔡酚可以促進和加速紅色物質的生成，該化合物在范圍內有最大光吸收，在一定的范圍內，光吸收與3-羥基丁酮含量成正比。取8支比色管洗凈烘干，按表2加入標準溶液及顯色劑，以60℃水浴15 min，分光光度計530 nm下比色，繪制標準曲線。

表2　　3-羥基丁酮標準曲線制作

1.2.3產吡嗪的測定

利用氣相色譜質譜聯(lián)儀進行檢測。

2結果與分析

2.1培養(yǎng)基碳氮源選擇

2.1.1 3-羥基丁酮

圖1　　碳氮源篩選

2.1.2蛋白酶活性

蛋白酶活性檢測的吸光值見圖2，編號1—5分別表示濃度2 g/L、4 g/L、10 g/L、20 g/L、100 g/L。

由圖2可知，最佳碳氮源分別是葡萄糖和玉米粉。

2.2單因素實驗

2.2.1培養(yǎng)基成分

由于不同單因素條件發(fā)酵液中產生3-羥基丁酮和蛋白酶量不同，且3-羥基丁酮含量較多，尤其是碳氮源單因素實驗，必須進行適當稀釋再測其含量。而蛋白酶含量相對較少，也可進行適當稀釋較少倍數(shù)再進行測量。

2.2.1.1蛋白酶活性

（四）結構扁平，領導管理要求高。省軍區(qū)系統(tǒng)重組重塑后，體制結構更加扁平，人員編成更加精干，對領導管理工作提出新的更高要求。由于省軍區(qū)單位點多線長面廣，且駐地相對分散，管理對象既有軍官、士兵、文職人員和職工，還有專武干部和離退休干部，人員多樣、成分復雜，領導管理任務重、壓力大。因此，過去那種事無巨細“一竿子插到底”、大包大攬“保姆式”的領導管理方式顯然已不適用，必須打破傳統(tǒng)思維，跳出固有模式，創(chuàng)新理念方法，建立更加科學高效的領導管理和工作指導體系。

2.2.1.2 3-羥基丁酮

由表3—表6可知，最佳培養(yǎng)基成分單因素條件是葡萄糖70 g/L、玉米粉16 g/L、鎂離子0.15 g/L、錳離子0.05 g/L、鋅離子0.1 g/L、鐵離子0.05 g/L。

2.2.2培養(yǎng)條件

由于不同單因素條件發(fā)酵液中產生3-羥基丁酮和蛋白酶量不同，且3-羥基丁酮含量較多，必須進行適當稀釋再測其含量。而蛋白酶含量相對較少，也可進行適當稀釋較少倍數(shù)再進行測量。

圖2　　碳氮源篩選

2.2.2.1蛋白酶

2.2.2.2 3-羥基丁酮

由表8可知，最佳培養(yǎng)基條件單因素條件為裝液量80 mL/250 mL，轉速175 r/min，培養(yǎng)時間40 h，接種量8%。

2.3實驗優(yōu)化設計

由表7可知，蛋白酶活性與3-羥基丁酮的產生量隨各因素的變化趨勢基本一致，無論是培養(yǎng)基成分還是培養(yǎng)條件都一致，故優(yōu)化實驗只針對單一因素3-羥基丁酮進行。

2.3.1 Plackett-Burman實驗設計

對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行綜合實驗，隨機編號為A玉米粉、B培養(yǎng)時間、C錳離子、D鎂離子、E鋅離子、F轉速、G裝液量、H葡萄糖、J鐵離子、K接種量，結果見表9。

通過分析結果可見，葡萄糖（H）＞轉速（F）＞時間（B）＞裝液量（G）為最顯著的4個因子，其中葡萄糖、時間為正效應，轉速和裝液量為負效應，因此確定對此4個因子做進一步實驗——最陡爬坡實驗。

2.3.2最陡爬坡實驗

由表10可知，吸光值隨各因子變化而變化的情況。當葡萄糖、轉速、時間和裝液量分別為80 g/L、165 r/min、45 h和70 mL/250 mL時，吸光值最大，因此，選此處作為中心點，進行下一步實驗——Box-behnken實驗設計。

2.3.3 Box-behnken實驗設計

重新編碼，A為葡萄糖，B為轉速，C為時間，D為裝液量，結果見表11。

如表11所示，A、AC、BD、A2顯著，C2極顯著，模型顯著，失擬項不顯著，說明該模型適合對該實驗進行分析。

根據以上對實驗數(shù)據的分析整合，對吸光值進行預測。當葡萄糖含量為70 g/L、轉速為165 r/min、時間為40 h、裝液量為70 mL時，吸光值預測值為0.3798。在此條件下進行實驗，得到吸光值為0.3832，與預測值接近。

表3　培養(yǎng)基成分

表4　培養(yǎng)基成分

表5　培養(yǎng)基成分

表6　培養(yǎng)基成分

表7　培養(yǎng)條件

表9　結果分析

2.4產吡嗪的測定

分別應用優(yōu)化前的工藝和最佳工藝進行16組發(fā)酵實驗，進行對比，測得的6種吡嗪類產量總和見圖4。

表1　0最陡爬坡實驗結果

3　結論

通過實驗優(yōu)化設計，葡萄糖含量為70 g/L、轉速為165 r/min、時間為40 h、裝液量70 mL為最優(yōu)發(fā)酵工藝。在此最優(yōu)工藝下，吡嗪類產量比沒有優(yōu)化的工藝提高23.5%。

圖3　因素間關系

表1　1 Box-behnken實驗設計結果

圖4　吡嗪類檢測結果

參考文獻：

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［4］汪江波，萬朕，李莉，等.稻花香窖泥微生物群落變化研究［J］.釀酒科技，2010（6）：36-39.

［5］張溫清，王永軍.宣酒芝麻香型白酒中吡嗪類健康功能因子的分析研究［J］.釀酒科技，2014（8）：37-42.

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［8］成堃，路福平，李玉，等.產堿性蛋白酶菌株的篩選、分子鑒定及其酶學性質的初步研究［J］.中國釀造，2009（2）：33-36.

中圖分類號：TS261.1；Q93-3；TS262.3

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0030-05

基金項目：窖泥中的微生物時空分布及代謝特性對其生命周期影響的研究（國家自然科學基金，項目號：31401680）；中國白酒3C計劃。

收稿日期：2015-11-03

作者簡介：武順（1987-），碩士研究生。

通訊作者：王德良，男，博士，教授級高級工程師，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院釀酒工程部主任。

Optimization of Pyrazine-Producing Conditions of Bacteria by Response Surface Method

WU Shun，YAN Yinzhuo，HAN Xinglin and WANG Deliang
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：In this study，pyrazine-producing conditions of bacteria were studied. The bacteria were screened from different Daqu，and the influence of different factors on pyrazine yield by bacteria was investigated. The four main influencing factors including glucose，rotating speed，rotating time and fluid volume were optimized by single factor and response surface experiments. The results showed that the influencing factors ranked in decreasing sequence as glucose＞rotating speed＞rotating time＞fluid volume. The optimum technical parameters were summed up as follows：70 g/L glucose，rotating speed at 165 r/min，rotating time of 40 h，fluid volume of 70 mL. Under above conditions，pyrazine yield increased by 23.5%. Besides，the bacteria strain used in this study was with high yield of both protease and 3-hydroxy-2-butanone，and was superior to bacteria strains with high yield of single metabolite.

Key words：pyrazine；response surface method；technical optimization；Baijiu