張 笛，曾慶梅*，王 琳，閆春明，高 雅（合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥　230009）

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微波輔助酶法提取絞股藍(lán)皂苷工藝優(yōu)化

張 笛，曾慶梅*，王 琳，閆春明，高 雅
（合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥230009）

摘 要：為改善傳統(tǒng)水提法提取得率低的問題，研究微波輔助酶法提取絞股藍(lán)皂苷工藝。采用響應(yīng)面法篩選酶法提取中復(fù)合酶的最佳配比，確定了復(fù)合酶最佳配比為果膠酶-半纖維素酶-纖維素酶質(zhì)量比為4∶5∶5，再利用單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明：影響微波輔助酶法提取絞股藍(lán)皂苷主要因素為復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、微波時(shí)間，優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)為復(fù)合酶添加量1.8%、酶解溫度52 ℃、酶解時(shí)間2 h、微波時(shí)間4 min，此工藝條件下絞股藍(lán)皂苷得率為7.88%。該提取方法與傳統(tǒng)水提法相比，產(chǎn)品得率增加了68%，且提取溫度較低，工藝可操作性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：微波；復(fù)合酶法；響應(yīng)面法；絞股藍(lán)皂苷

引文格式：

張笛, 曾慶梅, 王琳, 等. 微波輔助酶法提取絞股藍(lán)皂苷工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 1-6. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612001. http://www.spkx.net.cn

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絞股藍(lán)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤木，又名五葉參、七葉膽，主要分布在我國(guó)湖南、廣西、云南、四川等省份，歷來有“南方人參”的美譽(yù)[1]。20世紀(jì)70年代以來，日本和中國(guó)的學(xué)者已從絞股藍(lán)中分離出80多種絞股藍(lán)皂苷，發(fā)現(xiàn)其中4種絞股藍(lán)皂苷[2]分別與人參皂苷Rb1、Rb3、Rd和F2同構(gòu)異名，并且研究[3-5]表明絞股藍(lán)中皂苷的含量是人參的3 倍。現(xiàn)代藥理學(xué)研究及臨床實(shí)驗(yàn)[6-11]證明，絞股藍(lán)皂苷為絞股藍(lán)的主要功能性組分，具有降血脂、抗誘變、抗衰老、增強(qiáng)免疫力和保護(hù)肝臟等作用。

近幾年對(duì)絞股藍(lán)皂苷的研究多數(shù)集中在絞股藍(lán)藥理作用和皂苷單體的分離純化等方面，而忽略了對(duì)絞股藍(lán)皂苷提取工藝的研究[12]。目前已見報(bào)道的絞股藍(lán)提取工藝研究大多集中在傳統(tǒng)的水提[13]、醇提[1]、超聲提取[14]、單一酶種提取[15-16]，而這些方法不同程度地存在皂苷得率提高不大、耗能大等問題[13]。

通常的酶法提取只考察一種酶的酶解破壁實(shí)驗(yàn)，無法同時(shí)發(fā)揮不同酶種特有的優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)絞股藍(lán)細(xì)胞壁組成，同時(shí)采用果膠酶、半纖維素酶、纖維素酶，充分發(fā)揮各自的酶解優(yōu)勢(shì)，復(fù)合酶解破壁。同時(shí)引入操作簡(jiǎn)單、能耗小、效率高的微波提取技術(shù)，絞股藍(lán)粉末在快速振動(dòng)的微波電磁場(chǎng)中吸收電磁能，細(xì)胞內(nèi)部的極性分子發(fā)生高頻振動(dòng)和摩擦，溫度迅速上升，瞬間的內(nèi)外壓力差超過細(xì)胞壁的承受能力而導(dǎo)致細(xì)胞破裂[17-20]，從而輔助提高復(fù)合酶解破壁提取絞股藍(lán)的效果，增加絞股藍(lán)皂苷的溶出率。第一步先通過響應(yīng)面試驗(yàn)篩選復(fù)合酶最佳配比，然后利用單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)[21]對(duì)微波輔助酶法提取絞股藍(lán)皂苷的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而開發(fā)一種高效破壁提取絞股藍(lán)皂苷的新技術(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

絞股藍(lán)神農(nóng)金康原生態(tài)茶業(yè)有限公司；Amberlite XAD-2大孔樹脂上海金穗生物科技有限公司；冰乙酸、高氯酸、無水乙醇、檸檬酸等（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶（均為食品級(jí)，酶活均為50 000 U/g）江蘇銳陽生物科技有限公司；人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2儀器與設(shè)備

FD-1真空干燥箱北京博醫(yī)康技術(shù)公司；JP-500C微型植物粉碎機(jī)永康市久品工貿(mào)有限公司；PB-10 型pH計(jì)美國(guó)Stangardize公司；MP-70107FL微波爐廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司；UV-1600紫外分光光度計(jì)美國(guó)Spectrophotometer公司；TB-215D型電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇省金壇市儀器研究所；SIGMA 3K15高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；XW-80A微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1絞股藍(lán)皂苷的提取工藝流程

絞股藍(lán)全草→真空干燥→粉碎過60 目篩→準(zhǔn)確稱取2.0 g預(yù)處理過的絞股藍(lán)粉末→添加一定比例蒸餾水→800 W微波間歇處理一定時(shí)間→檸檬酸調(diào)節(jié)pH值→添加復(fù)合酶50 ℃條件下酶解一定時(shí)間→70 ℃滅酶30 min→離心（3 000 r/min，10 min）→過濾→濾液4 ℃冷藏柜中靜置過夜→離心（5 000 r/min，10 min）得上清液→Amberlite XAD-2離子交換大孔樹脂層析→70%乙醇溶液洗脫→60 ℃水浴揮干→絞股藍(lán)皂苷晶體

1.3.2絞股藍(lán)皂苷得率的測(cè)定

按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[22]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3復(fù)合酶最佳組合的確定

針對(duì)絞股藍(lán)細(xì)胞壁特點(diǎn)和皂苷分布部位[23]，選用纖維素酶、果膠酶及半纖維素酶進(jìn)行復(fù)配，采用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的組合比例。以充分發(fā)揮不同酶種的優(yōu)勢(shì)，最大限度地破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高皂苷得率。

設(shè)定pH 5.0，準(zhǔn)確稱取2.0 g預(yù)處理過的絞股藍(lán)粉末于100 mL三角瓶中，以1∶30（g/mL）料液比加入蒸餾水[24]，800 W條件下微波2 min[25]，之后用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為規(guī)定值，按照響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（表1）加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶進(jìn)行混合，50 ℃酶解1 h，70 ℃滅酶30 min，再按1.3.2節(jié)方法測(cè)定并計(jì)算總皂苷得率，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，并通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出效果較好的復(fù)合酶組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1　復(fù)合酶配比響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in central composite design experiments for the optimization of enzyme mixing ratio

1.3.4絞股藍(lán)皂苷提取單因素試驗(yàn)

預(yù)設(shè)料液比1∶30（g/mL）、pH 5.0、復(fù)合酶添加量1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，果膠酶-半纖維素酶-纖維素酶質(zhì)量比1∶1∶1）、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間1.0 h、微波時(shí)間2 min。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過的絞股藍(lán)粉末2.0 g，以料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、復(fù)合酶添加量（0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%）、酶解時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、酶解pH值（4.4、4.6、4.8、5.0、5.2）、酶解溫度（40、50、60、70、80 ℃）、微波時(shí)間（2、4、6、8、10 min）6 個(gè)單因素為變量，每一個(gè)單因素試驗(yàn)篩選出最優(yōu)條件作為下一個(gè)單因素的常規(guī)量，每個(gè)處理組均重復(fù)3 次。按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法提取、測(cè)定并計(jì)算絞股藍(lán)皂苷得率，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析確定影響顯著的因素。

1.3.5絞股藍(lán)皂苷提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用響應(yīng)面中Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合單因素試驗(yàn)確定的4 個(gè)影響絞股藍(lán)皂苷得率的顯著因素，進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2），建立數(shù)學(xué)回歸模型并分析。

表2　絞股藍(lán)皂苷提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels used in central composite design experiments for for the optimization of extraction parameters

2　結(jié)果與分析

2.1復(fù)合酶最佳配比的確定

表3　復(fù)合酶配比響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology for the optimization of enzyme mixing ratio

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表3）進(jìn)行逐步回歸，剔除影響不顯著的擬合項(xiàng)，可得到其二次多項(xiàng)式方程為：

Y=0.23＋7.89A＋8.07B＋13.94C＋7.63AC－12.92A2－8.61B2－18.73C2

表4　復(fù)合酶配比回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 4 Anal y sis of variance of all terms in regression equation for the optimization of enzyme mixing ratio

2.2復(fù)合酶配比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鑒于實(shí)際操作的局限，將條件設(shè)定為果膠酶添加量0.4%、半纖維素酶添加量0.5%、纖維素酶添加量0.5%，并結(jié)合料液比1∶30（g/mL）、酶解時(shí)間2 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在50 ℃條件下進(jìn)行絞股藍(lán)皂苷提取，3 次平行實(shí)驗(yàn)絞股藍(lán)皂苷得率（7.03%、7.10%和7.06%）平均值為7.06%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值差異不顯著，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的參數(shù)可以作為下一步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2.3提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1　單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1　Results of single factor experiments showing the effects of extraction parameters on the yield of gypenosides

由圖1a可知，溶劑用量過少時(shí)提取得率不高，這可能是因?yàn)檫^少的溶劑不利于絞股藍(lán)粉末的充分溶解，造成酶與底物接觸不充分。過大的溶劑用量則稀釋了酶溶液、不利于酶解反應(yīng)的高效進(jìn)行，同樣造成提取效果下降。綜合考慮溶劑消耗、提取效果、后續(xù)調(diào)配需求等實(shí)際問題，選擇料液比1∶30（g/mL）為宜。

由圖1b可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，酶與底物接觸機(jī)會(huì)相應(yīng)增大，可使絞股藍(lán)細(xì)胞壁破解，內(nèi)容物隨之釋放出來。但當(dāng)復(fù)合酶添加量超過1.5%后，皂苷得率的增加程度不明顯，其原因可能是由于底物完全被酶分子所飽和，繼續(xù)增加的酶分子失去了與底物結(jié)合的機(jī)會(huì)，造成酶解反應(yīng)速度降低，也可能是因?yàn)椴煌阜N的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制造成酶活降低[26]，導(dǎo)致皂苷得率相應(yīng)降低。因此從控制成本和皂苷得率綜合考慮，選擇復(fù)合酶添加量1.5%為宜。

由圖1c可知，絞股藍(lán)皂苷得率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)增加，從提高生產(chǎn)效率的角度看，酶解時(shí)間超過2.0 h 后，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)皂苷提取意義不大，因此選擇酶解時(shí)間在2.0 h為宜。

由圖1d可知，pH值在4.4～5.2之間，皂苷得率隨pH值的上升而增加，但皂苷得率變化不大，這可能是由復(fù)合酶的酶種特性決 定的，在這段pH值范圍內(nèi)復(fù)合酶能保持較高的酶活。弱酸性的提取環(huán)境有利于提取液的后期殺菌，降低殺菌溫度和殺菌時(shí)間從而更好地保留絞股藍(lán)皂苷，為絞股藍(lán)皂苷的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了很好的前提條件[27]。綜合考慮皂苷得率和殺菌效果，選擇酶解pH 4.8為宜。

由圖1e可知，隨著酶解溫度的升高，絞股藍(lán)皂苷得率升高，但當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí)，皂苷的提取率反而下降。過高的酶解溫度導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去活性[15]，當(dāng)溫度超過70 ℃后酶基本失活，失去了添加復(fù)合酶的破壁優(yōu)勢(shì)。所以酶解溫度控制在50 ℃為宜。

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在800 W微波條件下，用時(shí)2 min提取液可達(dá)70 ℃，為防止部分皂苷由于長(zhǎng)時(shí)間微波作用產(chǎn)生熱降解，本實(shí)驗(yàn)固定微波功率在800 W，2 min間歇微波處理。由圖1f可知，在累積微波時(shí)間4 min后，繼續(xù)延長(zhǎng)微波時(shí)間絞股藍(lán)皂苷得率提高不大，這可能是因?yàn)? min時(shí)微波的破壁作用已充分進(jìn)行，之后微波時(shí)間的延長(zhǎng)所帶來絞股藍(lán)皂苷得率的微弱提高大多是因?yàn)闇囟鹊奶嵘鶐淼模紤]到節(jié)約能耗和時(shí)間，選擇微波時(shí)間在4 min左右為宜。

表5　單因素試驗(yàn)方差分析Table 5 Analysis of variance of single factor experiment

通過單因素試驗(yàn)方差分析（表5）確定各因素的顯著性先后順序?yàn)槊附鉁囟?、?fù)合酶添加量、酶解時(shí)間、微波時(shí)間、酶解pH值、料液比，其中影響極顯著的4 個(gè)因素分別為酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間、微波時(shí)間。

2.4絞股藍(lán)皂苷提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表6　絞股藍(lán)皂苷提取Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 6 Box-Behnken design with experimental values of gypenosides yield

對(duì)表6試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸多次擬合，剔除影響不顯著的擬合項(xiàng)后，可得到其二次多項(xiàng)式方程為：

表7　絞股藍(lán)皂苷提取回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 7 Analysis of variance of all terms in regression equation for the optimization of extraction parameters

由表7可以看出，該模型P＜0.01（極顯著），失擬項(xiàng)P＞0.05（不顯著）；同時(shí)模型的決定系數(shù)R2=0.95，說明模型擬合程度良好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.92，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性；再次變異系數(shù)CV=1.02%，也說明其置信度較高。因此可以用此回歸模型對(duì)絞股藍(lán)皂苷得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析獲得最佳工藝為復(fù)合酶添加量1.85%、酶解溫度52.32 ℃、酶解時(shí)間2.07 h、微波時(shí)間4.31 min，在此條件下，預(yù)測(cè)的絞股藍(lán)皂苷得率最大理論值為7.92%。

2.5絞股藍(lán)皂苷提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了方便實(shí)際操作，將條件調(diào)節(jié)為復(fù)合酶添加量1.8%、酶解溫度52 ℃、酶解時(shí)間2 h、微波時(shí)間4 min，并結(jié)合料液比1∶30（g/mL）、酶解pH 4.8，進(jìn)行3次平行絞股藍(lán)皂苷提取實(shí)驗(yàn)，絞股藍(lán)皂苷得率（7.86%、7.90% 和7.89%）平均值為7.88%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值差異不顯著。因此，該法優(yōu)化得到的工藝條件基本準(zhǔn)確可靠，可以作為工業(yè)化應(yīng)用的依據(jù)。

2.6與傳統(tǒng)水提法比較結(jié)果

若不采用微波輔助酶法，而是利用傳統(tǒng)水提法提取絞股藍(lán)皂苷，水提條件為2 g預(yù)處理過的絞股藍(lán)粉末、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間1 h，平行測(cè)定6組，絞股藍(lán)皂苷得率的平均值為4.69%。從產(chǎn)品得率看，微波輔助酶法提取率相比傳統(tǒng)水提法提高了68%，這主要是因?yàn)槲⒉ㄝo助酶法在微波破壁的基礎(chǔ)上進(jìn)一步復(fù)合酶解更有利于改變細(xì)胞壁的組織結(jié)構(gòu)和狀態(tài)，提高破壁效果，促進(jìn)絞股藍(lán)皂苷的溶出，且微波輔助酶法提取溫度低，皂苷不易失活，有助于提高絞股藍(lán)皂苷得率。

3　結(jié) 論

經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到皂苷提取所用復(fù)合酶配比為果膠酶添加量0.4%、半纖維素酶添加量0.5%、纖維素酶添加量0.5%，即4∶5∶5。添加量影響強(qiáng)弱次序?yàn)椋豪w維素酶＞半纖維素酶＞果膠酶。

通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化，得到了影響絞股藍(lán)皂 苷得率的4 個(gè)顯著因素，并實(shí)現(xiàn)了提取條件的優(yōu)化。最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶30（g/mL）、酶解pH 4.8、微波功率800 W、復(fù)合酶添加量1.8%、酶解溫度52 ℃、酶解時(shí)間2 h、微波時(shí)間4 min，絞股藍(lán)皂苷得率平均為7.88%，與預(yù)測(cè)值差異不顯著。

微波輔助酶法提取工藝操作簡(jiǎn)單，提取溫度較低，能耗大大減少[28]。成本增加主要是復(fù)合酶，但是酶的用量?jī)H為1.8%，且3種酶的價(jià)格也較便宜，綜合來看產(chǎn)品得率提高所帶來的附加值以及產(chǎn)品能耗的降低可以抵消微波輔助酶法的成本增加，具有很好的工業(yè)化前景。

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Optimization of Microwave-Assisted Enzymatic Extraction of Gypenosides from Gynostemma pentaphyllum

ZHANG Di, ZENG Qingmei*, WANG Lin, YAN Chunming, GAO Ya
(Engineering Research Center of Bio-Process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei230009, China)

Abstract:This study addressed the microwave-assisted enzymatic extraction of gypenosides from the whole plants of Gynostemma pentaphyllum as an improvement over the traditional water extraction method, giving a lower extraction yield. Response surface method based on Box-Behnken design was used to optimize the ratio of pectinase to hemicellulase to cellulose for their combined use in the extraction of gypenosides as well as process parameters. The results showed that enzyme dosage, hydrolysis temperature, hydrolysis time and microwave irradiation time were identified as main variables that influence extraction efficiency. The optimum values for these 4 independent variables were 1.8%, 52 ℃, 2 h and 4 min, respectively. The yield of gypenosides was 7.88% under these conditions, which was increased by 68% compared with that obtained with the traditional water extraction method. Due to its low extraction temperature and simple operation, this method has a good prospect of industrial application.

Key words:microwave; multi-enzymatic method; response surface methodology; gypenosides

收稿日期：2015-11-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371844）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100801）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（1301032155）

作者簡(jiǎn)介：張笛（1990—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称番F(xiàn)代加工工程化技術(shù)。E-mail：baitianwy@163.com

*通信作者：曾慶梅（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與生物化工。E-mail：zengqingmei-1@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612001

中圖分類號(hào)：TS201.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）12-0001-06