牛聰聰，王身艷，劉暢，潘蘇華

(南京中醫(yī)藥大學 藥學院，南京 江蘇 210023)

HPLC測定人工蛹蟲草中6種核苷類成分的含量

牛聰聰，王身艷，劉暢，潘蘇華Δ

(南京中醫(yī)藥大學 藥學院，南京 江蘇 210023)

目的 建立人工蛹蟲草中核苷類成分的HPLC測定方法，為產品質量標準提供參考。方法 用高效液相色譜法測定人工蛹蟲草中的有效成分，選用Waters XBridgeTMC18柱色譜柱(250×4.6 nm，5 μm)；流動相為甲醇-0.2%磷酸二氫鉀溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫為30 ℃。結果 蟲草素、腺苷、鳥苷、尿苷、胸苷、胞苷分別在0.025～0.5 mg/mL，0.01～0.2 mg/mL，0.01～0.2 mg/mL，0.01～0.2 mg/mL，0.01～0.2 mg/mL，線性關系良好，平均回收率蟲草素為99.34%，胞苷為99.04%，尿苷為99.09%，鳥苷為98.75%，胸苷為102.38%，腺苷為99.27%。結論 該測定方法簡便易行、準確性好、靈敏度高、重復性好，可用于人工蛹蟲草中核苷類成分的質量控制。

人工蛹蟲草；核苷類成分；HPLC；含量測定

蛹蟲草(cordyceps militaris)又名北冬蟲夏草，是冬蟲夏草的替代品。研究資料表明人工蛹蟲草子中含有蟲草素、核苷類、甾醇類、蟲草酸、蟲草多糖、超氧化物歧化酶等[1-3]，其中蟲草素等核苷類化合物，為蛹蟲草的主要活性成分之一。蛹蟲草是具有良好藥用價值的真菌，其有效成分眾多，有抗疲勞[4]、抗菌[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7]、增強免疫力[8]等藥理作用。隨著蛹蟲草的生產工藝的日益成熟，它的食用開發(fā)價值也有很多研究者正在研究, 現已廣泛應用于藥品和保健品中。蛹蟲草作為食用方面的安全問題也需思考。本文擬采用高效液相色譜方法檢測人工蛹蟲草中核苷類成分含量，旨在為蛹蟲草的質量評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：蟲草素標準品(SIGMA，批號：Lot#06M4030V)；腺苷標準品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：Y-022-140108)；鳥苷標準品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：N-021-130821)；尿苷標準品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：N-025-131128)；胸苷標準品(南京泰普瑞儀器設備有限公司，批號：27189)；胞苷標準品(南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司)；甲醇為色譜純；重蒸水(娃哈哈飲用純凈水)；磷酸二氫鉀(AR南京化學試劑有限公司，批號：080760460)。

人工蛹蟲草樣品批號(蛹蟲草子實體，批號分別為20140412A(東臺)，20140412B(崗州春)，20140412C(新會海山堂)，20140412D(沈陽)，20140111A、20140214A、20140214B、20140218A、20140218B(無錫山禾)。

1.1.2 儀器：Waters e2695高效液相色譜儀，(二元泵，柱溫箱， Photodiode Array Detector：Waters 2998；美國Waters公司)；AG285 電子天平(0.01 mg，METTLER，SWITERLAND)；KQ-250DB 型數顯超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司) ; 電熱恒溫水浴鍋( 上海浦東榮豐科學儀器有限公司) ;AIIEGRAX-30R高速冷凍離心機(美國Beckman 公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Waters XBridgeTMC18(4.6×250 mm，5 μm,Waters)；流動相：A：甲醇B：0.2%KH2PO4緩沖液，梯度洗脫：0 min～10 min(1%～ 1% A)、10 min～30 min (1%～5%A)、30 min～50 min(5% ～40% A)，流速為1 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備：精密稱取對照品蟲草素5 mg，腺苷，鳥苷，尿苷，胸苷，胞苷各2 mg置10 mL的容量瓶中，加入20%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得蟲草素0.5 mg/mL，腺苷、鳥苷、尿苷、胞苷、胸苷質量濃度均為0.2 mg/mL，作為標準儲備液。

1.2.3 供試品溶液的制備：取人工蛹蟲草藥材粗粉約1 g，精密稱定，置已干燥至恒重的具塞錐形瓶中，加入20%的甲醇30 mL超聲提取20 min，取出，用20%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過冷卻至室溫，離心，取上清液0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

精密吸取“1.2”項下供試品溶液、對照品溶液各10 μL，按“1.2.1”項下的色譜條件進行測定。

1.2.4 線性關系考察：分別精密吸取1.2.2項下的蟲草素，胞苷，尿苷，鳥苷，胸苷，腺苷標準儲備液0.25、0.5、1、2.5、5.0 mL于10 mL量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，各對照品溶液分別進樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，進線性回歸。

1.2.5 精密度試驗：取1.2.2項下的標準儲備液，按1.2.1的色譜條件連續(xù)進樣6次，測定蟲草素、胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷苷峰面積，并計算各色譜峰的相對標準偏差(RSD)。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗：取同一批次人工蛹蟲草粉末(批號：20140218)，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h時進樣，測定蟲草素、胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷苷峰面積的峰面積，計算RSD。

1.2.7 重復性試驗：取同一批次人工蛹蟲草粉末(批號：20140218)，精密稱取1 g，平行5份，按1.2.3方法分別制備供試品溶液依法制備，測定蟲草素、胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷峰面積的質量分數，計算RSD。

1.2.8 加樣回收試驗：精密稱取蛹蟲草粉末(批號:20140218)內容物精密稱取1 g，共6份，加入胞苷對照品0.3995 mg、尿苷對照品2.0118 mg、鳥苷對照品0.2860 mg、胸苷對照品0.0344 mg、腺苷對照品1.1512 mg、蟲草素對照品4.7656 mg，按1.2.3項下方法制備供試品溶液，按1.2.1色譜條件測定峰面積，計算回收率

1.2.9 樣品測定：對所收集到的不同批號供試品，按1.2.3 方法分別制備成相應的供試品溶液，精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液各10 μL 分別注入高效液相色譜儀，依法測定，計算各批號供試品中蟲草素、胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷等成分的含量。

2 結果

2.1 系統性適應性試驗 供試品色譜中，在與胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷、蟲草素對照品色譜峰相同的位置上，顯示相同保留時間的色譜峰，供試品色譜中目標色譜峰的分離度均不低于1.5，說明方法的系統適應性良好。見圖1。

圖1 各溶液HPLC圖譜1：胞苷；2：尿苷；3：鳥苷；4：胸苷；5：腺苷；6：蟲草素 A：混合對照品溶液；B：人工蛹蟲草供試品Fig.1 HPLC Chromatograms ofeach solution 1:cytidine; 2: uridine; 3: vernine; 4: thymidine; 5: adenosine; 6: cordycepinA: The reference solution; B: Thecultured cordycepsmilitaris

2.2 線性關系考察 胞苷，尿苷，鳥苷，胸苷，腺苷、蟲草素的回歸方程分別為Y=1.74×107X+13400，r=0.9999；Y=2.44×107X+13800，r=0.9999；：Y=2.45×107X+32200，r=0.999885；Y=2.0×107X+27100，r=0.9997；Y=3.65×107X+14400，r=0.9999；Y=2.06×107X-42700，r=0.9999。結果表明蟲草素在0.025～0.5 mg/mL，胞苷在0.01～0.2 mg/mL，尿苷在0.01～0.2 mg/mL，鳥苷在0.01～0.2 mg/mL，胸苷在0.01～0.2 mg/mL，腺苷0.01～0.2 mg/mL，與峰面積線性關系良好。

2.2 精密度試驗測定 蟲草素、腺苷、鳥苷、尿苷、胸苷、胞苷峰面積的RSD 分別為1.26%、1.3%、0.53%、0.56%、1.39%、0.54%，表明儀器的精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗 供試品溶液中胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷、蟲草素色譜峰面積RSD分別為3.46%、0.99%、0.37%、3.49%、2.13%、1.68%，證明供試品溶液中的核苷類成分在制備后24h內穩(wěn)定。

2.4 重復性試驗 測定人工蛹蟲草粉末中蟲草素、腺苷、鳥苷、尿苷、胸苷、胞苷的平均含量分別為4.68 mg/g、1.50 mg/g、0.83 mg/g、2.08 mg/g、0.23 mg/g、0.35 mg/g，RSD分別為1.57%、1.07%、1.69%、1.64%、1.53%、1.75%，表明該方法重復性良好。

2.5 加樣回收試驗 其中，胞苷的平均回收率為99.04%，RSD值為2.88%；尿苷的平均回收率為99.09%，RSD值為2.40%；鳥苷的平均回收率為98.75%，RSD值為1.49%；胸苷的平均回收率為102.38%，RSD值為3.26%；腺苷的平均回收率為99.27%，RSD值為1.16%；蟲草素的平均回收率為99.34%，RSD值為1.03%，表明該方法的準確度良好。加樣回收率數據見表1～6。

表1 胞苷回收率考察

表2 尿苷回收率考察

表3 鳥苷回收率考察

表4 胸苷回收率考察

表5 腺苷回收率考察

表6 蟲草素回收率考察

2.7 樣品測定取 8批蛹蟲草粉末(批號分別為20140412A，20140412B，20140412C，20140412D，20140111A，20140214A，20140214B，20140218A，20140218B)中胞苷、尿苷、鳥苷、胸苷、腺苷、蟲草素的含量。見表7。

表7 不同批次蛹蟲草中核苷類成分的含量測定結果

3 討論

制備樣品供試液過程中，由于蛹蟲草中的核苷類成分，極性很大，本研究參考了文獻[9-11]，對提取溶劑和超聲時間進行了考察，發(fā)現20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇提取的核苷類成分得率差別不大，采用20%甲醇提取效率稍高于其他比例的甲醇；20%甲醇提取的色譜峰較多，峰形較好，且分離度較好，超聲20 min和40 min所得的核苷類成分的得率沒有差別，所以采用超聲20min提取。流動相經多次摸索，為甲醇～0.2%磷酸二氫鉀溶液梯度洗脫，此時核苷類成分與雜質峰已能完全分離。

從表7中，可以看出人工蛹蟲草產地不同，所含的核苷類成分含量不同，分析其原因可能是不同廠家所選用的菌種不同和蛹蟲草培育工藝不同造成核苷類成分含量差異。目前市場上蛹蟲草的需求日益增加，因此急需制定統一可靠的評價標準，從宏觀上控制蛹蟲草的質量和規(guī)范化生產。

本研究建立了HPLC測定人工蛹蟲草中6種核苷酸成分含量，并且針對所測樣品中含有的6種成分進行了定量分析，并做了方法學考察。結果表明，該測定方法簡便易行、準確性好、靈敏度高、重復性好、操作可行，可被用于測定蛹蟲草中核苷類物質的質量控制方法。

[1] 樊慧婷,林洪生.蛹蟲草化學成分及藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志,2013,38(15):2549-2551.

[2]曾宏彬,宋斌,李泰輝. 蛹蟲草研究進展及其產業(yè)化前景[J].食用菌學報,2011,18(2):70-74.

[3]王奇.蛹蟲草功效成分研究進展[J].遼寧師專學報,2011,13(3):102-106.

[4]江海濤,任源浩,吳雨龍,等.蛹蟲草多糖對小鼠抗疲勞作用的研究[J].食用菌學報,2014,21(3):55-59.

[5]高燕燕, 周禮紅, 潘肇儀,等.蛹蟲草抗菌活性物質的初步研究[J].廣東農業(yè)科學,2013(11):183-185.

[6]徐雷雷, 王靜鳳, 唐筱,等.蛹蟲草降血糖作用及其機制研究[J].中國藥理學通報,2011,27(9):1331-1332.

[7]尹導群,陳麗,張松.蛹蟲草抗腫瘤活性物質研究[J].中藥材,2010,33(7):1189-1191.

[8]談唯,宋捷,張潤桐.復方蛹蟲草制劑對大鼠運動性疲勞和免疫力的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥,2011(20):24-27.

[9]蘇穎,李競. 人工蛹蟲草指紋圖譜的建立[J].亞太傳統醫(yī)藥,2012,8(3):10-11.

[10]楊昕,王瑞華,涂秩平,等. 高效液相色譜法同時測定人工蛹蟲草子實體中核苷類成分的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2007,27(8):1097-1099.

[11]裴軼琨. 超聲波提取HPLC-UV法測定人工蛹蟲草中8種核苷類物質[J].中國釀造,2012,31(11):163-166.

(編校：譚玲)

Determination of the nucleosides in cultured Cordyceps militarisby HPLC

NIU Cong-cong, WANG Shen-yan, LIU Chang, PAN Su-huaΔ

(College of Pharmacy, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu 210023, China)

ObjectiveTo determine the content of nucleoside in cultured Cordyceps militaris.MethodsThe HPLC method was established for the determination of the content of nucleosides in cultured Cordyceps militaris, The HPLC was performed on WatersXBridgeTMC18(250 mm×4.6 mm,5 μm) column, mobile phaseconsisted methanol-0.2% monopotassium phosphate gradient elute. column temperature 30 ℃，and flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 260 nm.ResultsA good linearity was obtained in the range of 0.025-0.5 mg/mL of cordycepin,0.01-0.2 mg/mL of cytidine, 0.01-0.2 mg/mL of uridine, 0.01-0.2 mg/mL of vernine, 0.01-0.2 mg/mL of thymidine and 0.01-0.2 mg/mL of adenosine.The average recovery rates of cordycepin, cytidine, uridine, vernine, thymidine ,and adenosine were 99.34%, 99.04%, 99.09%, 98.75%, 102.38% and 99.27%，respectively.ConclusionThe established method is simple，accurate and sensitive，and suitable for quality control of cultured Cordyceps militaris.

cultured Cordyceps militaris; nucleosides; HPLC; determination

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)

牛聰聰,女,碩士,研究方向: 消化藥理,E-mail:niuconga@162.com; 潘蘇華,通信作者,女,博士，教授,研究方向:消化道藥理, E-mail: 13851664089@163.com。

S567.35

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.56