朱翠翠，張林，孫忠奎，王長(zhǎng)憲（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安7000；泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院，山東泰安7000；泰安時(shí)代園林科技開發(fā)有限公司，山東泰安7000）

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中國(guó)中北部青檀的AFLP分析

朱翠翠1，張林2，孫忠奎3，王長(zhǎng)憲2
（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安271000；2泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院，山東泰安271000；3泰安時(shí)代園林科技開發(fā)有限公司，山東泰安271000）

摘要：為揭示中國(guó)中北部青檀的遺傳多樣性，筆者從貴州、北京、甘肅、江蘇、安徽、山東、河南7省12個(gè)種群收集了31份青檀樣品，對(duì)其進(jìn)行AFLP分析。利用從26對(duì)AFLP引物組合中篩選出的6對(duì)引物對(duì)樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共產(chǎn)生223條譜帶，其中211條為多態(tài)性條帶，比率達(dá)94.26%。結(jié)果顯示中國(guó)中北部的青檀材料之間存在較高的遺傳多樣性，且AFLP技術(shù)可以有效地對(duì)其進(jìn)行分析。31個(gè)樣品的遺傳相似系數(shù)在0.6413～0.9193之間，平均為0.7489，聚類分析結(jié)果顯示樣品首先按照種群聚在一起，但也有交叉。

關(guān)鍵詞：青檀；聚類分析；AFLP；遺傳多樣性

0　引言

青檀（Pteroceltis tatarinowii Maxim.），又名翼樸，為榆科（Ulmaceae）青檀屬（Pteroceltis）落葉喬木，中國(guó)的特有植物，在中國(guó)植物紅皮書中被列入國(guó)家三級(jí)重要保護(hù)對(duì)象，是中國(guó)特有的纖維樹種和鈣質(zhì)土壤的重要指示植物。在中國(guó)皖、隴、貴、蘇、魯、鄂、湘等19省均有生長(zhǎng)。青檀適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱耐濕、耐鹽堿，是石灰?guī)r裸露巖石荒山造林的重要樹種。青檀作為中國(guó)重要的鄉(xiāng)土樹種和綠化樹種，在園林景觀建設(shè)過程中，與喬、灌、草相結(jié)合，不僅可以美化環(huán)境，還可以改善城市小氣候、維持城市生態(tài)系統(tǒng)的平衡，其葉可作為高級(jí)營(yíng)養(yǎng)型飼料添加劑，其檀皮制作的宣紙一直被書法家和畫家視作珍品，其木材堅(jiān)硬致密也可以用來(lái)制作家具，具有很高的應(yīng)用價(jià)值［1-4］。

由Vos等［5］發(fā)明的AFLP（Amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）分子標(biāo)記技術(shù)是通過不同長(zhǎng)度的限制性內(nèi)切酶片段檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種分子標(biāo)記方法。與其他分子標(biāo)記方法相比，AFLP技術(shù)快速、穩(wěn)定、高效，并且DNA用量少，檢測(cè)效率高［6-8］。該技術(shù)自出現(xiàn)起就被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性的研究，如銀杏［9］、棗樹［10］、秋子梨［11］等。研究遺傳多樣性對(duì)于植物資源利用、保護(hù)及品種選育等有重要意義［12］。

由于人為的破壞和大范圍的人工繁殖栽培，野生青檀日益減少，導(dǎo)致青檀遺傳多樣性日益減少。但目前，有關(guān)青檀遺傳多樣性的研究有零星報(bào)道，李曉紅等［13］用ISSR對(duì)來(lái)自廣東、福建、浙江、安徽等27個(gè)自然種群的青檀樣品進(jìn)行了初步分析，林巧紅［14］對(duì)山東靈巖寺、佛峪以及棗莊青檀寺野生青檀資源進(jìn)行了調(diào)查與評(píng)價(jià)等。筆者對(duì)來(lái)源于北京、山東、安徽等地12個(gè)種群的青檀資源進(jìn)行AFLP分析，意在揭示中國(guó)中北部青檀的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，為青檀資源保護(hù)、品種改良奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1植物材料

供試樣品來(lái)自于北京昌平、甘肅文縣、安徽涇縣、江蘇南京、貴州貴陽(yáng)、山東濟(jì)南靈巖寺等地12個(gè)種群。在各個(gè)種群內(nèi)隨機(jī)選取正常、無(wú)病害的植株嫩葉進(jìn)行采集，放入裝有變色硅膠的塑料袋中進(jìn)行快速干燥。表1為樣品采集地點(diǎn)和編號(hào)。

表1　樣本材料編號(hào)及來(lái)源

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取改良CTAB法提取基因組DNA并檢測(cè)純度和濃度。

1.2.2AFLP試驗(yàn)

（1）酶切。對(duì)所選樣品采用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切（ferments酶）：

酶切體系（20 μL）為：10×Buffer tango 4 μL （fermentas）；EcoRⅠ（10 U/μL）0.4 μL；MseⅠ（10 U/μL）0.4 μL；模板DNA約200 ng；補(bǔ)ddH2O至20 μL。

酶切反應(yīng)條件為37℃，3 h，65℃，3 h。

（2）連接。連接體系（20 μL）為：10×T4 Buffer 2 μL；EcoR I Adaptor（50 μmol/L）1 μL；MseⅠAdaptor （50 μmol/L）1 μL；T4 ligase 0.4 μL（5 U/μL）酶切產(chǎn)物10 μL；補(bǔ)ddH2O至20 μL。16℃過夜。

（3）預(yù)擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×Buffer 2 μL；10 mmol/L dNTPs0.4μL；5 U/μLTaq酶0.2μL；E000.5μL（20μmol/L）；M000.5μL（20μmol/L）；連接模板2μL；加ddH2O至20μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s；50℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，26個(gè)循環(huán)。

（4）選擇性擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×Buffer 2 μL；10 mmol/L dNTPs 0.4 μL；5 U/μL Taq酶0.2 μL；Eprimer1 μL（20 μmol/L）；Mprimer1 μL（20 μmol/L）；模板DNA2 μL；加ddH2O至20 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性35 s，65℃復(fù)性35 s（每循環(huán)降低0.7℃），72℃延伸1 min，12個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，23個(gè)循環(huán)。

（5）變性電泳。PCR產(chǎn)物加上上樣緩沖液，94℃變性10 min后進(jìn)行PAGE分析，銀染后觀察。

1.2.3數(shù)據(jù)分析利用Quantity One軟件將31個(gè)樣品、6對(duì)引物的AFLP PAGE電泳圖根據(jù)無(wú)帶和有帶情況轉(zhuǎn)化為0、1數(shù)據(jù)矩陣。采用POP軟件計(jì)算個(gè)體遺傳距離和相似系數(shù)，并使用NTSYS軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品AFLP多態(tài)性及擴(kuò)增效率

通過篩選，筆者在26對(duì)AFLP引物組合中共篩選出6對(duì)多態(tài)性引物，信號(hào)強(qiáng)度一致、條帶分布均勻。6對(duì)引物共產(chǎn)生223條帶（見表2），其中211條多態(tài)性條帶，所占比例（PPB）達(dá)94.62%，平均每對(duì)產(chǎn)生35.2條。引物組合E35M83、E40M55、E41M64、E43M54、E76M47的多態(tài)性都在90%以上，引物組合E35M83最高達(dá)98.36%，引物組合E86M85最低為75%。圖1顯示了12個(gè)青檀種群31個(gè)樣品的遺傳圖譜，幾乎所有種群的樣品都能被區(qū)分，這說明青檀具有豐富的遺傳變異。AFLP技術(shù)可以有效地用于中國(guó)中北部青檀的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，且多態(tài)性和可重復(fù)性都比較高。

表2　引物名稱及多態(tài)性條帶比較

圖1　引物E40M55的AFLP圖譜

2.2相似性分析

圖2顯示了31個(gè)青檀樣本的遺傳相似系數(shù)。結(jié)果顯示，31個(gè)青檀樣本之間的遺傳相似系數(shù)在0.6413～0.9193之間，表明中國(guó)中北部青檀樣品之間存在一定的遺傳差異。北京檀峪村樣品18、19之間最大為0.9193，說明兩者變異最小，遺傳距離最近。而檀峪村樣品18和文縣樣品26之間最小為0.6413，說明兩者變異最大，遺傳距離最遠(yuǎn)。對(duì)于同一分布區(qū)的青檀樣品而言，來(lái)自北京的樣品18和19之間遺傳相似系數(shù)最大0.9193，來(lái)自甘肅文縣的樣品26和30遺傳相似系數(shù)最小0.6906，這說明同一個(gè)種群的青檀樣品之間也存在一定程度上的遺傳差異性。

2.3不同種群青檀的聚類分析

如圖3聚類圖顯示，以0.740為域值，供試青檀樣品可分為3類。第Ⅰ類包括青陽(yáng)（1號(hào)）到文縣（30號(hào)）共17個(gè)樣品，安徽（青陽(yáng)、涇縣、淮北大方寺）、南京（燕子磯）、山東（曲阜、濟(jì)南檀抱泉）以及甘肅文縣的樣品被歸到第Ⅰ類。第Ⅱ類包括北京、濟(jì)南靈巖、河南的樣品共11個(gè)。山東泰安東平（31號(hào)）被歸到第Ⅲ類。以0.755為域值，供試青檀樣品分為5亞類。第Ⅰ亞類包括安徽（青陽(yáng)、淮北大方寺、涇縣）的7個(gè)樣品和南京燕子磯的3個(gè)樣品以及山東曲阜的1個(gè)樣品。甘肅文縣的5個(gè)樣品以及檀抱泉的1個(gè)樣品構(gòu)成第Ⅱ亞類。來(lái)自貴州花溪的5個(gè)樣品、北京的3個(gè)樣品、靈巖的4個(gè)樣品構(gòu)成第Ⅲ亞類。河南南召（17號(hào)）和泰安東平（31號(hào)）各成一類。東平（31號(hào)）、河南（17號(hào)）樣品過少，聚類結(jié)果有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。從聚類結(jié)果上看，同一種群內(nèi)青檀具有一定的遺傳多樣性，而不同種群青檀的遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近在地域范圍上呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，但并不是很明顯，這說明青檀種質(zhì)資源遺傳距離的遠(yuǎn)近與地理距離并沒有顯著相關(guān)關(guān)系。

3　討論

筆者利用AFLP分子標(biāo)記在一定程度上有效地揭示了中國(guó)中北部青檀的遺傳多樣性。把分子水平以及生態(tài)環(huán)境結(jié)合起來(lái)評(píng)價(jià)物種的遺傳多樣性對(duì)于人們合理地利用和保護(hù)中國(guó)青檀資源具有重要意義［15-17］。到現(xiàn)在為止，有關(guān)青檀遺傳多樣性的工作開展不多，限制了青檀種質(zhì)資源的遺傳改良和保護(hù)工作。Chai等［18］采用ISSR技術(shù)對(duì)皖、豫、蘇、魯4省5個(gè)種群的樣品進(jìn)行分析，顯示青檀種群內(nèi)和種群外都具有較高的遺傳多樣性；李建華等［19］對(duì)湖北省大貴寺國(guó)家森林公園不同海拔高度進(jìn)行ISSR分析結(jié)果表明，遺傳關(guān)系與海拔相關(guān)；林巧紅［14］對(duì)來(lái)自青檀寺、佛峪、和靈巖寺3個(gè)種群進(jìn)行SRAP分析。本研究從貴州、山東、江蘇、安徽、北京、河南收集了31份青檀資源，對(duì)中國(guó)中北部的青檀資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。AFLP結(jié)果顯示，6對(duì)引物共擴(kuò)增出223條多態(tài)性帶，百分比（PPB）達(dá)94.62%，說明用AFLP標(biāo)記可以有效的分析青檀遺傳多樣性。從結(jié)果上看貴陽(yáng)與北京檀峪村、靈巖寺之間遺傳相似性相對(duì)較大，這可能和人為活動(dòng)有關(guān)。對(duì)中國(guó)中北部不同種群青檀樣品進(jìn)行AFLP分析的聚類結(jié)果表明，盡管親緣關(guān)系的地域趨勢(shì)在一定的地域范圍內(nèi)呈現(xiàn)出來(lái)，但總的來(lái)看，遺傳距離的遠(yuǎn)近并沒有顯著的地域相關(guān)性。Fischer等［20］認(rèn)為，當(dāng)遺傳漂移存在時(shí)，遺傳距離的遠(yuǎn)近和地理距離就沒有顯著的相關(guān)性，只有起主導(dǎo)作用的是基因流時(shí)，兩者才會(huì)呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。按Fischer的觀點(diǎn)，可以這樣推測(cè)，長(zhǎng)期以來(lái)由于青檀具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，青檀的野生資源遭到人為的過度挖掘而逐漸減少，野生資源日益匱乏，種群也逐漸減少，而產(chǎn)生一定的遺傳漂移。青檀的相互引種、生活史類型、繁殖方式、交配系統(tǒng)以及基因流，都可能是形成青檀種群內(nèi)部和青檀種群間遺傳變異差別的主要原因。

圖2　不同種群青檀31個(gè)樣品遺傳相似系數(shù)

圖3　不同地區(qū)青檀聚類圖

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AFLP Analysis of Pteroceltis tatarinowii in the North of Central China

Zhu Cuicui1, Zhang Lin2, Sun Zhongkui3, Wang Changxian2
（1College of Forestry, Shandong Agricultural University, Tai’an 271010, Shandong, China;2Taishan Forestry Science Institute, Tai’an 271000, Shandong, China;
3Tai’an Shidai Technology Development Limited Company, Tai’an 271000, Shandong, China）

Abstract:In order to study the genetic diversity of Pteroceltis tatarinowii in the north of central China, 31 samples were collected from 12 populations from 7 provinces（Guizhou, Beijing, Gansu, Jiangsu, Anhui, Shandong and Henan）and AFLP analysis was conducted. A total of 223 bands were generated from 6 primer combinations screened from 26 primer combinations and 211 of those bands showed polymorphism, the polymorphic ratio（PP）was up to 94.26%. The results showed that a high genetic diversity was existed among Pteroceltis tatarinowii samples from the north of central China and AFLP analysis was effective. The genetic similarity coefficient was in the range of 0.6413 to 0.9193, with an average value of 0.7489. And the results of cluster analysis showed that the samples were clustered together according to the population, but there were intersections between the populations.

Key words:Pteroceltis tatarinowii; Cluster Analysis; AFLP; Genetic Diversity

中圖分類號(hào)：S688

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas16010002

基金項(xiàng)目：2014年山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目“青檀種質(zhì)創(chuàng)新利用與新品種培育”（魯科字［2014］96號(hào)）。

第一作者簡(jiǎn)介：朱翠翠，女，1991年出生，德州齊河人，碩士研究生，研究方向：園林植物。

通信地址：271000山東省泰安市泰山區(qū)岱宗大街61號(hào)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)北校區(qū)林學(xué)院404，E-mail：zhucuicuitt@163.com。 271000山東省泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院，E-mail：changxianwang@163.com。

通訊作者：王長(zhǎng)憲，男，1959年出生，山東平陰人，研究生導(dǎo)師，研究員，研究方向：園林植物遺傳育種。

收稿日期：2016-01-04，修回日期：2016-03-05。