張祥永,任靜,馬彥霞,郁繼華

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅 蘭州　730070；2.?？诮?jīng)濟學院，海南 ?？凇?71127)

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微生物菌劑對牛糞堆肥中酶活性的影響

張祥永1，2,任靜1,馬彥霞1,郁繼華1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅 蘭州730070；2.?？诮?jīng)濟學院，海南 ?？?71127)

摘要：【目的】 明確牛糞堆肥接種菌劑后在高溫好氧堆肥過程中幾種酶活性的動態(tài)變化，通過酶學角度揭示高溫好氧堆肥的生物化學機理，為堆肥腐熟綜合評價指標體系及腐熟閾值的制定提供科學依據(jù).【方法】 以牛糞為堆肥原料，通過接種兩種微生物菌劑處理，分析高溫堆肥堆體溫度與酶活性的變化特征.【結(jié)果】 接種菌劑有效地增加了堆肥溫度，延長了高溫期，且使脲酶、纖維素酶、蛋白酶活性水平與峰值得到明顯提高.堆肥過程中過氧化氫酶與脲酶活性變化基本一致，后期高于前中期.多酚氧化酶活性呈不斷下降并逐步穩(wěn)定的趨勢.堆肥前期纖維素酶出現(xiàn)峰值，不接種菌劑的處理(CK)蛋白酶活性中后期穩(wěn)定升高.【結(jié)論】 接種菌劑纖維素酶活性與堆肥溫度呈極顯著負相關(guān)性(P<0.01)；多酚氧化酶兩者則呈顯著正相關(guān)性(P<0.05).接種菌劑2對過氧化氫酶、脲酶活性與堆體溫度于不同階段表現(xiàn)出顯著(或極顯著)相關(guān)性.CK的蛋白酶活性與堆體溫度有極顯著負相關(guān)性(P<0.01)，表明酶活性大小可作為牛糞堆肥過程中腐熟程度的生化評定指標.

關(guān)鍵詞：酶活性；接種菌劑；溫度；牛糞堆肥

隨著畜禽業(yè)規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷擴大，畜禽糞便對自然環(huán)境造成的嚴重污染已不容忽視，成為阻礙養(yǎng)殖業(yè)集約化發(fā)展的新問題[1].堆肥法是解決這一問題既經(jīng)濟又有效的途徑之一[2-4].高溫好氧堆肥技術(shù)是一種集糞便處理和資源再生利用于一體的生物處理方法，在國內(nèi)外倍受關(guān)注，腐熟過程不對環(huán)境造成二次污染、產(chǎn)品肥效長，并使土壤結(jié)構(gòu)得到改善[5].

堆肥過程的實質(zhì)是在微生物及其分泌的酶參與下進行的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，包括原始有機物質(zhì)降解為簡單物質(zhì)，再合成腐殖化物質(zhì)的生物化學過程[6-9]，因此，對堆肥進程中酶活性變化的研究，有利于從生物化學方面了解堆肥的進程，進而推斷腐解進程和機理.堆肥前期主要以礦質(zhì)化作用占優(yōu)勢，而后期則以腐殖質(zhì)化作用為主；水解酶使有機物得到分解，其活性的變化可以推斷礦質(zhì)化進程[9]；而氧化還原酶對合成新的穩(wěn)定的有機化合物起到催化作用，且活性的變化可以推斷堆肥過程腐殖化進程和強度[10].至今人們對畜禽糞便堆肥的研究多限于條件的控制(溫度、氧氣、C/N、PH等)[12-14]、微生物接種[15-16]和工藝參數(shù)的選擇方面[17-18]，而在堆肥過程中依據(jù)酶活性變化規(guī)律判斷堆肥進程以及外源菌劑對酶的作用的研究較少[19-21].鑒于此，本試驗系統(tǒng)研究了牛糞堆肥接種菌劑后在高溫好氧堆肥過程中幾種酶活性的動態(tài)變化，通過酶學角度揭示高溫好氧堆肥的生物化學機理，以期為今后農(nóng)業(yè)廢棄物的堆肥化過程監(jiān)控提供理論參考依據(jù).

1材料與方法

1.1試驗材料

牛糞：試驗用新鮮牛糞作為堆肥原料，取自甘肅農(nóng)業(yè)大學動物與科學技術(shù)學院奶牛養(yǎng)殖場，原料基本理化性狀如表1.

表1　堆肥原料的基本理化性狀(烘干樣)

菌劑：試驗接種菌劑來源分別為南京農(nóng)業(yè)大學提供的菌劑1(含8種纖維素分解細菌、真菌、放線菌)；甘肅科學院生物所提供的菌劑2，有效活菌數(shù)>80億cuf/g.菌劑1為固體狀，菌劑2為液態(tài)狀.

1.2試驗方法

堆肥試驗于室外自然條件下進行，人工翻堆每3天1次.試驗設(shè)3個處理，不接種菌劑的對照、接種菌劑1和菌劑2的處理，接種菌劑的量按各菌劑的使用方法進行.每個處理堆體體積約1.5 m3,呈高為1 m的錐體，設(shè)3次重復.分別于第0、1、3、7、14、21、28、35、42、49 天，采用五點法原則，在堆體表層10 cm深處取樣.將5點樣品充分混勻，風干粉碎后過篩待用.

1.3測定指標與方法

堆制開始后，每天下午17∶00～18∶00時，測量各堆體的溫度.酶活性測定參照關(guān)松蔭[22]的方法.過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法，脲酶活性測定采用苯酚鈉比色法，蛋白酶活性測定采用茚三酮比色法，纖維素酶活性測定采用硝基水楊酸比色法，多酚氧化酶活性測定采用紫色沒食子素比色法.

2結(jié)果與分析

2.1過氧化氫酶活性的變化

過氧化氫酶是一種保護酶，其活性變化與堆肥過程中微生物數(shù)量及有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化速率密切相關(guān)[22].由圖1可知，接種菌劑1的處理在21 d前過氧化氫酶活性逐漸升高，于第21天時活性達到最高值42.78 (0.002 mol/(L·g·20 min))；隨后隨著堆體溫度的持續(xù)降低，其活性呈緩慢下降趨勢，直至堆肥結(jié)束時略有上升.接種菌劑2處理的過氧化氫酶活性于前中期逐步提高，第35天時達到最大值39.45(0.002 mol/(L·g·20 min))低于菌劑1處理的最大值；但此時期過氧化氫酶活性與堆體溫度成顯著負相關(guān)(r=-0.904，n=6，P<0.05)，即過氧化氫酶活性隨著堆肥高溫期的結(jié)束而呈增加趨勢.CK處理與接種菌劑處理的過氧化氫酶活性變化略有不同，在整個堆肥過程中，其最大值39.86(0.002 mol/(L·g·20 min))出現(xiàn)在堆肥結(jié)束.綜合3個處理堆肥前后過氧化氫酶活性來看，各處理間差值變化較小，分別為菌劑1處理3.4(0.002 mol/(L·g·20 min))、菌劑2處理1.3(0.002 mol/(L·g·20 min))與CK處理4.7(0.002 mol/(L·g·20 min))，說明接種菌劑并未能提高堆肥過程中的過氧化氫酶活性.

圖1　堆肥過程中過氧化氫酶活性變化Fig.1　Dynamic of catalase activity during composting

2.2脲酶活性的變化

脲酶的作用是將堆肥物料中的尿素水解成二氧化碳與氨，其與氮代謝密切相關(guān)[23]，而氮素形態(tài)的變化對物料氮素有效性有直接影響.本試驗研究結(jié)果表明(圖2)，堆肥初期，3個處理的脲酶活性均隨著溫度的升高而升高.于第28天，CK處理的脲酶活性達到最高值175.25 mg/(g·d)，此后逐漸降低.接種菌劑1處理堆肥第7天時脲酶活性升到峰值161.76 mg/(g·d)；堆肥中后期，脲酶活性不斷上升，至堆肥結(jié)束，其活性值達到最大值308.66 mg/(g·d)；整個堆肥過程中，接種菌劑2處理的脲酶活性變化與接種菌劑1基本相同，但其值均高于接種菌劑1處理，第49天時活性最大值為385.39 mg/(g·d).在中后期內(nèi)，菌劑2處理脲酶活性與溫度的相關(guān)系數(shù)r=-0.969(n=5，P<0.01)，表明堆肥溫度的持續(xù)降低對脲酶活性的穩(wěn)定

圖2　堆肥過程中脲酶活性變化Fig.2　Dynamic of urease activity during composting

升高影響較大.從整體分析，接種菌劑處理的脲酶活性明顯高于CK處理，說明菌劑的添加可在很大程度上提高堆肥中的脲酶活性，進而使含氮物質(zhì)得到加速礦化.堆肥結(jié)束后，接種菌劑的處理脲酶活性達到原始值的兩倍以上，而在堆肥前期脲酶活性均較低，這是由堆肥進行時有機物碳化分解在前，氮素硝化作用在后決定的.

2.3多酚氧化酶活性的變化

多酚氧化酶是一種復合性酶，它可將環(huán)境中的酚類物質(zhì)氧化成醌類，隨后醌類又會與堆肥中的氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物及糖類等化合形成分子量不同的色素與有機質(zhì)，完成堆肥中芳香族化合物的循環(huán)[24-26].因此，多酚氧化酶與酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成最初腐殖酸分子密切相關(guān).由圖3可以看出，堆肥前3 d堆體溫度升高，多酚氧化酶活性反而下降.第3天接種菌劑1處理達到谷值0.073 mg/(g·2h)，第7天又出現(xiàn)峰值0.117 mg/(g·2h)，隨后至堆肥結(jié)束多酚氧化酶活性不斷下降.接種菌劑2處理的多酚氧化酶活性于整個堆肥過程中，基本呈下降趨勢.接種菌劑處理的多酚氧化酶活性與堆肥溫度密切相關(guān)，菌劑1處理在堆肥第0～7天二者的變化趨勢相反，第7～49天酶活與溫度呈顯著正相關(guān)(r=0.776，n=7，P<0.05)，菌劑2處理于第14～49天時，酶活與溫度也呈顯著正相關(guān)(r=0.902，n=6，P<0.05)，即接種菌劑的處理降溫期多酚氧化酶活性隨著堆體溫度的降低而下降.表明堆肥中后期菌劑會影響物料的腐殖化進程強度，但同時也促進了堆肥腐殖化的穩(wěn)定進行.

圖3　堆肥過程中多酚氧化酶活性變化Fig.3　Dynamic of polyphenoloxidase activity during composting

2.4纖維素酶活性的變化

在堆肥碳循環(huán)中纖維素酶起著極重要的作用，牛糞中含有大量較難分解的木質(zhì)纖維素，而纖維素酶則通過參與纖維素內(nèi)水解作用，最終將木質(zhì)素、纖維素及半纖維素等分解為小分子的葡萄糖.因此，堆肥過程中纖維素含量的變化嚴重影響著堆肥腐殖化進程.本試驗堆肥前期(0～3 d)，接種菌劑處理的堆體溫度上升時，纖維素酶活性也隨著升高；菌劑1處理酶活最大值達到39.26 mg/(g·d)，菌劑2處理酶活最大值為49.74 mg/(g·d)，這一時期纖維素大量分解；此后進入降溫期，于第21天接種菌劑處理纖維素酶活性均出現(xiàn)谷值14.83 mg/(g·d)(菌劑1處理)、21.79 mg/(g·d)(菌劑2處理)；至堆肥結(jié)束纖維素酶活性緩慢升高.從整個堆肥過程來看，第21～49天時，接種菌劑1處理纖維素酶活性與溫度呈極顯著負相關(guān)(r=-0.998，n=5，P<0.01)，菌劑2處理兩者的變化表現(xiàn)出極顯著負相關(guān)(r=-0.970，n=5，P<0.01)，表明堆體溫度的下降極有利于物料中木質(zhì)素的分解.相對于接種菌劑的處理，CK處理的纖維素酶活性在堆肥前期隨著物料中粗、細纖維的不斷分解呈下降過程，至堆體溫度高峰時形成最低點，隨后逐漸升高且略高于初始酶活性值，于堆肥低溫期纖維素酶活性又緩慢下降，整個過程與接種菌劑處理恰好相反，說明接種菌劑后完全改變了堆肥中原有纖維素酶的作用機理.

圖4　堆肥過程中纖維素酶活性變化Fig.4　Dynamic of cellulase activity during composting

2.5蛋白酶活性的變化

堆肥物料中有機態(tài)氮降解為無機態(tài)氮的過程是由蛋白酶催化的，蛋白酶活性越高，則堆肥中可利用的無機態(tài)氮含量越豐富.其離體活性可參與環(huán)境氮循環(huán).抑制蛋白酶活性的因素包括有機污染物、重金屬以及較差的堆肥pH值，所以蛋白酶活性變化反映了堆肥環(huán)境質(zhì)量的好壞程度.由圖5可以看出，接種菌劑2處理的蛋白酶活性變化在堆肥初期大幅上升，形成酶活性高峰，峰值為20.36 mg/(g·d)，緊跟著出現(xiàn)谷值11.57 mg/(g·d)，峰谷值差異極大；第0～21天菌劑2處理的蛋白酶活性始終高于CK，表明接種菌劑2對堆肥蛋白酶活性的影響主要在堆肥升溫期及高溫期.菌劑1處理的蛋白酶活性于堆肥過程中變化相對較小，總體呈先升后降再升高的趨勢.第3天后，CK處理的蛋白酶活性保持上升狀態(tài)，且與堆體溫度表現(xiàn)出極顯著負相關(guān)性(r=-0.898，n=7，P<0.01)，說明溫度對未接種菌劑處理的蛋白酶活性影響較大.

圖5　堆肥過程中蛋白酶活性變化Fig.5　Dynamic of protease activity during composting

3討論

堆肥過程是一個綜合的、復雜的生化過程，酶活性大小是反映堆肥過程中礦質(zhì)化過程和腐殖化過程生物化學進程的很好指標[28].堆肥發(fā)酵中不同生物化學反應(yīng)的方向與強度，以及物料微生態(tài)環(huán)境對各種酶反應(yīng)的脅迫與誘導均可通過相應(yīng)酶活性變化來表現(xiàn).在畜禽糞便堆肥過程中對不同堆肥時期的特征性酶的種類及其活性變化來反映堆肥演進過程的研究報道并不多.本試驗中，接種菌劑處理與CK處理的過氧化氫酶活性于堆肥前后變化均較小，這與倪治華等[27]豬糞堆肥過程過氧化氫酶活性的變化不同，但與梁東麗等[28]及Marx等[29]的研究結(jié)果相一致，這可能與接種微生物數(shù)量及堆肥內(nèi)環(huán)境引起微生物繁殖等因素緊密相關(guān).盡管對過氧化氫酶活性這種變化的機理尚存疑問，但其與部分微生物的活動以及微生物種群之間的互作一定存在密切關(guān)聯(lián).在整個堆肥過程中接種菌劑處理的多酚氧化酶活性幾乎都是低于CK處理，由于多酚氧化酶參與的是腐殖質(zhì)中芳香族化合物的轉(zhuǎn)化，與堆肥的腐熟度呈負相關(guān)[30]，因此接種兩種菌劑均可加快堆肥腐熟進程.馬瑛等[31]研究發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶可表征腐殖質(zhì)中芳香族有機化合物的轉(zhuǎn)化，其酶活性在堆肥過程中逐漸降低，與堆肥的腐熟度成反比，這與本試驗接種菌劑處理的研究結(jié)果一致.CK處理蛋白酶活性則表現(xiàn)出完全相反的變化，說明接入菌劑中分泌蛋白酶的微生物種群與原有微生物之間的互作協(xié)調(diào)能力較低.但根據(jù)多酚氧化酶與蛋白酶的變化趨勢可認為，牛糞堆肥過程中有機物質(zhì)首先發(fā)生氧化分解，隨后才是含氮化合物的分解.此結(jié)果將為有機物發(fā)酵中有益微生物的定向培養(yǎng)與堆肥化學組分控制的定向發(fā)展提供理論依據(jù)[32-34].接種菌劑處理的纖維素酶活性在堆肥前期升高，而后下降再略有增加，此過程與譚小琴等[35]豬場廢水堆肥纖維素酶活性的變化大致相同.纖維素酶是由多種微生物群體分泌所得，包括嗜熱、中溫與嗜冷微生物，堆肥進程中因菌劑的添加，延長了高溫期，使中溫與嗜冷微生物大量死亡或休眠，導致進入高溫期不久纖維素酶活性大幅降低.

梁東麗等[28]在豬糞高溫堆肥過程中對纖維素活性、蔗糖酶活性、脲酶、多酚氧化酶、脫氫酶及過氧化氫酶活性與堆肥高溫期進行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明過氧化氫酶活性、多酚氧化酶活性與堆肥溫度成極顯著正相關(guān)，但在本試驗中，接種菌劑2處理的過氧化氫酶活性與溫度是呈顯著負相關(guān)性的，這可能與堆肥方式、接種菌劑種類的不同有關(guān)；而脲酶與堆肥溫度成極顯著負相關(guān)，這與本試驗中接種菌劑2處理的研究結(jié)果相一致.

4結(jié)論

1)接種菌劑有效地增加了堆肥發(fā)酵溫度，使高溫期延長，且部分酶活水平與峰值(脲酶、纖維素酶、蛋白酶)得到明顯提高.

2)堆肥有機物的分解與生成是在不同酶不同階段參與下起作用的，因此酶活性的大小各時期也是有差異的.在整個堆肥過程中，接種菌劑后過氧化氫酶與脲酶活性變化基本一致，總體呈現(xiàn)上升趨勢，但堆肥結(jié)束接種菌劑處理的脲酶活性是初始值的兩倍以上；多酚氧化酶則與前兩者相反，酶活性值逐漸降低，其中菌劑1處理于堆肥第7天出現(xiàn)峰值；纖維素酶高峰值出現(xiàn)在堆肥前期，中期活性較低，至后期活性又增加；接種菌劑2蛋白酶活性有高峰值產(chǎn)生，CK處理蛋白酶活性中后期穩(wěn)定升高，菌劑1處理中后期酶活性始終低于CK處理，而菌劑2處理只于后期略低于CK處理.

3)在第21～49天接種菌劑纖維素酶活性與堆肥溫度呈極顯著負相關(guān)性(P<0.01)；第14～49天多酚氧化酶兩者則呈顯著正相關(guān)性(P<0.05).接種菌劑2過氧化氫酶、脲酶活性與堆體溫度在不同階段表現(xiàn)出顯著(或極顯著)相關(guān)性.CK處理的蛋白酶活性與堆體溫度在第3～42天有極顯著負相關(guān)性(P<0.01).說明接種菌劑能有效促進堆肥的生物化學進程，且菌劑2的作用較菌劑1顯著.

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(責任編輯趙曉倩)

Effects of microbial agents on enzymes activities during cow manure composting

ZHANG Xiang-yong1,2,REN Jing1,MA Yan-xia1,YU Ji-hua1

(1.College of Horticulture,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；2.Haikou College of Economics,Haikou 571127,China)

Abstract：【Objective】 This paper aims to clarify the dynamic changes of some enzymes activities in the thermophilic aerobic composting process after cow manure compost was inoculated,and reveal the biochemistry mechanism of thermophilic aerobic compost from the perspective of enzymology,which could provide theoretical reference basis for establishing comprehensive assessing index system and determining maturity threshold in cow manure compost.【Method】 Using the cow manure as the raw material of composts and two microbial agents were inoculated,analyzing change features of temperature and enzymatic activities of the thermophilic aerobic composts.【Result】 The results showed that adding microbial effectively enhanced the composting temperature,prolonged high temperature period and significantly increased urease,cellulose and protease activities and peaks,compared with those in CK treatment without inoculating microbial inoculum.In the composting process,activity changes of catalase and urease were basically consistent,which was higher in the anaphase than in the premetaphase.Polyphenol oxidase continuously declined and gradually was stable.In the prophase of composting,cellulose activity reached its peak.Proteinase activity in CK stably increased in midanaphase.【Conclusion】 Cellulose activity treated with microbial inoculum presented significantly negatively correlated (P<0.01) with compost temperature,however,the correlation between polyphenol oxidase and compost temperature was positive (P<0.05).Microbial inoculum 2 showed significant (or extremely significant) correlation between catalase,urease activites and pile temperature at different stages.Proteinase activity in CK was significantly negatively correlated with pile temperature (P<0.01),indicating that the enzymatic activities could act as biochemical assessment parameter for maturity in cow manure composting process.

Key words：enzyme activities;inoculant;temperature;cow manure compost

通信作者：郁繼華，男，教授，博導，主要從事蔬菜生理和設(shè)施栽培方面的研究.E-mail:yujihua@gsau.edu.cn

基金項目：農(nóng)業(yè)部行業(yè)專項“西北非耕地園藝作物栽培基質(zhì)優(yōu)化配制技術(shù)與產(chǎn)業(yè)示范”(201203001)；農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)資金項目“國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)體系”(CARS-25-C-07)；甘肅省級重大專項“玉米秸桿基質(zhì)循環(huán)利用技術(shù)研究與示范”(1002FKDA038).

收稿日期：2015-03-15；修回日期：2015-05-28

中圖分類號：S 144

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)03-0065-07

第一作者：張祥永(1982-)，男，碩士研究生，主要從事園林植物與觀賞園藝的研究.E-mail:67644039@qq.com