孫　偉，童仕倫，鄭勇斌，秦凱迪，宋　丹，肖　曠

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院腸胃科　消化系統(tǒng)疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢　430060)

?

◇藥學(xué)研究◇

紅花多糖對人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲作用機(jī)制研究

孫偉，童仕倫，鄭勇斌，秦凱迪，宋丹，肖曠

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院腸胃科消化系統(tǒng)疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢430060)

摘要：目的紅花多糖對人結(jié)腸癌 LoVo 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲作用機(jī)制研究。方法體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌 LoVo 細(xì)胞，在不同濃度(0.5、1.0、1.5 g·L-1)的紅花多糖處理后，分別在干預(yù)24、48、72 h后采用 MTT 比色法測定紅花多糖對LoVo細(xì)胞的增殖抑制作用，利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，采用PI單標(biāo)流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布，Annexin V-FITC /PI 雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡率；采用RT-PCR檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平及檢測Caspase-3活性，Western-blot檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)情況；應(yīng)用Transwell細(xì)胞侵襲試驗檢測紅花多糖對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果MTT 檢測顯示紅花多糖能顯著抑制人結(jié)腸癌 LoVo 細(xì)胞的生長、増殖，呈現(xiàn)濃度和時間效應(yīng)關(guān)系；倒置顯微鏡顯示紅花多糖能使結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡特征；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果提示紅花多糖具有調(diào)節(jié)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞周期的功能。RT-PCR實驗和Western-blot實驗結(jié)果顯示隨著紅花多糖濃度增加可促進(jìn)LoVo細(xì)胞中Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)，并抑制 Bcl-2 mRNA表達(dá)。Transwell侵襲實驗示隨著紅花多糖濃度增加，LoVo 細(xì)胞侵襲能力降低。結(jié)論紅花多糖能顯著促進(jìn)人結(jié)腸癌 LoVo 細(xì)胞凋亡，可使結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞增殖受到抑制，侵襲能力減弱，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，紅花多糖的抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)可能與Bax、Bcl-2、Caspase-3 的信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：紅花；結(jié)腸腫瘤；腫瘤侵潤；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

結(jié)腸癌是我國最常見的惡性消化系統(tǒng)疾病腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別排在我國腫瘤第3位和第4位[1]，隨著人們生活水平不斷提高，結(jié)腸癌在我國發(fā)病率明顯增高。由于近年來，人們對于西藥成分居多的化療藥物耐藥性，使得當(dāng)前無特異性化療藥物，加之化療藥物對于正常細(xì)胞具有殺傷性和人體副作用較大，如今越來越多實驗轉(zhuǎn)移到中藥研發(fā)上，紅花多糖具有抗腫瘤作用，對人體毒副作用較小等優(yōu)點，受到越來越多的臨床醫(yī)生關(guān)注,但由于紅花多糖的藥理作用比較復(fù)雜，目前對于紅花多糖抗腫瘤機(jī)理不清楚，關(guān)于紅花多糖作用結(jié)腸癌研究較少。本實驗紅花多糖對人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞增殖，凋亡及侵襲作用機(jī)制研究，為后續(xù)紅花多糖藥理作用提供基礎(chǔ)，同時還可為結(jié)腸癌治療提供新的臨床方案。

1儀器與試藥

紅花多糖購置西安天瑞生物技術(shù)有限公司；人結(jié)腸癌LoVo 來自武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化實驗室;RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS和胰酶(含EDTA)購置吉諾公司,Trizol試劑購置Sigma公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量聚合酶連反應(yīng)試劑盒購置Takara公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒細(xì)胞增殖購置碧云天生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-別藻藍(lán)蛋白(APC)凋亡試劑盒購置美國BD Pharmingen公司；引物設(shè)計與合成來自上海生工公司；Transwell小室購置美國Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)，光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡(日本Olympus)，PCR儀(美國Bio-RAD)，超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo在含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗中所使用LoVo細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。待融合度至70%～80%時，將LoVo細(xì)胞胰酶(含EDTA)消化，制成細(xì)胞懸液并提前1 d將LoVo細(xì)胞接種12孔板中待細(xì)胞貼壁，生長良好后加藥。實驗設(shè)四組,每組重復(fù)3個樣本，其中第1組為只含有RPMI-1640對照組、第2、3、4組為含有不同濃度的紅花多糖RPMI-1640組。

2.2MTT比色分析法檢測細(xì)胞抑制率將處于對數(shù)生長期細(xì)胞消化后制成懸液，以每孔1×103個接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁生長后，棄其上清，加入含紅花多糖的完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，去上清，每孔加入含MTT不含胎牛血清培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,去上清，加入150 μL DMSO溶解，震蕩10 min使結(jié)晶完全溶解，混勻后在酶標(biāo)儀檢測下，測量在490 nm波長的吸光度值。每組設(shè)置3個復(fù)孔，根據(jù)公式細(xì)胞抑制率=[1-(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)]×100%，計算各組LoVo細(xì)胞抑制率并繪制抑制生長曲線。

2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞懸液以每孔5×105個接種于六孔板中，待24 h后，棄其上清，加入含紅花多糖的完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，使用含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞離心，棄上清，加PBS重懸，PBS清洗2次，1 500 r·min-1，5 min。按照Annexin V-PI細(xì)胞凋亡試劑盒說明進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀上檢測。收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106·L-1，加入75%冰乙醇，4 ℃固定過夜，1 500 r·min-1，5 min，去除固定液，經(jīng)PBS清洗后，加含PI的PBS進(jìn)行重懸，加入RNAse,然后加入PI后4 ℃避光30 min后流式細(xì)胞儀記錄細(xì)胞周期，計數(shù)G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞比例。

2.4RT-PCR檢測LoVo細(xì)胞的Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平使用SPS作用于LoVo細(xì)胞0、24、48、72 h 后收集LoVo細(xì)胞，提取總RNA,離心細(xì)胞，每(5～10)×106個細(xì)胞中加入 1 mL Trizol，反復(fù)吹打或劇烈震蕩充分裂解細(xì)胞直至無明顯沉淀，室溫靜置5 min使細(xì)胞充分裂解。按 200 μL氯仿/1 mL Trizol 比例加入氯仿，充分震蕩混勻后室溫放置2～3 min。4 ℃ 12 000 g 離心 15 min，使樣品分三層，吸取上層水相,放至另一個新 EP 管中加入等體積異丙醇,上下顛倒混勻,4 ℃靜置 5～10 min。 4 ℃ 12 000 g，離心 10 min,棄上清,離心后管壁和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。加入1 mL 75%乙醇，懸浮沉淀。4 ℃ 12 000 g 離心5 min,盡量棄上清，室溫晾干或真空干燥 5 min然后加入20 μL無Rnase的水，充分震蕩混勻。Nanodrop測定RNA的純度和純度。OD260/OD280正常比值范圍為1.8～2.0，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄獲得Bcl-2、Bax、Caspase-3 基因cDNA。Bcl-2、Bax、Caspase-3基因及內(nèi)參(磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH作為內(nèi)參)PCR引物序列見表1。R-T PCR 循環(huán)參數(shù)設(shè)定: 95 ℃ 3 min;72 ℃ 30 s,62 ℃ 40 s,經(jīng)35個循環(huán)。取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳測定。紅花多糖作用后LoVo細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。采取RIPA裂解液來提取LoVo細(xì)胞內(nèi)蛋白，通過BCA蛋白濃度試劑盒對所提取蛋白進(jìn)行濃度測定,提取后的蛋白上樣后行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后加封閉液(5%脫脂牛奶)封閉12 h,丟棄封閉液,加入Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗(1∶100)，然后過夜。TBST預(yù)洗1min，再清洗3次，每次5 min，加入二抗(1∶5 000)，雜交1 h，TBST 預(yù)清洗1 min，再清洗3次，每次5 min。然后向樣本中加入顯色劑后閉光顯色，利用凝膠圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，測定蛋白條帶定量表示Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量。

表1　引物序列

2.5LoVo細(xì)胞體外侵襲能力的測定在Transwell小室上室中加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞液100 μL，下室中加入750 μL含15%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后吸取小室內(nèi)液體，使用棉簽檫拭上室內(nèi)殘留液體，4%多聚甲醛固定20 min，室溫風(fēng)干或真空干燥，使用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。倒置顯微鏡(×100)倍下任意選取5個視野拍照片并計算5個視野計數(shù)細(xì)胞數(shù)平均值作為穿膜細(xì)胞數(shù)。

3結(jié)果

3.1藥物干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，對照組LoVo細(xì)胞生長旺盛,細(xì)胞貼壁生長,折光率較高,胞體較大,成梭形或多邊形,胞質(zhì)均勻透明,幾乎無漂浮細(xì)胞,且隨培養(yǎng)時間的延長，對照組LoVo細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，紅花多糖處理組的LoVo細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并且隨著紅花多糖濃度的增加和干預(yù)時間的延長，LoVo細(xì)胞逐漸變小、變圓，折光率減弱,核濃縮等，部分凋亡細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)瓶中。

3.2紅花多糖對LoVo細(xì)胞增殖影響配置一定比例稀釋后不同濃度的紅花多糖對LoVo細(xì)胞生長的抑制作用，分析得出紅花多糖對LoVo細(xì)胞的24、48、72 h，與未加紅花多糖的LoVo細(xì)胞相比，紅花多糖對 LoVo細(xì)胞的抑制率作用明顯，SPS的濃度在0.5～1.5 g·L-1可一定程度上抑制LoVo細(xì)胞增殖，且隨著SPS濃度的升高和干預(yù)時間增加，增殖抑制作用也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴效應(yīng),見圖1。

圖1　SPS對LoVo細(xì)胞增殖抑制率

3.3紅花多糖對LoVo細(xì)胞凋亡影響紅花多糖能夠誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡,經(jīng)過紅花多糖處理的LoVo細(xì)胞凋亡率均表現(xiàn)升高趨勢，隨著用藥濃度和干預(yù)時間增加，凋亡率也隨之升高，在經(jīng)過 0.5、1.0、1.5 g·L-1不同濃度的紅花多糖處理24 h后，各組細(xì)胞凋亡率分別為(2.65±0.33)%、(9.14±0.27)%、(15.24±0.43)%、(25.45±1.34)%，各濃度紅花多糖與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在同一濃度作用下，干預(yù)48 h后凋亡率進(jìn)一步增加，相比于未加入紅花多糖的對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，并且這種差異與藥物濃度和時間呈正相關(guān)性。圖2流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，SPS能誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。處理LoVo細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為5.94%、12.3%、15.5%，明顯高于對照組凋亡率2.71%的凋亡率。

圖2　流式細(xì)胞儀檢測SPS對LoVo細(xì)胞凋亡的影響

3.4檢測紅花多糖對LoVo細(xì)胞細(xì)胞周期影響不同濃度的紅花多糖作用于結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞24 h后顯示LoVo細(xì)胞表現(xiàn)出具有規(guī)律性的細(xì)胞周期，紅花多糖濃度在0.5、1.0、1.5 g·L-1濃度時干預(yù)LoVo細(xì)胞48 h后,能抑制細(xì)胞的S期和G1/S轉(zhuǎn)換，S和G2期細(xì)胞比例降低，表示SPS能夠阻滯細(xì)胞周期進(jìn)行，S期細(xì)胞比例分別為(39.2±0.7)%，(34.4.9±1.57)%，(29.4±0.99)%，0.5、1.0、1.5 g·L-1的濃度紅花多糖組與對照組相比，出現(xiàn)S期細(xì)胞所占百分比逐漸降低，而濃度為0.5、1.0、1.5 g·L-1時紅花多糖組差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明紅花多糖能調(diào)節(jié)LoVo細(xì)胞的周期，見圖3。

圖3　流式細(xì)胞儀檢測SPS對LoVo細(xì)胞周期的影響

3.5紅花多糖對LoVo細(xì)胞侵襲影響通過Transwell試驗的結(jié)果提示，根據(jù)選取視野計數(shù)各個方向上LoVo細(xì)胞數(shù)，濃度分別為0、0.5、1.0、1.5 g·L-1時，細(xì)胞數(shù)分別為(56.28±0.24)、(50.32±0.45)、(43.78±0.34)、(36.72±0.64)個，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，組間各濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，該實驗結(jié)果表明紅花多糖降低LoVo細(xì)胞侵襲能力，見圖4，5。

3.6紅花多糖作用LoVo細(xì)胞后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)通過RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表達(dá)水平來分析紅花多糖對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)效果影響。與濃度為0 g·L-1對照組相比，濃度為0.5、1.0 g·L-1的紅花多糖干預(yù)LoVo細(xì)胞24 h后，能夠顯著降低調(diào)控凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)，并且隨著紅花多糖的濃度升高可以增強(qiáng)調(diào)控促凋亡相關(guān)基因Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)(見圖6,7)，SPS處理LoVo細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示隨著SPS濃度的升高,Bax蛋白表達(dá)量也逐漸升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)量逐漸降低，數(shù)據(jù)分析顯示，實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對照組LoVo細(xì)胞Caspase-3相對活性為0.31±0.05，SPS組(濃度分別為0.5、1.0、1.5 g·L-1)處理LoVo細(xì)胞48、72 h后，LoVo細(xì)胞Caspase-3相對活性明顯升高。各實驗室組，SPS組Caspase-3相對活性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4　Transwell實驗研究SPS對LoVo細(xì)胞侵襲能力影響

圖5　不同濃度的紅花多糖作用后LoVo細(xì)胞數(shù)量變化

圖6　SPS對LoVo細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3

圖7　SPS對LoVo細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3

4討論

由于近年來國內(nèi)外針對紅花多糖體外作用人結(jié)腸癌細(xì)胞研究較少,本實驗主要針對紅花多糖對人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲作用機(jī)制研究，研究紅花多糖抗腫瘤機(jī)制，為今后紅花多糖廣泛應(yīng)用于臨床結(jié)腸癌治療實驗依據(jù)。

紅花多糖是提取自中藥紅花中，是其主要活性成分,大量實驗研究表明紅花多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抑制血小板聚集等多種作用[2]，紅花多糖抑制紅花多糖抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡可能與細(xì)胞膜上傳導(dǎo)通路或相關(guān)基因作用相關(guān)，在臨床得到廣泛應(yīng)用，由于紅花多糖藥理作用復(fù)雜,目前對其如何促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制仍不清楚,國內(nèi)實驗研究報道紅花多糖可以將肝癌細(xì)胞阻滯在G2周期[3]。本研究主要研究紅花多糖在體外對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲作用，可以為今后正確合理的使用紅花多糖提供依據(jù)，也為明確將紅花多糖應(yīng)用于臨床腫瘤的防治提供可靠的理論依據(jù)。

紅花多糖，作為一種中藥，其來源廣，價格低，毒副作用少，應(yīng)用十分廣泛，是一種具有重大研究價值和應(yīng)用價值的新型抗癌藥物。大量研究實驗證實紅花多糖具有體外抗腫瘤功能和體內(nèi)預(yù)防作用。陶冀等[4]研究認(rèn)為SPS抑制腫瘤作用可能是降低AKT mRNA的表達(dá)，下調(diào)AKT和P-AKT 表達(dá)蛋白量，抑制 AKT通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。由于誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞凋亡的細(xì)胞信號途徑較復(fù)雜，不同類型細(xì)胞的凋亡途徑也不相同。目前對紅花多糖誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不明確，腫瘤形成是機(jī)體細(xì)胞無限制增殖和細(xì)胞凋亡不平衡一種結(jié)果，細(xì)胞凋亡在腫瘤研究中受到很大重視[5]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是紅花多糖抗腫瘤作用的一個重要機(jī)制。但根據(jù)當(dāng)前研究結(jié)果顯示紅花多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用在不同類型細(xì)胞所獲得結(jié)果不同。Reed等[6]研究表明SPS可能抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖進(jìn)而誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，并且呈現(xiàn)明顯的時間與劑量相關(guān)性。根據(jù)大量實驗研究得出結(jié)論，Bax基因可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，Bcl-2基因可顯著降低腫瘤細(xì)胞的凋亡[7]。前期實驗[8-10]結(jié)果認(rèn)為SPS可能作用于 Bcl-2、Bax 基因來抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞途徑是線粒體膜電位途徑來完成的。凋亡抑制基因Bcl-2 與凋亡促進(jìn)基因Bax相互結(jié)合形成異源二聚體[11]，同時 Bcl-2基因與Bax基因的比例可直接決定腫瘤細(xì)胞是否凋亡。Bax基因表達(dá)的蛋白可以同自身構(gòu)成同源二聚體，還可以與 Bcl-2基因表達(dá)的蛋白形成異源二聚體；當(dāng) Bax基因過度表達(dá)，與Bax所構(gòu)成同源二聚體相對增多，一定程度抑制Bcl-2基因的作用，所形成的效應(yīng)是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；反之,當(dāng) Bcl-2基因所表達(dá)蛋白增高時，Bcl-2/Bax所形成的異源二聚體增多可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。Caspase-3屬于半胱氨酸蛋白酶家族一員，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。Caspase蛋白在人體細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，Caspase蛋白活化后將激活整個半胱氨酸蛋白酶家族，因此凋亡一旦發(fā)生，即表現(xiàn)成為Caspase蛋白家族級聯(lián)式反應(yīng)。所有Caspase家族蛋白中，Caspase-3起著凋亡效應(yīng)子作用，接受上游起動信號激活，然后特異性作用于底物使細(xì)胞發(fā)生分子水平改變和形態(tài)學(xué)變化,最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。

本實驗采用RT-PCR及Western blot方法檢測結(jié)果提示SPS作用于結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，可以增強(qiáng)Bax 、Caspase-3mRNA 的表達(dá)量，減低Bcl-2 mRNA 的表達(dá)量，呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性；而由Western blot結(jié)果提示，隨著SPS干預(yù)時間的增加，LoVo細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 基因表達(dá)蛋白水平明顯減少，而Bax、Caspase-3 基因表達(dá)蛋白水平則出現(xiàn)顯著升高。我們可以認(rèn)為在 mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平上SPS可降低LoVo細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)，上調(diào)Bax基因的表達(dá)，這一過程可能與SPS誘導(dǎo)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的機(jī)制有關(guān)。

本研究中MTT結(jié)果表明紅花多糖能夠明顯抑制LoVo細(xì)胞增殖，并具有劑量-時間效應(yīng)關(guān)系。紅花多糖作用細(xì)胞后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。根據(jù)流式細(xì)胞儀所顯示熒光強(qiáng)度來對凋亡細(xì)胞定量分析[14]。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡結(jié)果說明紅花多糖能誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞發(fā)生凋亡，增殖受到抑制，使細(xì)胞分裂停滯。Western blot和RT-PCR實驗結(jié)果分析，紅花多糖降低Bcl-2基因的表達(dá)同時增加Bax、Caspase-3 基因的表達(dá)，從而使 LoVo細(xì)胞發(fā)生凋亡。這提示紅花多糖誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡與調(diào)控Caspase-3、Bax基因高表達(dá)，抑制Bcl-2基因傳導(dǎo)信號通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]李道娟,李倩,賀宇彤.結(jié)直腸癌流行病學(xué)趨勢[J].腫瘤防治研究,2015,42(3):305-306.

[2]吳偉,金鳴,童靜,等.羥基紅花黃色素A緩解脂多糖誘導(dǎo)家兔白細(xì)胞活化的作用[J].藥學(xué)學(xué)報,2011,46(2):153-157．

[3]孫陽,張琪琪,石學(xué)魁,等.紅花多糖誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞增殖阻滯的實驗研究[J]．中國免疫學(xué)雜志,2013,29(12):1269.

[4]陶冀,黎清煒,石學(xué)魁,等.紅花多糖抑制 PI3K/Akt 信號通路誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的研究[J].實用腫瘤學(xué)雜志,2012,26(2):119-124．

[5]Luo Z,Zeng H,Ye Y,et al.Safflower polysaccharide inhibits the proliferation and metastasis of MCF-7 breast cancer cell[J].Mol Med Rep,2015,11(6):4615-4616.

[6]Reed JC.Bcl-2 family proteins[J].Oneogene,1998,17(25):3225.

[7]張曉莉,程翔,劉洋,等.紅花多糖對人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞Bcl-2與 Bax 基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(14):239-244．

[8]Ouyang L,Shi Z,Zhao S,et al.Prgrammed cell death pathway in cancer: a review of apoptosis,autophagy and programmed necrosis[J].Cell Proliferation,2012,45(6):487-499.

[9]Benderska N,Chakilam S,Hugle M,et al.Apoptosis signaling activated by TNF in the lower gastrointestinal tract review[J].Current Pharmaceutical Biotechnology,2012,13(11):2248-2258.

[10] Min LW，Li-Weber M.Targeting apoptosis pathway in cancer by Chinese medicine[J].Cancer Letters,2013,332(2):304-312.

[11] 馬新博,楊婧,陳麗,等.紅花多糖對人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2012,33(24):3700-3701.

[12] Degterev A,Boyce M,Yuan J.A decade of caspases[J].Oncogene,2003,22(53):8543-8567.

[13] 郭立達(dá),焦振霞,宋瑛,等.姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究[J].中國中醫(yī)雜志,2013,38(13):2191-2195.

[14] 石學(xué)魁.紅花多糖誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡及對AKT信號的影響[J].黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,10(6):333-338.

Mechanism of safflower polysaccharide on apoptosis of LoVo cell

SUN Wei,TONG Shi-lun,ZHENG Yong-bin,et al

(DepartmentofGastroenterologySurgery,RenminHospitalofWuhanUniversityKeyLaboratoryofHubeiProvienceforDigestiveSystemDisease，Wuhan,Hubei430060，China)

Abstract:ObjectiveTo study the mechanism of safflower polysaccharide (SPS) on apoptosis of LoVo cell.MethodsThe LoVo cell was treated with different concentrations of SPS (i.e.0.5、1.0、1.5 g·L-1).At 24、48、72 h after intervention,the morphology and state of cell were observed by inverted microscope,the inhibitions of cell proliferation were analysed by MTT assay,and the change of cell cycle phase and cell apoptosis were detected by flow cytometry in Annexin V-FITC/PI.The expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 were detected by RT-PCR,and the expressions of Bax,Bcl-2,Caspase-3 protein were detected by Western-blot.Transwell cell invasion assay was performed to detect the effect of safflower polysaccharide on the invasion ability of colon cancer LoVo cells.ResultsCompared with normal cell,the cells treated with SPS showed typical apoptosis detected by MTT assay.Many cells were floated in medium by inverted microscope,the cell cycle was blocked in phase G1by flow cytometry,and RT-PCR and Western blot both indicated SPS can restrain the Bcl-2 and enhance Bax and Caspase-3.ConclusionsSPS can significantly induce apoptosis,inhibit growth of the LoVo cell,decrease its ability of invasion,and regulate the cycle of cells.The effect may be related to pathways of Bax,Bcl-2,and Caspase-3.

Key words:Carthamus tinctorius;Colonic neoplasms;Neoplasm invasiveness;Apoptosis;Cell proliferation

基金項目:國家自然科學(xué)基金(81372553)

通信作者：童仕倫，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：胃腸道腫瘤防治與研究，E-mail：tongshilun@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.006

(收稿日期：2016-03-22 ,修回日期：2016-05-02)