曾 立，周紹龍，汪海濱，孫中生，徐 翔，羅盛康

?

實(shí)驗(yàn)研究

聚乙烯醇凝膠微球聯(lián)合透明質(zhì)酸注射填充的安全性研究

曾 立，周紹龍，汪海濱，孫中生，徐 翔，羅盛康

目的 探討聚乙烯醇凝膠微球聯(lián)合透明質(zhì)酸注射填充的安全性。方法 觀察寶尼達(dá)透明質(zhì)酸的顯微結(jié)構(gòu)，了解其內(nèi)部聚乙烯醇凝膠微球的分布情況；將其與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對細(xì)胞增殖的影響，以了解其生物毒性；將寶尼達(dá)透明質(zhì)酸注射于C57小鼠的頭皮下方，1個(gè)月后連同皮膚一塊取材，進(jìn)行F4/80染色，追蹤注射后的組織學(xué)變化和炎癥反應(yīng)情況。結(jié)果 所選用的寶尼達(dá)透明質(zhì)酸，由聚乙烯醇凝膠微球、羥甲基丙烯纖維素及透明質(zhì)酸構(gòu)成，成分均一，微球分布均勻；與細(xì)胞的共培養(yǎng)結(jié)果顯示其并未影響成纖維細(xì)胞的增殖活性；注射于小鼠頭皮下1個(gè)月，并未出現(xiàn)明顯的包膜反應(yīng)及炎癥反應(yīng)。結(jié)論 含有聚乙烯醇凝膠微球的注射用透明質(zhì)酸填充劑質(zhì)地均勻，不會影響細(xì)胞的增殖活性，也不會引起明顯的炎癥反應(yīng)等并發(fā)癥，具有良好的安全性。

寶尼達(dá)； 透明質(zhì)酸； 聚乙烯醇凝膠微球； 安全性; 注射填充

透明質(zhì)酸填充具有操作時(shí)間短，術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn),因此被廣大求美者所青睞。然而，透明質(zhì)酸填充的主要問題在于保存時(shí)間短，在注射后6～8個(gè)月需要重復(fù)注射，通過復(fù)合微球注射的方式，可以延長透明質(zhì)酸的保存時(shí)間，使填充效果延長至注射后2～3年。自2013年1月至 2015年12月，廣東省第二人民醫(yī)院整形外科對寶尼達(dá)透明質(zhì)酸注射填充材料的安全性進(jìn)行了探討。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)中所使用寶尼達(dá)透明質(zhì)酸由生物可降解新材料北京市工程實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合EME LAB公司(加拿大)和天津南開大學(xué)共同研發(fā)，該產(chǎn)品于2010年10月獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)。規(guī)格為2支/盒，0.5 ml/支。

1.2 微觀結(jié)構(gòu)觀察 取0.2 ml寶尼達(dá)透明質(zhì)酸，置于EP管內(nèi)，在EP管蓋上方扎孔，放置于真空冷凍干燥機(jī)干燥過夜，24 h后取出，樣品粘貼后進(jìn)行鍍膜，隨后使用掃描電鏡在不同放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察。

1.3 對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性的影響 采用MTT法測定，于96孔板選取36個(gè)孔，分為2組，其中實(shí)驗(yàn)組18孔內(nèi)底部鋪上寶尼達(dá)透明質(zhì)酸50 μl，其上層接種人皮膚成纖維細(xì)胞，2000個(gè)/孔，5%CO2，分別在37 ℃孵育1 d、3 d及5 d后，實(shí)驗(yàn)組和對照組各選取6個(gè)孔，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD490 nm波長的吸光值。

1.4 C57小鼠體內(nèi)安全性評價(jià) 選取6周齡C57雄性小鼠共6只，行乙醚麻醉后，將0.2 ml寶尼達(dá)透明質(zhì)酸注射到C57小鼠頭皮下方。注射1個(gè)月后，用頸椎脫臼法處死C57小鼠，取下頭頂部全層皮膚及皮下注射物。將標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中浸泡過夜，隨后行梯度脫水和浸蠟包埋，切成8 μm薄片，進(jìn)行HE及F4/80染色。

2 結(jié)果

2.1 微觀結(jié)構(gòu)觀察 通過掃描電鏡對寶尼達(dá)透明質(zhì)酸進(jìn)行微觀觀察，發(fā)現(xiàn)整體結(jié)構(gòu)類似于蟻穴樣分布，存在著大量的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。聚乙烯醇凝膠微球顆粒均勻分布在內(nèi)，其直徑范圍為25～30 μm；透明質(zhì)酸鈉顆粒大小不等，最大直徑約3 μm，散落分布在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之中(圖1)。

2.2 對成纖維細(xì)胞增殖活性的影響 實(shí)驗(yàn)組與對照組的OD值分別為孵育1 d后:0.61±0.03、0.650±0.05;3 d后:1.056±0.072、1.097±0.028；5 d后：1.360±0.120、1.320±0.150。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 注射至體內(nèi)后的組織學(xué)變化 填充材料注射1個(gè)月后，皮膚表層未出現(xiàn)明顯變化，組織結(jié)構(gòu)正常排列，未出現(xiàn)異常組織增生及明顯的炎癥反應(yīng),在皮下深層可見均勻分布的透明質(zhì)酸，其中可見散在的聚乙烯醇凝膠微球(圖2);免疫組化標(biāo)記F4/80顯示在其周圍有炎癥細(xì)胞存在,還可見透明質(zhì)酸下方與骨面相接處存在一層較薄的包膜(圖3)。

圖1 寶尼達(dá)透明質(zhì)酸的微觀結(jié)構(gòu) a.×50 b.×100 c.×500 d.×4000 圖2 皮膚組織下方透明質(zhì)酸和微球規(guī)則分布(HE ×200) 圖3 微球周圍的巨噬細(xì)胞(紅色箭頭)和骨面連接處的包膜(藍(lán)色箭頭，F(xiàn)4/80染色 ×200)
Fig 1 Microstructure of Bonita hyaluronic acid. a.×50. b.×100. c.×500. d.×4000. Fig 2 Regular distribution of Hyaluronic acid and microspheres beneath the skin tissue (HE ×200). Fig 3 Macrophagocyte around the microspheres(red arrow) and the envelope at the junction of the bone surface (blue arrow, F4/80 stain ×200).

3 討論

填充材料的尺寸、形狀、機(jī)械性能等會影響其在體內(nèi)的表現(xiàn)。例如，小于70 μm的硅膠顆粒，容易從注射部位遷移并且引發(fā)相關(guān)并發(fā)癥。然而，移植物的遷移潛能是決定其安全性的重要因素。巨噬細(xì)胞吞噬聚甲基丙烯酸甲酯顆粒具有尺寸依賴性。在體內(nèi)，相比于尺寸介于50～350 μm間的顆粒，小于50 μm的聚甲基丙烯酸甲酯顆粒將誘導(dǎo)產(chǎn)生TNFα[1]。相比于球形，帶有銳角如三角的顆粒也會引起較大的異物反應(yīng)[2]。表面化學(xué)物質(zhì)也會影響體內(nèi)對注射物質(zhì)的反應(yīng)[3]。例如，帶有兩性或陰性基團(tuán)的聚氨酯與帶有陽性基團(tuán)的聚氨酯相比，具有更低的體內(nèi)炎癥反應(yīng)。類似的，被覆羧酸基團(tuán)的聚丙烯顆粒，比被覆有氨基或者羥基的聚丙烯顆粒具有更低的炎癥反應(yīng)。顆粒屬性也會影響體內(nèi)填充劑的選擇，例如，依據(jù)注射的部位、功能需求及渴望的保留時(shí)間，填充劑的剛度要求也會有所不同。用于治療尿失禁的填充劑需要一定的剛度來保證力量；然而，面部填充劑需要一定的柔軟度。透明質(zhì)酸面部填充劑有較低的鉸鏈度，但是保留時(shí)間較短[4]。透明質(zhì)酸及其鹽(HA)是人體皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的重要成分，它由(1-β-4)D葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙?；?D-氨基葡糖雙糖單位重復(fù)連接組成，是一種鏈狀聚陰離子黏多糖[5]。商品HA來源于動物組織或微生物發(fā)酵，廣泛應(yīng)用于食品、日化和醫(yī)藥領(lǐng)域。高純度的醫(yī)用級HA已被制成注射劑，用于眼科手術(shù)、骨科手術(shù)、預(yù)防術(shù)后粘連、治療骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。此外，也被用于面部注射美容，改進(jìn)皮膚外觀和結(jié)構(gòu)、減輕皺紋、阻止皮膚衰老或改進(jìn)唇部形狀[6-10]。HA有良好的生物相容性，極少產(chǎn)生不良反應(yīng)，與人工合成或其他天然來源的材料相比，該類材料制備的軟組織填充產(chǎn)品更易于被接受，但由于其在體內(nèi)很快被擴(kuò)散和降解，難以維持理想效果。近年來，HA經(jīng)修飾或交聯(lián)后獲得了一些毒性小、生物相容性好的抗降解產(chǎn)物，陸續(xù)被開發(fā)為多種醫(yī)藥產(chǎn)品，其中就有以含有聚乙烯醇凝膠微球?yàn)榇淼膶毮徇_(dá)透明質(zhì)酸，但是其生物相容性和具體生物反應(yīng)缺乏充足證據(jù)。本文通過體外顯微觀察及體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)的方法，進(jìn)行詳細(xì)的探討，為其臨床應(yīng)用提供了指導(dǎo)。

筆者通過掃描電鏡對寶尼達(dá)透明質(zhì)酸進(jìn)行微觀觀察，發(fā)現(xiàn)其整體結(jié)構(gòu)類似于蟻穴樣分布，存在著大量的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。直徑范圍為25～30 μm的聚乙烯醇凝膠微球顆粒均勻分布在內(nèi)，透明質(zhì)酸鈉顆粒大小不等，最大直徑約3 μm，散落分布在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之中；其內(nèi)所包含的聚乙烯醇凝膠微球等成分在與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下，并沒有對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響；另外，通過對注射1個(gè)月的標(biāo)本進(jìn)行炎癥細(xì)胞追蹤，發(fā)現(xiàn)其所引起的炎癥反應(yīng)輕微，在與自身組織直接接觸的地方只產(chǎn)生較薄的包膜，在微球周圍可見少量的炎癥細(xì)胞浸潤，可以起到長期刺激膠原增生的作用。因而，在應(yīng)用于軟組織填充時(shí)可以長久的維持其效果。

科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步為我們提供了大量可供選擇的軟組織填充材料，其中包含自體組織以及人工合成的生物材料。不同材料有著不同的適應(yīng)證和適應(yīng)人群，在進(jìn)行具體應(yīng)用時(shí)需要依據(jù)具體情況而定。本文所探討的寶尼達(dá)透明質(zhì)酸在進(jìn)行軟組織填充時(shí)，具有較好的生物相容性；與此同時(shí)，在微球周圍又能夠維持較輕程度的炎癥反應(yīng)，通過刺激膠原的增生以保證較長時(shí)間的填充作用。然而，其遠(yuǎn)期效果仍需更長時(shí)間及大樣本的臨床研究觀察。

[1] Tous E, Weber HM, Lee MH, et al. Tunable hydrogel-microsphere composites that modulate local inflammation and collagen bulking[J]. Acta Biomater, 2012,8(9):3218-3227.

[2] Veiseh O, Doloff JC, Ma M, et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates[J]. Nat Mater, 2015,14(6):643-651.

[3] Bellis SL. Advantages of RGD peptides for directing cell association with biomaterials[J]. Biomaterials, 2011,32(18):4205-4210.

[4] Fakhari A, Berkland C. Applications and emerging trends of hyaluronic acid in tissue engineering, as a dermal filler and in osteoarthritis treatment[J]. Acta Biomater, 2013,9(7):7081-7092.

[5] Landau M, Fagien S. Science of hyaluronic acid beyond filling[J]. Plast Reconstr Surg, 2015,136(5 Suppl):188S-195S.

[6] Bertucci V, Lynde CB. Current concepts in the use of small-particle hyaluronic acid[J]. Plast Reconstr Surg, 2015,136(5 Suppl):132S-138S.

[7] 姜金豆, 張桂輝, 陳文娟, 等. 淚溝畸形矯正方法的臨床探討及療效分析[J]. 中國美容整形外科雜志, 2015,26(9):555-557.

[8] 戴露倢, 吳衛(wèi)華. 透明質(zhì)酸與自體脂肪在鼻唇溝填充中的臨床應(yīng)用[J]. 中國美容整形外科雜志, 2015,26(8):488-489.

[9] 李春山. 雙顳部透明質(zhì)酸注射填充致右顳側(cè)腫脹突起一例[J]. 中國美容整形外科雜志, 2015,26(1):61.

[10] 高宇, 李青峰. 透明質(zhì)酸填充注射的并發(fā)癥及處理[J]. 中國美容整形外科雜志, 2015,26(1):14-16.

Safety of injection filling with polyvinyl alcohol gel microspheres and hyaluronic acid

ZENGLi,ZHOUShao-long,WANGHai-bin,SUNZhong-sheng,XUXiang,LUOSheng-kang.

(DepartmentofPlasticSurgery,theSecondPeople'sHospitalofGuangdongProvince,Guangzhou510317,China)

LUOSheng-kang,Email:luoshengkang63@hotmail.com

Objective To investigate the safety of injection filling of polyvinyl alcohol gel microspheres combined with hyaluronic acid. Methods The microstructure of Bonita, containing polyvinyl alcohol gel microspheres was observed in vitro to determine the distribution of microspheres. In addition, its effect on cell proliferation was also observed by co-culture with fibroblasts, in order to understand the biological toxicity. At the same time, Bonita hyaluronic acid was injected beneath the scalp of C57 mice, and was harvested together with the skin at one month. Histological changes and inflammatory reactions were tracked by HE and F4/80 staining after injection. Results The Bonita hyaluronic acid used consists of polyvinyl alcohol hydrogel microspheres, hydroxymethyl propylene cellulose and hyaluronic acid structure with uniform components and homogeneous distribution of microspheres. The result of co-culture with cells demonstrated no effect on the proliferation activity of fibroblasts. There was little inflammation after one month. Conclusion Filler containing polyvinyl alcohol gel microspheres and hyaluronic acid with uniform texture was safe to use in this application and did not affect the proliferative activity of the cells or cause significant inflammation and other complications.

Bonita； Hyaluronic acid； Polyvinyl alcohol gel microspheres； Safety; Injection filling

510317 廣東 廣州，廣東省第二人民醫(yī)院 整形外科

曾 立(1989-),男，湖南湘潭人，醫(yī)師.

羅盛康，510317，廣東省第二人民醫(yī)院 整形外科,電子信箱：luoshengkang63@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.017

R318

A

1673-7040(2016)02-0118-03

2015-10-16)