劉二龍，袁慕云，鄧建英，幸 芳，呂英姿，蔣 原，薛 峰，邵景東，許龍巖,*（.黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州　5070；.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州　506；.廣州市番禺質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測所，廣東 番禺　500；.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京　000）

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出入境動物源性食品中單增李斯特菌的多位點(diǎn)序列分型分析

劉二龍1，袁慕云2，鄧建英3，幸 芳3，呂英姿1，蔣 原4，薛 峰4，邵景東4，許龍巖2,*
（1.黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州510730；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州510623；3.廣州市番禺質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測所，廣東 番禺511400；4.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京210001）

摘 要：對出入境動物源性食品中分離的單增李斯特菌進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（mutilocus sequence typing，MLST）分析，了解其序列型分布特點(diǎn)及不同菌株之間的親緣關(guān)系。提取單增李斯特菌基因組DNA，選擇其7 個管家基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增并測序。將測序結(jié)果截成標(biāo)準(zhǔn)序列的長度后上傳到MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲得7 個管家基因的等位基因譜和序列分型編碼，并將結(jié)果采用不加權(quán)算術(shù)平均組對（unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA）法進(jìn)行聚類分析。89 株單增李斯特菌共獲得51 個STs，其中26 個為新獲得的STs （STnew1～STnew26）；數(shù)量最多的5 個STs為ST8（9.0%），ST121（9.0%）、ST7（5.6%）、ST87（5.6%）及新發(fā)現(xiàn)的STnew3（7.8%）；其中ST456、ST34、ST343、ST19、ST517、ST201、ST98、ST330和ST73為在國內(nèi)首次獲得。采用UPGMA算法得到的進(jìn)化樹可將89 株菌株分為3 大類群，分類的結(jié)果與單增李斯特菌血清學(xué)家系分類結(jié)果一致。MLST結(jié)果對了解出入境動物源性食品中分離的單增李斯特菌的親緣關(guān)系及流行病學(xué)溯源有重要意義。

關(guān)鍵詞：單增李斯特菌；多位點(diǎn)序列分型；親緣關(guān)系

引文格式：

劉二龍, 袁慕云, 鄧建英, 等. 出入境動物源性食品中單增李斯特菌的多位點(diǎn)序列分型分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 212-216. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612038. http://www.spkx.net.cn

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單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種人畜共患病的病原菌，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多，可以通過污染奶及奶制品、蔬菜、水產(chǎn)品、肉制品等食物導(dǎo)致人群感染[1-2]。該菌在4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一[3-5]。單增李斯特菌有13 個不同的血清型，依據(jù)其可將單增李斯特菌分成Lineage Ⅰ、Lineage Ⅱ和Lineage Ⅲ 三大家系[6-7]。但單增李斯特氏菌的分子亞型有100多個，近年國外應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、脈沖場凝膠電泳等方法對單增李斯特菌進(jìn)行分型研究[8-11]。

隨著測序費(fèi)用的大幅降低及測序速度的加快，多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）逐漸被應(yīng)用于病菌原微生物流行病學(xué)研究[12]。MLST通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增7 個管家基因內(nèi)部片段并測定其序列，經(jīng)MLST數(shù)據(jù)庫分析后獲得管家基因的等位基因圖譜及STs編碼，可以獲得菌株間精確的進(jìn)化關(guān)系數(shù)據(jù)[13-14]。它由Maiden等[15]于1998年首次運(yùn)用于腦膜炎奈瑟菌的分型，后來由于其結(jié)果精確并且數(shù)據(jù)易于實(shí)驗(yàn)室間傳遞和比較而廣泛應(yīng)用于其他致病菌、真菌以及一些非致病菌分子分型[16]。

本研究對進(jìn)出境動物源性食品中分離的88 株單增李斯特氏菌及標(biāo)準(zhǔn)參考菌株ATCC19115，采用法國巴斯德研究所的單增李斯特菌MLST方案[17]進(jìn)行MLST分型分析，初步探討我國進(jìn)出境動物源性食品中單增李斯特菌STs分布特點(diǎn)及菌株間親緣關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源

本研究共選用單增李斯特氏菌菌株89 株，其中88 株菌株為廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心和中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院分離保存，另1 株為單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19115。

1.1.2試劑

dNTPs、高保真PrimerSTAR HS DNA酶、dNTPmix、5×PrimeSTAR緩沖液、DL2000 DNA Marker、瓊脂糖寶生物工程（大連）有限公司；Goldview、DNA提取試劑盒北京天根生化科技有限公司；腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Tris、乙二胺四乙酸美國Sigma公司。

1.1.3儀器與設(shè)備

CT15RE高速冷凍離心機(jī)日本Hitachi公司；ND2000C微量分光光度計(jì)美國Thermo Scientific公司；S1000 PCR儀、164-5050電泳儀美國Bio-Rad公司；Tanon 4200凝膠成像系統(tǒng)上海天能公司。

1.2方法

1.2.1菌株培養(yǎng)及基因組DNA提取

將保存于－80 ℃單增李斯特菌菌株接種于BHI肉湯中，36 ℃過夜培養(yǎng)。取培養(yǎng)后的單增李斯特菌菌液1 mL離心去培養(yǎng)基后，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2MLST管家基因選擇及PCR擴(kuò)增

參考法國巴斯德研究所的單增李斯特菌多位點(diǎn)序列分型數(shù)據(jù)庫操作方案[17]，確定用于分型的7 個管家基因abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh和lhkA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]，擴(kuò)增的引物信息見表1，測序上游引物為GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA，下游引物為TTGTGAGCGGATAACAATTT。引物委托寶生物合成。

表1　用于MLST分析的單增李斯特菌7 個管家基因的引物信息Table 1 Primers sequences in the MLST of Listeria monocytogenes

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：5×PrimeSTAR PCR緩沖液10 μL，dNTPmix（2.5 mmol/L）4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模版1.5 μL，超純水32 μL。abcZ、cat、dapE、dat和ldh基因的反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s，52 ℃退火12 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)。lhkA基因的反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s，52 ℃退火18 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)。bglA基因的反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s，45 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)。

1.2.3PCR產(chǎn)物的檢測、測序、序列拼接

擴(kuò)增產(chǎn)物陽性者，委托Invitrogen純化并進(jìn)行雙向測序。利用DNAStar中的Sequence模塊進(jìn)行雙向測序序列的拼接，并截齊成標(biāo)準(zhǔn)長度（abcZ，537 bp；bglA，399 bp；cat，486 bp；dapE，462 bp；dat，471 bp；ldh，453 bp；lhkA，480 bp）。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

依次將測序得到的7 個管家基因提交MLST網(wǎng)站[17]，可以得到所有菌株的7 個管家基因的等位基因編號。將菌株所得的等位基因數(shù)據(jù)按abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh和lhkA順序提交，獲得每株菌的等位基因圖譜確定序列的STs，按順序（abcZ-bglA-cat-dapE-dat-ldh-lhkA）將管家基因序列進(jìn)行連接，利用MEGA4軟件，按Construct Phylogeny的UPGMA算法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，得到菌株間的親緣關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.17個管家基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19115基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增7 個管家基因。擴(kuò)增片斷大小與預(yù)期相符（圖1）。

圖1　管家基因電泳圖Fig. 1　Electrophoretogram of the PCR products of seven housekeep genes

2.2MLST中7 個管家基因的等位基因情況

圖2　89 株單增李斯特菌中管家基因等位基因的數(shù)量Fig. 2　Number of alleles in seven loci from all 89 strains of Listeria monocytogenes

管家基因等位基因值的數(shù)量反映該基因的變異程度，由圖2可知，在89 株分離株中，等位基因數(shù)量最多的是ldh，為22 個，其次是dapE 16 個、bglA 15 個、cat 15 個、lhkA基因最穩(wěn)定，等位基因?yàn)?0 個，變化較小。

2.3STs的分布情況

MLST基因分型分析發(fā)現(xiàn)，89 株單增李斯特菌共呈現(xiàn)51 個ST型別，其26 個為新發(fā)現(xiàn)的STs（暫命名為STnew1～STnew26）。將經(jīng)MLST分型的單增李斯特菌分離株各STs的分布情況如圖3所示：ST8、ST121、ST7、ST87及新發(fā)現(xiàn)的STnew3（暫命名）為優(yōu)勢STs，所占比例分別為：9.1%、9.1%、5.7%、5.7%和8%。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的新STs將提交MLST數(shù)據(jù)庫管理員進(jìn)行確認(rèn)。

圖3　89 株菌株各STs占比例Fig. 3　Proportion of STs obtain from 89 strains of Listeria monocytogenes

2.4UPGMA分析

將各菌株的等位基因序列按順序（abcZ-bglA-catdapE-dat-ldh-lhkA）進(jìn)行連接，利用MEGA4軟件，按Construct Phylogeny的UPGMA算法進(jìn)行聚類，得到菌株間的進(jìn)化關(guān)系如圖4所示。89 株實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)UPGMA分析得到聚類可分為3 大類群Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ。其中Group Ⅰ和Group Ⅱ中STs的分布分別與血清學(xué)分類的Lineage Ⅰ、Lineage Ⅱ中STs分布一致[18]。

圖4　89 株單增李斯特菌UPGMA聚類分析Fig. 4　UPGMA dendrogram for 89 strains of Listeria monocytogenes

3　討 論

研究顯示，食入被單增李斯特菌污染的食品是目前引起人類單增李斯特菌病暴發(fā)和散發(fā)的重要原因[19-20]。自1981年加拿大沿海省份的李斯特菌病的暴發(fā)證實(shí)單增李斯特菌可能通過食物在人群中傳播以來[21]，各國相繼報道了多起李斯特菌病的暴發(fā)事件（其中美國1983—2011暴發(fā)6 起，加拿大2008年暴發(fā)1 起，歐洲1983—1992年暴發(fā)了5 起）[18]，單李增斯特菌被世界衛(wèi)生組織列為重點(diǎn)監(jiān)測的食源性病原菌之一[22]。中國目前雖然未曾爆發(fā)人感染單增李斯特菌病，但多位研究者從各地多種食品中均分離出單增李斯特菌[23-27]，其風(fēng)險性不容忽視。

本實(shí)驗(yàn)采用Pasteur網(wǎng)站的MLST方案，對單增李斯特菌的7 個管家基因采用高保真的Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，降低堿基的錯配幾率。此外對擴(kuò)增體系退火延伸時間進(jìn)行了優(yōu)化（abcZ、cat、dapE、dat和ldh基因?yàn)?2 ℃退火12 s，lhkA基因?yàn)?2 ℃退火18 s，bglA基因?yàn)?5℃退火15 s），達(dá)到了良好的擴(kuò)增效果，無非特異性擴(kuò)增條帶且條帶清晰（特別是對于lhkA基因），與之前報道的PCR擴(kuò)增退火條件略有不同[28-29]。此外，本研究在合成引物時，在上游、下游引物的5’端分別加上相同的測序引物，使后序測序時引物準(zhǔn)備的工作量減少且不易出錯，也便于測序儀對于退火溫度較低bglA基因順利進(jìn)行測序反應(yīng)。

據(jù)文獻(xiàn)[30-31]顯示，全球已獲得的單增李斯特菌STs主要為ST9、ST1、ST2、ST3、ST5、ST87、ST121、ST8、ST7、ST59、ST4、ST6、ST122、ST101、ST155、ST101、ST199。法國和瑞典在1995年曾暴發(fā)分子亞型為ST1的單增李斯特菌感染事件，1997年在意大利暴發(fā)的單增李斯特菌型別為ST2[19]。Wang Yan 等[18]對中國國內(nèi)單增李斯特菌進(jìn)行了MLST分型，共獲得36 個STs，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)主要STs為ST9（29.1%）、ST8 （11.7%）、ST87（10%），并認(rèn)為是國內(nèi)潛在可能傳播和暴發(fā)的STs型別。馬愛靜等[28]調(diào)查了北京市一些地區(qū)生肉標(biāo)本中單增李斯特菌的分子流行病學(xué)特征，將分離到的21 株單增李斯特菌經(jīng)MLST得到7 個STs，其中ST9數(shù)量最多（10 株）。劉萍萍等[29]將由動物源性食品中分離到的33 株單增李斯特菌株通過MLST得到8 個STs，其中屬于ST121型別菌株最多，所占比例為45.5%。

本研究從我國出入境口岸動物源性食品中分離單增李斯特菌共獲得51個STs，其中26個為新STs（暫命名為STnew1-STnew26，尚需遞交MLST網(wǎng)站確認(rèn)），ST8、ST121、ST7、ST87及新發(fā)現(xiàn)的STnew3為優(yōu)勢STs，所占比例分別為：9.0%、9.0%、5.6%、5.6%和7.8%。此外，本實(shí)驗(yàn)獲得了國內(nèi)尚無報道的9種STs：ST456、ST34、ST343、ST19、ST517、ST201、ST98、ST330、ST73。

按傳統(tǒng)的血清學(xué)分類，單增李斯特菌分為3 大家系：LineageⅠ、LineageⅡ和Lineage Ⅲ（最近有文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn)Lineage Ⅳ）[32]。本實(shí)驗(yàn)將89 株單增李斯特菌7 個管家基因序列連接后根據(jù)UPGMA算法進(jìn)行聚類分析，可分成3 大類：GroupⅠ、GroupⅡ、Group Ⅲ。其中GroupⅠ內(nèi)分布的STs均屬LineageⅠ、GroupⅡ內(nèi)分布的STs均屬LineageⅡ，分類的結(jié)果與血清學(xué)分類一致。

隨著國際貿(mào)易的日益頻繁，單增李斯特菌可能隨著進(jìn)出境動物源性食品貿(mào)易而進(jìn)行傳播。本實(shí)驗(yàn)通過MLST分析獲得的優(yōu)勢STs如ST8、ST121、ST7和STnew3可能成為潛在傳播和暴發(fā)單增李斯特菌病的分子亞型。本實(shí)驗(yàn)通過對出入境口岸動物源性食品中分離的單增李斯特氏菌進(jìn)行的MLST分析，了解其STs分布情況及菌株間親緣關(guān)系，這對于單增李斯特菌病的臨床診斷，流行病學(xué)溯源、疾病的防控有著重要意義。

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Multilocus Sequence Typing of Listeria monocytogenes Isolated from Imported and Exported Animal-Derived Foods

LIU Erlong1, YUAN Muyun2, DENG Jianying3, XING Fang3, Lü Yingzi1, JIANG Yuan4, XUE Feng4, SHAO Jingdong4, XU Longyan2,* (1. Huangpu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou510730, China; 2. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou510623, China;
3. Guangzhou Panyu Quality and Technology Supervision and Testing Institute, Guangzhou511400, China;
4. Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing210001, China)

Abstract:This study was devised to understand the sequence types (STs) and the genetic and evolutionary relationship of different Listeria monocytogenes isolated from imported and exported animal-derived food samples. Seven house-keeping genes were selected as target genes for PCR amplification. Sequencing, analysis and comparison of the 7 housekeeping genes were conducted. Their alleles and STs codes were obtained, and their evolutionary relationships were analyzed by unweighted pair group method using arithmetic average (UPGMA). A total of 51 STs were obtained from 89 strains by multilocus sequence typing (MLST), among which 26 were novel. The 5 most common STs were ST8 (9.0%), ST121 (9.0%), ST7 (5.6%) and ST87 (5.6%) as well as the novel STnew 3 (7.8%). ST456, ST34, ST343, ST19, ST517, ST201, ST98, ST330 and ST73 were found for the first time in China. The evolutionary relationship analyzed by UPGMA method showed that the isolates were grouped into 3 clusters, which were consistent with three lineages classified by serotype of L. monocytogenes. MLST is a useful method to evaluate genetic evolution. This method is applicable to study the population structure and epidemiological traceability of L. monocytogene isolates from imported and exported animal-derived food samples.

Key words:Listeria monocytogenes; mutilocus sequence typing (MLST); evolutionary relationship

收稿日期：2015-08-29

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B040402004）

作者簡介：劉二龍（1978—），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锱c分子生物學(xué)。E-mail：erlongliu@126.com

*通信作者：許龍巖（1970—），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锱c分子生物學(xué)。E-mail：xlyciq@126.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612038

中圖分類號：R377

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0212-05