李雪娜，尹雅芙，杜補林，李亞明

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學科，遼寧 沈陽　110001)

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NOX 4對高糖代謝乳腺癌細胞侵襲轉移能力的作用

李雪娜，尹雅芙，杜補林，李亞明

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學科，遼寧 沈陽110001)

摘要：利用2-氟[18F-2]脫氧葡萄糖([18F]fluorodeoxyglucose,18F-FDG)乳腺癌細胞攝取實驗篩選高糖酵解率的乳腺癌細胞；采用基因沉默技術，降低細胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 (NOX 4)表達；采用免疫印跡方法檢測三組細胞(空白對照組、非特異性siRNA轉染組和特異性NOX 4-siRNA轉染組)的上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相關分子HIF-1α和TGF-β表達水平；通過細胞侵襲實驗分析三組細胞的侵襲能力差異。結果顯示,高侵襲力的MDA-MB-231較低侵襲力的MCF-7乳腺癌細胞系具有高糖酵解率(t=10.52,P<0.05)；抑制MDA-MB-231細胞的NOX 4表達，降低了細胞EMT相關因子HIF-1α、TGF-β表達(P均<0.01)與細胞侵襲能力(t=-8.0,P<0.01)。本研究初步證實NOX 4失活能夠降低高糖代謝乳腺癌細胞的侵襲轉移能力。

關鍵詞：乳腺癌；氟18-脫氧葡萄糖；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4；腫瘤轉移

乳腺癌是威脅人類健康的主要疾病，腫瘤轉移是導致乳腺癌患者死亡的重要原因，腫瘤細胞活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)增加會影響腫瘤轉移。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, NOX 4)由細胞內ROS產(chǎn)生，主要在成人和胎兒腎臟組織表達。在硬化發(fā)病過程中，NOX 4表達增高使ROS生成增高，引起平滑肌細胞凋亡[1]；氧化的低密度脂蛋白能使動脈內皮細胞的NOX 4促進ROS生成[2]。NOX 4在不同腫瘤中表達并與腫瘤侵襲轉移相關[3-7]，包括乳腺癌[8]。NOX 4在腫瘤中的表達與腫瘤生物學行為相關性為研究熱點[9-11]，正常細胞生物能量主要依賴線粒體氧化磷酸化，腫瘤細胞能量主要依賴于有氧糖酵解，但NOX 4在高糖代謝腫瘤細胞轉移中的作用尚不明確。近年來，腫瘤線粒體功能障礙與腫瘤生物學行為以及轉移的關系越來越受關注。Kozie等[12]發(fā)現(xiàn)在內皮細胞年齡-衰老模型中，持續(xù)增高NOX 4活性能降低線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的功能。ROS被證實與腫瘤的增殖和侵襲相關，其產(chǎn)生重要來源是NOX 蛋白和線粒體。線粒體內的抗氧化劑在細胞中水平最高，并在維持細胞氧化還原狀態(tài)發(fā)揮重要作用，在疾病情況下，NOX 蛋白能作用于線粒體而影響其氧化還原反應。NOX 蛋白主要定位于核周區(qū)和內質網(wǎng)，但也存在于質膜，并與線粒體有關[13-16]。Kelly等[17]應用線粒體定位信號(MLS)進行示蹤分析，發(fā)現(xiàn)NOX 4蛋白的N端含有MLS，證明NOX 4定位于線粒體上。因此，NOX 4與腫瘤的能量代謝關系密切。

本研究通過18F-FDG 細胞攝取實驗篩選出高糖代謝的乳腺癌細胞系，探究NOX 4對高糖代謝乳腺癌細胞侵襲轉移能力的影響,為乳腺癌轉移機制提供依據(jù)。

1實驗部分

1.1主要材料

人乳腺癌細胞系(MDA-MB-231，MCF-7)：中國科學院上海細胞庫，細胞接種在含10%胎牛血清、10 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)；NOX 4抗體：Abcam公司；兔抗人TGF-β單克隆抗體、多克隆抗體、HIF-1α兔抗人多克隆抗體：Cell signal公司；羊抗兔IgG-HRP、胰酶：碧云天公司；內參抗體 β-actin：WanLei Life Sciences公司；DMEM培養(yǎng)基：美國Invitrogen公司；胎牛血清：美國Hyclone公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)：雙螺旋公司；Transwell小室：美國Corning公司。

1.218F-FDG乳腺癌細胞攝取

按照參考文獻[18]中方法，孵育MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞攝取18F-FDG。分為不同的細胞鋪板密度組：1×105、2×105、5×105、1.0×106；不同的細胞孵育時間組：60、90、120、180 min。確定最佳細胞攝取實驗條件，并篩選高糖酵解的乳腺癌細胞。

1.3siRNA干擾和細胞轉染

根據(jù)siRNA設計原則，選取人NOX 4 RNA中的特異性核酸片段為靶目標，應用Ambion公司iRNA軟件設計NOX 4的RNAi序列(上海吉瑪基因化學技術有限公司合成)。實驗分三組：空白對照組、非特異性siRNA轉染組(NC)和特異性siRNA轉染組(分三個siRNA序列進行特異性轉染)。轉染具體方法按照說明書進行。NOX 4 siRNA序列如下：

非特異性siRNA序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

特異性NOX 4-siRNA序列：

1：5’-GCCUCAGCAUCUGUCUUATTUAAGAACAGAUGCUGAGGCTT-3’；

2：5’-CCCUCAACUUCUCAGUGAATTUUCACUGAGAAGUUGAGGGTT-3’；

3：5’-GCCUCUACAUAUGCAAUAATTUUAUUGCAUAUGUAGAGGCTT-3’。

1.4免疫印跡檢測

胰酶消化細胞，離心(4 ℃、1 000 r/min、5 min)，用PBS清洗細胞1次，加入適量M-PER細胞裂解液并吹打均勻，放置冰上裂解30 min，期間間隔混勻，離心(4 ℃、12 000 r/min、15 min)，取上清液，棄去沉淀的細胞碎片。根據(jù)二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒的說明，測定裂解液蛋白濃度。

參照參考文獻[19] 中免疫印跡(Western blot)檢測方法，以β-actin作為內參對照，提取細胞總蛋白進行檢測，檢測三組細胞(空白對照組、非特異性siRNA轉染組和特異性NOX 4-siRNA轉染組)的HIF-1α、TGF-β、NOX 4蛋白表達水平。實驗中一抗為NOX 4抗體(1∶1 000)、HIF-1α(1∶2 000)和TGF-β(1∶2 000)；二抗為羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)。

1.5細胞侵襲實驗

實驗Matrigel膠4 ℃過夜解凍，將Matrigel置冰上后放入超凈臺，用無血清培養(yǎng)基將膠以1∶2稀釋，下室加入800 μL 30% FBS培養(yǎng)液；上室加入200 μL細胞懸液，細胞數(shù)為每孔2×104個。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。0.5%結晶紫染液染色5 min，在倒置顯微鏡下(200×)對遷移至微孔膜下層的細胞計數(shù)。

1.6統(tǒng)計分析

2實驗結果

2.118F-FDG 細胞攝取

圖1　MCF-7細胞的18F-FDG攝取率Fig.1　18F-FDG uptake rates of MCF-7 cells

MCF-7和MDA-MB-231在不同細胞鋪板密度，不同18F-FDG孵育時間下18F-FDG放射性攝取率分別示于圖1、圖2。相同細胞攝取實驗條件下(90 min孵育時間、1.0×106細胞計數(shù))，MDA-MB-231放射性攝取率為(32.37±0.81)%ID/g，高于MCF-7的(15.49±5.08)%ID/g，差異具有顯著性(t=10.52，P<0.05)。因此，篩選出高糖酵解乳腺癌細胞系為MDA-MB-231。

圖2　MDA-MB-231細胞的18F-FDG攝取率Fig.2　18F-FDG uptake rates of MDA-MB-231 cells

2.2NOX 4 siRNA 瞬時轉染

應用三個siRNA序列進行特異性轉染MDA-MB-231細胞，分為MDA-MB-231細胞、NC細胞、NOX 4-siRNA-1細胞、NOX 4-siRNA-2細胞、NOX 4-siRNA-3細胞。

不同特異性siRNA轉染后MDA-MB-231乳腺癌細胞的NOX 4表達示于圖3。由圖3可知，進行siRNA-2序列轉染后，MDA-MB-231細胞NOX 4 表達下降，篩選出NOX 4基因沉默效率高的為siRNA-2細胞系。

圖3　不同乳腺癌細胞NOX 4表達Fig.3　Expression of NOX 4in different breast cancer cells

驗證siRNA-2轉染MDA-MB-231細胞系的NOX 4基因表達沉默效率，分為MDA-MB-231細胞、NC細胞、轉染的NOX 4 siRNA-2細胞。

不同細胞系的NOX 4表達示于圖4，Western blot的灰度定量分析示于圖5。結果顯示，siRNA-2序列轉染后的MDA-MB-231細胞NOX 4 表達下降，與未轉染的MDA-MB-231相比具有顯著性差異(P<0.01)；NC細胞NOX 4表達與未轉染的MDA-MB-231相比無顯著性差異(P=0.76)。

2.3Western blot檢測

不同細胞的HIF-1α與TGF-β表達示于圖6，HIF-1α與TGF-β Western blot 灰度定量分析示于圖7。結果表明，特異性siRNA轉染組細胞HIF-1α蛋白和TGF-β表達低于未轉染MDA-MB-231(P均<0.01)，NC細胞HIF-1α和TGF-β表達與MDA-MB-231相比無顯著性差異(P=0.158，P=0.821)，表明特異性siRNA轉染抑制NOX 4表達，降低了乳腺癌細胞的上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)水平。

a——HIF-1α；b——TGF-β圖6　不同細胞的HIF-1α與TGF-β表達a—HIF-1α；b—TGF-βFig.6　Expression of HIF-1α and TGF-β in different breast cancer cells

a——HIF-1α；b——TGF-β圖7　HIF-1α與TGF-β Western blot 灰度定量分析a——HIF-1α；b——TGF-βFig.7　HIF-1α and TGF-β quantitative analysis of gray scale of Western blot

2.4細胞侵襲

細胞侵襲結果示于圖8，定量分析示于圖9。結果顯示，特異性轉染NOX 4-siRNA MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)較未轉染MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)顯著性降低(分別為38.6±4.5vs94.6±11.1，t=-8.0,P<0.01)，非特異性轉染組NC細胞與未轉染MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)相比無顯著性差異(分別為94.00±13.5vs94.6±11.1，t=-0.06,P=0.71)。

a——MDA-MB-231；b——NC；c——NOX 4-siRNA圖8　細胞侵襲顯微鏡圖(200×)a——MDA-MB-231；b——NC；c——NOX 4-siRNAFig.8　The microscope chart of invasion experimental

圖9　細胞侵襲實驗的定量分析Fig.9　Quantitative analysis of cell invasion assay

3討論

腫瘤轉移發(fā)生后，通過破壞細胞間的連接、活化金屬蛋白酶改變間質環(huán)境、激活與細胞運動能力相關的Rho通路而獲得更強的細胞遷徙能力。研究引發(fā)EMT的機制對于治療腫瘤轉移具有重要意義。采用免疫印跡方法檢測細胞EMT相關分子HIF-1α和TGF-β表達水平，結果顯示，特異性siRNA轉染組較對照組乳腺癌細胞HIF-1α、TGF-β表達降低，與Boudreau 等[20]報道的NOX 4依賴ROS產(chǎn)生誘導乳腺癌MDA-MB-231的EMT結果一致。有研究報道，NOX 4通過參與TGF-β和SMAD3驅動誘導的腫瘤發(fā)生侵襲[21]，TGF-β通過Smad轉錄作用直接增加NOX 4蛋白的表達量而使ROS升高；但也有研究提出，EGF因子的加入能抑制TGF-β引起的FAO細胞NOX 4蛋白量升高，但并不能影響Smad的磷酸化水平[22]。

細胞侵襲實驗結果顯示，特異性siRNA轉染組較對照組乳腺癌細胞的遷徙能力明顯下降，表明在高糖代謝乳腺癌細胞中，NOX 4失活能降低高糖代謝乳腺癌細胞MDA-MB-231的HIF-1α和TGF-β的表達，抑制乳腺癌細胞的侵襲能力，NOX 4可能是高糖代謝乳腺癌細胞轉移治療的重要靶點。

4小結

通過攝取實驗篩選出高糖酵解乳腺癌細胞系MDA-MB-231；NOX 4-siRNA 瞬時轉染實驗篩選出沉默效率高的NOX 4-siRNA-2特異性轉染組細胞系，siRNA-2序列轉染后MDA-MB-231細胞NOX 4 表達下降，HIF-1α、TGF-β表達降低，乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)顯著性降低。

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Effect of NOX 4 on the Invasion and Metastasis of Breast Cancer Cells with High Glucose Metabolism

LI Xue-na, YIN Ya-fu, DU Bu-lin, LI Ya-ming

(DepartmentofNuclearMedicine,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Abstract:The breast cancer cells with high glucose metabolism were screened by18F-FDG cell uptake experiment. The gene silencing technique was used to reduce NOX 4 expression in cells. The experiment was divided into three groups: control group, the non-specific transfection group and specific transfection group. Western blotting was used to detect differences in the expression of HIF-1α and TGF-β in three groups. The invasion ability of the three groups by transwell cell invasion assay was analyzed. The results showed that MDA-MB-231 breast cancer cells had a higher rate of glycolysis than MCF-7 tumor cells(t=10.52,P<0.05). The expression of HIF-1α and TGF-β and the invasiveness of cells were reduced by inhibiting the level of NOX 4. This study showed that inhibition of NOX 4 expression was able to inhibit the invasion of breast cancer cell with high glucose metabolism.

Key words：breast cancer;18F- FDG; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4; tumor metastasis

收稿日期：2015-12-30;修回日期：2016-02-14

基金項目：國家自然科學基金(81271605)；遼寧省科學技術計劃項目 (2012225013)

作者簡介：李雪娜(1980—)，女，遼寧盤錦人，主治醫(yī)師，核醫(yī)學專業(yè) 通信作者：李亞明，E-mail: ymli2001@163.com

中圖分類號：R817.1

文獻標志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)02-0076-06

doi：10.7538/tws.2016.29.02.0076