劉　帥，孫富華，江依柔，謝興益

(四川大學(xué) 高分子科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610065)

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氨烷基磷酸鈉及其改性的羥基磷灰石對(duì)MG63細(xì)胞功能的影響*

劉帥，孫富華，江依柔，謝興益

(四川大學(xué) 高分子科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610065)

摘要：氨烷基磷酸鈉(AAP-n-Na, n=2～6，為氨烷基的碳原子數(shù))可用于制備羥基磷灰石(HA)膠體，是新型的HA表面改性劑，我們的前期研究已證實(shí)其無(wú)細(xì)胞毒性。進(jìn)一步研究APP-n-Na及其改性HA(Cn-HA)對(duì)成骨樣細(xì)胞MG63功能的影響。研究結(jié)果表明，在0.1%濃度下，n=3,4,5的APP-n-Na對(duì)MG63細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OCP)的表達(dá)無(wú)不良影響，和陰性對(duì)照(空白培養(yǎng)基)的表達(dá)水平一致；所有APP-n-Na對(duì)礦化結(jié)節(jié)的形成無(wú)不良影響。Cn-HA的浸提液(0.1g/mL，以培養(yǎng)基為浸提介質(zhì))對(duì)ALP的表達(dá)和生物礦化均無(wú)不良影響，和對(duì)照樣(未改性HA和空白培養(yǎng)基)相比無(wú)顯著差異。研究預(yù)示APP-n-Na及其改性的HA用于骨修復(fù)材料是安全的。

關(guān)鍵詞：氨烷基磷酸；羥基磷灰石；成骨細(xì)胞；堿性磷酸酶；骨鈣素；鈣化結(jié)節(jié)

0引言

天然骨含有60%～70%的無(wú)機(jī)成分，主要為羥基磷灰石(HA)。因此HA在骨替代和修復(fù)材料中得到了廣泛的應(yīng)用，比如作為人工髖關(guān)節(jié)的涂層來(lái)提高相容性[1]，作為頜面外科修復(fù)用的支架材料[2]，以及作為骨組織替代材料[3-4]等等。但單純的HA性脆，不能用于承力骨的部位。為此，許多研究者開(kāi)發(fā)了HA/聚合物納米復(fù)合材料[5-8]，期望模仿天然骨的力學(xué)和生物學(xué)性能。

HA納米粒子在聚合物中的良好分散以及兩相界面間強(qiáng)的相互作用力是得到性能優(yōu)異的骨修復(fù)用納米復(fù)合材料的關(guān)鍵[9-10]。迄今為止，這兩個(gè)問(wèn)題均未得到很好的解決，因?yàn)橛H水性的HA很難均勻分散在疏水的聚合物材料中(如聚乳酸、聚己內(nèi)酯等)。廣大的研究者對(duì)HA進(jìn)行表面改性，接上了烷基鏈[11-12]、聚乙二醇鏈[7，13]、聚酯齊聚物[14-16]等等。這些方法對(duì)改進(jìn)HA在聚合物中的分散性有一定的作用，但所得的復(fù)合材料與天然骨相比，無(wú)論是力學(xué)還是生物學(xué)性能均有很大差距。

我們最近開(kāi)發(fā)了一類(lèi)氨烷基磷酸NH2-(CH2)n-OPO4H2(AAP-n)[17-19]及其鹽,其磷酸根能夠和HA納米粒子表面的鈣離子以離子鍵結(jié)合，其氨基能夠電離成銨離子，使HA表面帶上正電荷，從而得到在水中穩(wěn)定分散的HA膠體[18]。其顆粒表面的可反應(yīng)的官能團(tuán)氨基，為HA的進(jìn)一步改性提供了廣闊的空間，有望制備性能優(yōu)異的HA納米復(fù)合材料。但AAP-n及其鹽是一類(lèi)新的HA改性劑，其對(duì)細(xì)胞功能的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本文研究氨烷基磷酸鈉[NH2-(CH2)n-OPO4HNa,AAP-n-Na]及其改性的HA(Cn-HA，n為改性劑中C原子個(gè)數(shù))對(duì)類(lèi)成骨細(xì)胞MG63功能的影響。這些研究對(duì)AAP-n-Na及其改性的HA在骨修復(fù)材料中的應(yīng)用具有重要的意義。

1實(shí)驗(yàn)

1．1氨烷基磷酸鈉(APP-n-Na)的合成

APP-n-Na(n=3～6，為結(jié)構(gòu)中C原子數(shù))的合成過(guò)程主要分為3步：首先，用芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)與氨基醇(H2N(CH2)nOH)上的氨基反應(yīng)，生成Fmoc保護(hù)的氨基醇；其次，用POCl3將其磷?；⑺?，得到Fmoc保護(hù)的氨烷基磷酸單酯；最后，將該磷酸單酯用哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合液脫Fmoc保護(hù)基，用NaOH調(diào)pH值為8.6～8.9，在V(水)/V(乙醇)=3∶2中重結(jié)晶即得目標(biāo)產(chǎn)物。具體合成方法已有文獻(xiàn)報(bào)道[19]。

氨乙基磷酸NH2-CH2CH2-OPO4H2(AAP-2)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，其鈉鹽(APP-2-Na)由AAP-2與NaOH(摩爾比1∶1)中和而得。

1．2APP-n-Na改性HA(Cn-HA)的合成

Cn-HA是通過(guò)含鈣和磷的水溶液快速混合的濕化學(xué)過(guò)程制備的[18]。鈣溶液由0.006molCaCl2溶于15mL水中制的；磷溶液由0.0021molNaH2PO4和0.0036molAAP-n-Na(n=2，3，4，5或6)也溶于15mL水中制得。兩者混合后得白色沉淀，用NaOH調(diào)pH值為9～10，80 ℃陳化16h得淺藍(lán)色水膠體。將水膠體用BeckmanL8-80M超高速離心機(jī)在50 000r/min下離心10min，得到凝膠狀的半透明沉淀，用水清洗3遍以除去水溶性雜質(zhì)。最后，將所有樣品冷凍干燥(-50 ℃，10Pa)24h，并在60 ℃下干燥10h，最終制得粉末狀Cn-HA(n=2～6)。元素分析表明所得HA的表面含有16%～30%的氨烷基磷酸鈣NH2-(CH2)n-OPO4Ca[18]。

1．3用含APP-n-Na的培養(yǎng)基培養(yǎng)MG63細(xì)胞

1.3.1堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)

將每種AAP-n-Na溶于PBS溶液中(1 %，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，過(guò)濾除菌，然后用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到濃度0.1%，0.05%和0.01%作為待測(cè)液，其中細(xì)胞培養(yǎng)液是含10%胎牛血清和0.1%雙抗(青、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基(FisherScientific，北京)。采用24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入培養(yǎng)基1mL，種植2×104個(gè)MG63細(xì)胞(華西醫(yī)學(xué)院，四川大學(xué))；陰性對(duì)照組為不含AAP-n-Na的空白培養(yǎng)液。每組4個(gè)復(fù)孔。接種細(xì)胞的孔板放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中。6d后，吸出孔中液體，用PBS緩沖液洗滌一次，每孔加入100μL1%RIPA強(qiáng)裂解液(碧云天，上海)，置于4 ℃裂解細(xì)胞膜30min。然后4 ℃ 14 000g離心15min，取上清液，用人堿性磷酸酶(ALP)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(碧云天，上海)來(lái)測(cè)量ALP含量。

用上述方法檢測(cè)了含0.1%AAP-n-Na的培養(yǎng)基對(duì)MG63細(xì)胞的堿性磷酸酶活性影響。測(cè)試時(shí)間為6和12d。

1.3.2骨鈣素含量及礦化結(jié)節(jié)染色

選取含0.1%AAP-n-Na的培養(yǎng)基作為待測(cè)液，用1.3.1節(jié)的方法培養(yǎng)細(xì)胞6、12d，裂解細(xì)胞膜，用人骨鈣素(OCN)ELISA試劑盒(碧云天，上海)來(lái)測(cè)量OCN含量。

為了觀察MG63細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成，將培養(yǎng)14d的細(xì)胞用PBS洗滌，再用10%福爾馬林固定30min。用0.1%茜素紅溶液(Solarbio，北京)染色30min，用去離子水洗滌3次，在OlympusIX71相差顯微鏡下(Olympus，日本)觀察并拍照。

1．4Cn-HA浸提液用于MG63細(xì)胞的培養(yǎng)

將Cn-HA粉末用無(wú)菌PBS浸泡(pH值=7.4)4h，棄去液體。然后用三蒸水浸提Cn-HA1d(0.1g/mL)，將浸提液用超濾離心管(截留分子量10 000，Minipore，美國(guó))過(guò)濾，除去任何懸浮粒子(懸浮的納米粒子有細(xì)胞毒性[20])。濾液用于溶解DMEM粉末(FisherScientific，北京)，調(diào)pH值到7.2，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，再加入0.1%雙抗、10%胎牛血清，成為待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液。商品HA(Aldrich，美國(guó))的浸提液制備的培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)液。

按照1.3.1節(jié)的方法培養(yǎng)MG63細(xì)胞6、12d后，裂解細(xì)胞，測(cè)定ALP活性。按照1.3.2節(jié)中礦化結(jié)節(jié)染色的操作，觀察培養(yǎng)了25d的MG63細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)。

2結(jié)果與討論

2.1AAP-n-Na對(duì)MG63細(xì)胞功能的影響

MG63細(xì)胞為人骨肉瘤細(xì)胞，能夠表達(dá)成骨細(xì)胞表型，是體外細(xì)胞培養(yǎng)常用的成骨樣細(xì)胞[21]。圖1(a)表明APP-n-Na的濃度在0.01%～0.1%范圍內(nèi)對(duì)MG63細(xì)胞表達(dá)ALP幾乎沒(méi)有什么影響，與不加APP-n-Na的空白培養(yǎng)基差別不大。部分樣品與空白對(duì)照樣相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，但其表達(dá)的ALP量仍有對(duì)照樣的70%以上，顯示所有樣品在6d培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)均能正常表達(dá)ALP。為此，我們?cè)谳^高的濃度下(0.1%)，培養(yǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間，來(lái)觀察MG63細(xì)胞功能蛋白的表達(dá)(圖2(b)和(c))。ALP和OCP的表達(dá)是類(lèi)似的，在第6d，兩者的表達(dá)量和對(duì)照樣無(wú)明顯差異；而在第12d，含APP-2-Na和APP-6-Na的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞ALP和OCP的表達(dá)量均低于對(duì)照樣；而n=3,4,5的APP-n-Na的樣品與對(duì)照樣相比，ALP和OCP的表達(dá)量與對(duì)照樣相比是相當(dāng)?shù)?，其中APP-4-Na的骨鈣素的表達(dá)甚至高于對(duì)照樣。這些結(jié)果表明，n=3,4,5的APP-n-Na對(duì)MG63細(xì)胞功能蛋白的表達(dá)無(wú)不良影響。

圖1AAP-n-Na對(duì)MG63 細(xì)胞功能蛋白表達(dá)的影響。*: 和空白培養(yǎng)基相比有顯著差異

Fig1TheeffectsofAAP-n-NaonproteinexpressionsinMG63cells. *: P<0.05,comparedwiththeblankmedium(Student’sttest)

成骨細(xì)胞在體內(nèi)最重要的功能就是促進(jìn)骨的鈣化，其中ALP的作用是將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為磷酸根，參與HA的形成[22]；而骨鈣素能與鈣結(jié)合，直接參與鈣結(jié)節(jié)的形成，是骨礦化的標(biāo)志性蛋白[23]。雖然APP-2-Na和APP-6-Na對(duì)ALP和OCP的表達(dá)有一定的抑制，但礦化情況未見(jiàn)明顯差異(圖2)，所有樣品均顯示明顯的礦化鈣結(jié)節(jié)；說(shuō)明所有細(xì)胞釋放的ALP和OCP對(duì)于礦化都是足夠的。

圖2MG63細(xì)胞在含0.1%AAP-n-Na的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后茜素紅染色照片。礦化鈣結(jié)節(jié)染成紅色。標(biāo)尺：100μm

Fig2AlizarinredstainingofMG63cellsafter14daysofcultureinmediacontaining0.1%AAP-n-Na.Allthesamplesshowedcalciumnodulesthathavebeenstainedred.Scalebar: 100μm

2.2Cn-HA對(duì)MG63細(xì)胞功能的影響

圖3進(jìn)一步研究了Cn-HA的浸提液對(duì)成骨細(xì)胞MG63ALP表達(dá)的影響。

圖3Cn-HA浸提液對(duì)MG63細(xì)胞ALP表達(dá)的影響。*：和未改性HA相比有顯著差異

Fig3TheextractsfromCn-HAhadaminoreffectontheALPexpressioninMG63cells.

*: P<0.05,comparedwiththeHAcontrol(Student’sttest)

在6d時(shí)間內(nèi)，所有樣品對(duì)ALP的表達(dá)量無(wú)顯著差異；第12d時(shí)，C2-HA和C5-HA和對(duì)照樣HA相比，ALP表達(dá)無(wú)顯著差異；其余樣品C3-，C4-以及C6-HA雖與對(duì)照樣相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但ALP表達(dá)的量仍達(dá)到了HA的約80%。考慮到實(shí)驗(yàn)誤差，可以說(shuō)AAP-n-Na改性HA對(duì)MG63細(xì)胞表達(dá)ALP幾乎沒(méi)有什么影響。

值得注意的是，雖然在ALP的表達(dá)上不同樣品有一定差異，但最終的礦化結(jié)果，不同樣品均能正常礦化，說(shuō)明MG63細(xì)胞的功能并未受到很大影響。雖然改性劑本身以及不同Cn-HA對(duì)功能蛋白的表達(dá)有一定的差異，但隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，所有功能蛋白的表達(dá)都是增加的(圖1和3)，即長(zhǎng)期看來(lái)，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的MG63細(xì)胞所表達(dá)的ALP對(duì)于鈣化都是足夠的，即不同樣品對(duì)MG63生物礦化沒(méi)有顯著影響。

我們以前的研究已證實(shí)，AAP-n-Na及其改性HA對(duì)MG63細(xì)胞的增殖和形貌是沒(méi)有影響的(即無(wú)細(xì)胞毒性)[19]。本研究經(jīng)一步表明AAP-n-Na及其改性HA對(duì)MG63細(xì)胞的成骨功能也是沒(méi)有影響的。因此APP-n-Na及其改性HA在骨修復(fù)材料中的使用是安全的。

圖4MG63細(xì)胞在含Cn-HA浸提液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)25d后茜素紅染色照片。礦化鈣結(jié)節(jié)染成紅色。標(biāo)尺：100μm

Fig4AlizarinredstainingofMG63cellsafter25dofcultureinmediacontainingCn-HAextracts.Allthesamplesshowedcalciumnodulesthathavebeenstainedred.Scalebar: 100μm

3結(jié)論

在0.1%濃度下，n=3,4,5的APP-n-Na對(duì)MG63細(xì)胞的ALP和OCP表達(dá)和對(duì)照樣(空白培養(yǎng)基)相比無(wú)顯著差異，所有樣品(n=2～6)對(duì)MG63細(xì)胞礦化無(wú)不良影響。將APP-n-Na接枝到HA表面所得到的Cn-HA對(duì)MG63細(xì)胞的功能(ALP表達(dá)和礦化)無(wú)不良影響，預(yù)示APP-n-Na及其改性HA在骨修復(fù)材料中的使用是安全的。

參考文獻(xiàn)：

[1]GeesinkRGT,HoefnagelsNHM.Six-yearresultsofhydroxyapatite-coatedtotalhipreplacement[J].JBoneJointSurg(Br), 1995, 77(4): 534-547.

[2]QiuHJ,YangJ,KodaliP,etal.Acitricacid-basedhydroxyapatitecompositefororthopedicimplants[J].Biomaterials, 2006, 27: 5845-5854.

[3]RathboneCR,GudaT,SingletonBM,etal.Effectofcell-seededhydroxyapatitescaffoldsonrabbitradiusboneregeneration[J].JBiomedMaterResPartA, 2014, 102: 1458-1466.

[4]GaraiS,SinhaA.Threedimensionalbiphasiccalciumphosphatenanocompositesforloadbearingbioactivebonegrafts[J].MaterSciEngC, 2016, 59: 375-383.

[5]GaraiS,SinhaA.Biomimeticnanocompositesofcarboxymethylcellulose-hydroxyapatite:novelthreedimensionalloadbearingbonegrafts[J].ColloidsSurfB:Biointerfaces, 2014, 115: 182-190.

[6]NiuYF,CaoLH,WeiJ,etal.Developmentofabioactivecompositeofnanofluorapatiteandpoly(butylenesuccinate)forbonetissueregeneration[J].JMaterChemB, 2014, 2:1174-1181.

[7]LuoJB,QiuSX,WangYL,etal.Preparationandphysicochemicalpropertiesofhydroxyapatite/polyurethanenanocomposites[J].ChinJPolymSci, 2014, 32(4): 467-475.

[8]BasileMA,d’AyalaGG,MalinconicoM,etal.FunctionalizedPCL/HAnanocompositesasmicroporousmembranesforboneregeneration[J].MaterSciEngC, 2015, 48: 457-468.

[10]ShokrollahiP,MehmanchiM,AtaiM,etal.EffectofinterfaceonmechanicalpropertiesandbiodegradationofPCLHApsupramolecularnano-composites[J].JMaterSciMaterMed, 2014, 25: 23-35.

[11]TanakaH,YasukawaA,KandoriK,etal.Surfacemodificationofcalciumhydroxyapatitewithhexylanddecylphosphates[J].ColloidSurfA1997, 125: 53-62.

[12]LiYB,WengWJ.Surfacemodificationofhydroxyapatitebystearicacid:characterizationandinvitrobehaviors[J].JMaterSciMaterMed, 2008, 19: 19-25.

[13]LuoJB,QiuSX,ZhouXY,etal.Insitugraftingpolyethyleneglycolchainsontoamorphouscalciumphosphatenanoparticlestoimprovethestoragestabilityandorganicsolventredispersibility[J].ColloidSurfA, 2014, 444: 81- 88.

[14]HuY,GuXY,YangY,etal.Facilefabricationofpoly(L-lacticacid)-graftedhydroxyapatite/poly(lactic-co-glycolicacid)scaffoldsbypickeringhighinternalphaseemulsiontemplates[J].ACSApplMaterInterfaces, 2014, 6: 17166-17175.

[15]TangYF,LiuJG,WangZL,etal.Invivodegradationbehaviorofporouscompositescaffoldsofpoly(lactide-co-glycolide)andnano-hydroxyapatitesurfacegraftedwithpoly(L-lactide) [J].ChinJPolymSci, 2014, 32(6), 805-816.

[16]PengWH,ZhengW,ShiK,etal.AninvivoevaluationofPLLA/PLLA-gHAnano-compositeforinternalfixationofmandibularbonefractures[J].BiomedMater, 2015, 10: 065007.

[17]KongWB,ZhouXY,YangY,etal.Afacilesynthesisofω-aminoalkylammoniumhydrogenphosphates[J].ChinChemLett, 2012, 23: 923-926.

[18]JiangYR,SunFH,ZhouXY,etal.Waterdispersiblehydroxyapatitenanoparticlesfunctionalizedbyafamilyofaminoalkylphosphates[J].ChinChemLett, 2015, 26: 1121-1128.

[19]SunFH,LongYZ,ZhouXY,etal.Aciddissociationconstantsandcytotoxicitytestofaseriesofomega-aminoalkylphosphates[J].ChinChemLett, 2016,accepted.

[20]MotskinM,WrightDM,MullerK,etal.Hydroxyapatitenanoandmicroparticles:correlationofparticlepropertieswithcytotoxicityandbiostability[J].Biomaterials, 2009, 30: 3307-3317.

[21]PautkeC,SchiekerM,TischerT,etal.CharacterizationofosteosarcomacelllinesMG-63,Saos-2andU-2OSincomparisontohumanosteoblasts[J].AnticancerRes, 2004, 24: 3743-3748.

[22]ColemanJE.Structureandmechanismofalkalinephosphatase[J].AnnuRevBiophysBiomolStruct, 1992, 21: 441-483.

[23]LianJB,SteinGS.Developmentoftheosteoblastphenotype:molecularmechanismsmediatingosteoblastgrowthanddifferentiation[J].LowaOrthopJ, 1995, 15: 118-140.

TheeffectsofaminoalkylphosphatesandtheirmodifiedhydroxyapatitesonMG63cellfunctions

LIUShuai,SUNFuhua,JIANGYirou,XIEXingyi

(CollegeofPolymerScienceandEngineering，SichuanUniversity，Chengdu610065，China)

Abstract:Omega-aminoalkylsodiumhydrogenphosphates(AAP-n-Na, n=2-6,representingthecarbonnumberinthealkylgroup)canbeusedtopreparehydroxyapatite(HA)hydrocolloids,whicharenewsurfacemodifiersforHAandhavenocytotoxicityasconfirmedpreviously.Inthisstudy,theeffectsofAAP-n-NaandtheirmodifiedHAs(Cn-HA, n=2-6)onthefunctionsofhumanosteoblast-likeMG63cellswerefurtherinvestigated.Theresultsshowedthatthealkalinephosphatase(ALP)andosteocalcin(OCN)expressionsincellstreatedwith0.1% (w/v)APP-n-Na(n=3, 4or5)intheculturemediawerecomparabletotheexpressionsintheblankmedium(DMEMsupplementedwith10%fetalbovineserum)asanegativecontrol;andallAAP-n-Na’s(n=2-6)didnotinhibitthecalciumnoduleformation.TheextractsfromcorrespondingCn-HAs(preparedat0.1g/mLinthecellculturemedium)didnotsignificantlyaltertheALPexpressionandcalciumnoduleformationinMG63cellsaswell,incomparisonwiththebareHAextractandtheblankmedium.TheseresultsimplythatAAP-n-Na’sandtheirmodifiedHAsaresafewhenusedinbonegraftingmaterials.

Keywords:Aminoalkylphosphates;hydroxyapatite;osteoblast;alkalinephosphatase;osteocalcin;calciumnodule

文章編號(hào)：1001-9731(2016)06-06108-05

* 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50973069)

作者簡(jiǎn)介：劉帥(1989-)，男，四川雅安人，在讀碩士，師承謝興益教授，從事生物材料研究。

中圖分類(lèi)號(hào)：R318；TQ132.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.06.019

收到初稿日期：2016-03-21 收到修改稿日期：2016-05-13 通訊作者：謝興益，E-mail:xiexingyi@263.net