吳亦晴，虞勁祥，程志紅

(復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，上海 201203)

二萜類化合物微生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

吳亦晴，虞勁祥，程志紅Δ

(復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，上海 201203)

二萜類(diterpenoids)化合物是一類含有20個碳原子的天然萜類成分，許多著名的藥物分子如紫杉醇、穿心蓮內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯等均為二萜類化合物。由于該類化合物顯著的生物和藥理活性，已成為當(dāng)今天然藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。利用微生物轉(zhuǎn)化(microbial transformation)這種高度區(qū)域性和立體選擇性的結(jié)構(gòu)修飾方法對二萜類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，已成為發(fā)現(xiàn)新型二萜類先導(dǎo)化合物的一種重要手段。本文就主要二萜類化合物(半日花烷型二萜、克羅烷型二萜、銀杏內(nèi)酯型二萜；松香烷型二萜、海松烷型二萜、紫杉烷型二萜；貝殼杉烷型二萜、貝葉烷型二萜；假白欖烷二萜、金錢松二萜)的微生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)行綜述，為該類化合物在微生物轉(zhuǎn)化體系下可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)類型、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性以及活性變化等提供科學(xué)參考。

二萜；微生物轉(zhuǎn)化；半日花烷；松香烷

二萜類(diterpenoids)化合物是由4個異戊二烯基單元組成、含有20個碳原子的一類天然化合物，其生源上都是由前體物焦磷酸香葉基香葉酯(geranylgeranyl-PP，GGPP)衍生而成，此類化合物廣泛存在于植物界、真菌、昆蟲和海洋生物中。二萜類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多樣，根據(jù)骨架環(huán)系主要可分為鏈狀、單環(huán)、二環(huán)、三環(huán)、四環(huán)和大環(huán)二萜等多種類型(見圖1)。其多變的化學(xué)結(jié)構(gòu)和豐富的自然界來源，決定了二萜類成分生物活性的多樣性，如具顯著抗癌活性的紫杉醇[1]、冬凌草甲素[2]和巨大戟醇[3]等；顯著抗炎活性的穿心蓮內(nèi)酯類[4]；顯著心腦血管保護(hù)活性的銀杏內(nèi)酯類[5]等等。這些活性化合物的發(fā)現(xiàn)使得二萜類化合物至今一直是藥學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)研究中的熱點(diǎn)。

微生物轉(zhuǎn)化(microbial transformation，MT)是利用微生物在其在生長過程中合成的大量酶系的催化作用對化合物(底物)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的轉(zhuǎn)化反應(yīng)[6]。微生物轉(zhuǎn)化利用腸道菌、放線菌、真菌等微生物作為發(fā)酵工廠，底物通過其酶系的作用發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)，如氧化(羥基化、酮基化、脫氫)、水解、(脫)乙?；?、糖苷化等反應(yīng)，少數(shù)底物在適當(dāng)?shù)奈⑸镒饔孟聲l(fā)生特異性的碳原子遷移反應(yīng)和骨架重排反應(yīng)。早在上世紀(jì)50年代，微生物轉(zhuǎn)化就已經(jīng)在甾體藥物結(jié)構(gòu)合成領(lǐng)域成功應(yīng)用，利用常見的根霉菌在甾體底物的C-11位合成羥基，進(jìn)而極大地加速了甾體激素類藥物的合成效率和產(chǎn)率[7]。由于三萜類化合物在結(jié)構(gòu)上與甾體類化合物的相似性，其非化學(xué)活潑位點(diǎn)難以用有機(jī)催化進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，開始有越來越多研究采用微生物轉(zhuǎn)化法對三萜類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化[8-9]。

二萜類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、骨架多變、來源廣泛，多具有明顯的生物和藥理活性。而微生物轉(zhuǎn)化具有區(qū)域選擇性高、立體選擇性強(qiáng)和反應(yīng)類型多等特點(diǎn)。因此，近年來，有越來越多的研究者用微生物轉(zhuǎn)化對該類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，獲得一些難以用化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)新穎的二萜衍生物，進(jìn)而為新藥研發(fā)提供更具價值的先導(dǎo)化合物[9]。本文依據(jù)二萜類化合物的結(jié)構(gòu)類型，對國內(nèi)外研究較多的主要二萜類化合物的微生物轉(zhuǎn)化(不包括腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化)進(jìn)行概述。

圖1 主要二萜類化合物的骨架結(jié)構(gòu)Fig.1 The major structure skeletons of diterpenoids

1 雙環(huán)類二萜的微生物轉(zhuǎn)化

1.1 半日花烷型二萜(Labdanes)的微生物轉(zhuǎn)化 半日花烷型二萜以十氫萘為母核，結(jié)構(gòu)類型多變，根據(jù)其是否含有特殊的結(jié)構(gòu)基團(tuán)，可將其進(jìn)一步分為一般半日花烷型、內(nèi)酯環(huán)型、環(huán)氧型、螺環(huán)型、呋喃型和重排型。大多數(shù)半日花烷型二萜具有豐富的生物活性[10]，其中最具代表性的是從中藥穿心蓮Andrographispaniculata中分得的穿心蓮內(nèi)酯類(andrographolides)和從毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii中分得的毛喉素(forskolin)。該類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性和良好的生物活性促使許多研究者采用微生物轉(zhuǎn)化法對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾研究。對于一般半日花烷型二萜，酶催化反應(yīng)主要發(fā)生在十氫萘骨架上，羥基化反應(yīng)主要發(fā)生在C-2、C-3以及C-18位的角甲基上，環(huán)內(nèi)雙鍵也易發(fā)生雙鍵重排與氧化反應(yīng)。Aranda等[11]利用毛霉屬的Mucorplumbeus對香紫蘇醇(sclareol)、香紫蘇內(nèi)酯(sclareolide)和淚杉醇(manool)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)無論使用生長中的M. plumbeus還是過濾并水洗的菌絲，都能將香紫蘇醇轉(zhuǎn)化為3β、6α或18位羥基化產(chǎn)物。在同樣的轉(zhuǎn)化條件下，香紫蘇內(nèi)酯可得到3β羥基化產(chǎn)物和其進(jìn)一步的C-3羰基化產(chǎn)物，而淚杉醇則得到2α羥基化產(chǎn)物。該研究表明M.plumbeus可作為此類二萜的立體和區(qū)域選擇性羥基化手段，用于增強(qiáng)此類衍生物的水溶性及進(jìn)一步修飾的位點(diǎn)。Haridy 等[12]利用黑曲霉Aspergillusniger對從菊科Madia屬多種植物中分得的一個C-7/8位環(huán)內(nèi)雙鍵的半日花烷二萜(13R,14R,15-trihydroxylabd-7-ene)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，除了得到C-3羥基化衍生物外，還得到一個8α,9β-不飽和酮類化合物。此外，Orden等[13]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉A.niger無法對C-8/9位環(huán)內(nèi)雙鍵、不含五元環(huán)氧基團(tuán)的半日花烷二萜發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)。比較2者的研究結(jié)果，說明黑曲霉對半日花烷二萜的生物轉(zhuǎn)化有嚴(yán)格的區(qū)域選擇性。Lin等[14]發(fā)現(xiàn)諾卡氏菌屬的Nocardiaaurantia可以將異柏油酸(isocupressic acid)轉(zhuǎn)化為降異柏油酸(nor-isocupressic acid)，即C-13/14位雙鍵通過環(huán)氧化中間體得到C-13羰基化產(chǎn)物。此研究結(jié)果表明，選擇合適的菌種也能在非十氫萘骨架上發(fā)生酶催化反應(yīng)。

內(nèi)酯環(huán)在半日花烷二萜骨架中存在較為普遍，典型化合物為穿心蓮內(nèi)酯，是穿心蓮中抗炎作用的主要活性成分。關(guān)于穿心蓮內(nèi)酯的微生物轉(zhuǎn)化研究有較多報(bào)道，如Wang等[15]利用毛霉屬的M.spinosu對穿心蓮丙素(neoandrographolide)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，并比較了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與底物的活性差異。研究結(jié)果表明，該微生物的酶系可以催化穿心蓮丙素發(fā)生羥基化、水解及糖苷化反應(yīng)，其中雙鍵羥基化的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有更好的抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO的活性。Deng等[16]用短刺小克銀漢霉Cunninghamellablakesleana對去氧穿心蓮內(nèi)酯(deoxyandrographolide)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化研究，得到多個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中包括4個C-3羰基化產(chǎn)物、1個具C-1/2環(huán)內(nèi)雙鍵的產(chǎn)物和1個內(nèi)酯環(huán)開裂的產(chǎn)物。對比轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和底物抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO的活性發(fā)現(xiàn)，具C-1/2位雙鍵的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可提高該抗炎活性，而C-3位羰基化對活性改變影響較小。而He等[17]用赭曲霉A.ochraceus對穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可得到其C-8/17位雙鍵羥基化產(chǎn)物、C-19羥甲基的羧基化產(chǎn)物以及C-12/13位雙鍵的遷移化產(chǎn)物。對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)和人惡性白細(xì)胞(leukemia)的細(xì)胞毒活性進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中同時具有8β羥基化、19位羧基化以及C-12/13位雙鍵遷移至C-11/12位的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物細(xì)胞毒活性明顯高于底物。該研究表明，雖然微生物轉(zhuǎn)化為生物體進(jìn)行解毒代謝的過程，但仍能從中獲取保留底物活性或活性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

1.2 克羅烷型二萜(Clerodanes)的微生物轉(zhuǎn)化 克羅烷型二萜的基本骨架也為十氫化萘，是半日花烷二萜的結(jié)構(gòu)重排類型，按其是否存在特殊基團(tuán)，可進(jìn)一步分為一般克羅烷型、呋喃型、內(nèi)酯型和環(huán)氧型?？肆_烷型二萜的分布也較為廣泛，許多該類型二萜，尤其是其多氧取代的衍生物具有較強(qiáng)的昆蟲拒食、抗菌和抗腫瘤活性[18]。Choudhary等[19]通過植物病原菌Rhizopusstelonifer對克羅烷內(nèi)酯(clerodane lactone)和克羅烷甲酯(clerodane methyl ester)進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化研究，除了得到A環(huán)和B環(huán)兩個六元環(huán)不同位置的羥基化產(chǎn)物外，兩底物還均得到呋喃環(huán)發(fā)生氧化開環(huán)的產(chǎn)物。值得注意的是，該開環(huán)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與其在P450酶體外生物催化反應(yīng)的產(chǎn)物一致[20]。Mafezoli等[21]用刺孢小克銀漢霉C.echinulata催化同樣含有呋喃環(huán)的克羅烷二萜，僅得到C-3位羥基化衍生物。與此不同的是，而上述Choudhary等的研究，發(fā)現(xiàn)可在克羅烷二萜骨架的多個非活潑碳上都可以發(fā)生羥基化反應(yīng)，同時轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有高度的立體選擇性[19]。由此可見，轉(zhuǎn)化底物的微小差別以及微生物轉(zhuǎn)化體系的不同，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)化反應(yīng)的不同，進(jìn)一步說明了微生物轉(zhuǎn)化的特異性和選擇性。

1.3 銀杏內(nèi)酯型二萜(Ginkgolides)的微生物轉(zhuǎn)化 銀杏內(nèi)酯類是銀杏葉中所獨(dú)有的成分，骨架中含有六個五元環(huán)(其中包括一個螺壬烷、一個四氫呋喃環(huán)和三個內(nèi)酯環(huán))和一個叔丁基。銀杏內(nèi)酯類是公認(rèn)的血小板活化因子受體拮抗劑，其中活性最強(qiáng)的是銀杏內(nèi)酯B，其次為銀杏內(nèi)酯A，但目前對其的微生物轉(zhuǎn)化研究報(bào)道較少。Ding等[22]采用食用真菌Coprinuscomatus對銀杏內(nèi)酯類化合物進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)多種銀杏內(nèi)酯類化合物經(jīng)羥基化反應(yīng)可轉(zhuǎn)化成活性更好的銀杏內(nèi)酯B，且部分轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高達(dá)88%。

2 三環(huán)類二萜的微生物轉(zhuǎn)化

2.1 松香烷型二萜(Abietanes)的微生物轉(zhuǎn)化 松香烷二萜基本骨架為氫化菲，C-4位存在一個偕二甲基，其代表性的化合物是從唇形科植物迷迭香Rosmarinusofficinalis中分得的鼠尾草酸(carnosic acid)。van Beek 等[23]對從歐洲赤松Pinussylvestris中分得的一個微生物毒性成分脫氫樅酸(dehydroabietic acid)進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化，分別以兩種真菌Phlebiopsisgigantean和Trametesversicolor為轉(zhuǎn)化體系，采用HPLC-DAD-ELSD法進(jìn)行跟蹤檢測，從兩株菌株發(fā)酵產(chǎn)物中得到種類不同的氧化產(chǎn)物，主要為在發(fā)生在氫化菲骨架C-1、C-7和邊鏈C-17位的羥基化反應(yīng)產(chǎn)物，以及C-7位的羰基化反應(yīng)產(chǎn)物。而Fraga等[24]同樣以脫氫樅酸的類似物dehydroabietanol和teideadiol為底物，采用毛霉屬M(fèi).plumbeus進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也得到了C-1和C-17位羥基化產(chǎn)物，但羰基化反應(yīng)發(fā)生在C-2位。以C-20位為羧基的鼠尾草酸為底物，利用諾卡氏菌屬的Nocardiasp. NRRL 5646進(jìn)行轉(zhuǎn)化，則得到C-7羥基與C-20羧基發(fā)生分子邁克爾加成的產(chǎn)物-鼠尾草酚(carnosol)[25]。綜合以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羥基化及其進(jìn)一步的氧化反應(yīng)主要發(fā)生在飽和的十氫萘環(huán)和偕二甲基上，而駢合的苯環(huán)基本不發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

松香烷二萜中的碳原子常發(fā)生遷移，除常見的甲基遷移外，一些分子骨架中的碳原子也易發(fā)生遷移。雷公藤二萜是衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygiumwilfordii的主要有效成分，屬于松香烷型二萜C-18位甲基遷移的產(chǎn)物，形成特有的A環(huán)α,β-不飽和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)[26]。雷公藤二萜具有免疫抑制和抗腫瘤等多種顯著的生理活性，但由于腎毒性大，其臨床應(yīng)用受到一定的限制。果德安教授課題組利用黑曲霉A.niger對雷公藤主要成分雷公藤甲素(triptolide)和雷公藤內(nèi)酯酮(triptonide)進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分別得到4個新雷公藤甲素衍生物(5α-羥基雷公藤甲素、19α-羥基雷公藤甲素、19β-羥基雷公藤甲素和1β-羥基雷公藤甲素)以及3個新雷公藤內(nèi)酯酮衍生物(5α-羥基雷公藤內(nèi)酯酮、16-羥基雷公藤內(nèi)酯酮和17-羥基雷公藤內(nèi)酯酮)?；钚栽u價結(jié)果表明，除C-19羥基化產(chǎn)物外，其他轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均表現(xiàn)出對人胃癌細(xì)胞BGC-823、人宮頸癌細(xì)胞Hela和人白血病細(xì)胞HL-60等較強(qiáng)的體外細(xì)胞毒活性，但均比底物略有下降[27]。Chen 等[28]利用粗糙脈孢菌Neurosporacrassa也對雷公藤內(nèi)酯酮衍生物(14-deoxy-14-methylenetriptolide)進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化，但僅得到其C-5羥基化產(chǎn)物。值得注意的是，雷公藤二萜B/C環(huán)上特殊的三元氧環(huán)均未有酶催化發(fā)生開環(huán)反應(yīng)的報(bào)道。

丹參酮二萜類成分是唇形科植物丹參Salviamiltiorrhiza的主要脂溶性有效成分，其結(jié)構(gòu)為松香烷型C-20降二萜[29]。以雅致小克銀漢霉C.elegans為轉(zhuǎn)化體系，隱丹參酮(cryptotanshinone)為底物，得到一對C-3位羥基化差向異構(gòu)體和C-18位羥基化產(chǎn)物，該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與隱丹參酮經(jīng)灌胃小鼠膽汁中的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致[30]。該研究結(jié)果的重要意義在于，用微生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可用于預(yù)測及合成藥物在哺乳動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，且微生物轉(zhuǎn)化法具有微量代謝產(chǎn)物易制、耗費(fèi)低、重復(fù)性強(qiáng)等顯著優(yōu)點(diǎn)。

2.2 海松烷型二萜(Pimaranes)的微生物轉(zhuǎn)化 與松香烷二萜一樣，海松烷二萜最初也是從松香中分離出來的，根據(jù)分子中手性中心的差異可以分為4大類：海松烷型、異海松烷型、對映-海松烷型和對映-異海松烷型。海松烷型二萜具有解痙和肌肉松弛等活性。Fraga等[31]用弗基克羅赤霉Gibberellafujikuroi對蒲包花屬植物Calceolariapetioalaris中分得的異海松烷型二萜進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化，得到一系列C-7/8位雙鍵發(fā)生氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。此后，該研究組利用該菌對含有C-9/11雙鍵的海松烷二萜酸(1)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到C-1羰基化產(chǎn)物和一個經(jīng)Baeyer-Villiger 氧化重排的七元內(nèi)酯環(huán)產(chǎn)物(2)(見圖2)[32]。該重排產(chǎn)物推測可能是由C-2-oxo插入氧原子形成的，該研究是第一次發(fā)現(xiàn)弗基克羅赤霉可以催化Baeyer-Villiger氧化重排反應(yīng)。Severiano等[33]分別用真菌圍小叢殼菌Glomerellacingulata和魯西毛霉菌M.rouxii對一個具有抗菌作用的異海松烷二萜(ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到3個雙鍵重排產(chǎn)物，其中一個產(chǎn)物存在8α,9β-不飽和酮結(jié)構(gòu)，推測該產(chǎn)物是先由底物生成C-7/8位環(huán)氧中間體，該中間體進(jìn)而氧化形成鄰二醇中間體，最后經(jīng)脫水而成。通過比較以上海松烷型二萜微生物轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn)，除了骨架中C-1、C-2和C-7位容易發(fā)生羥基化反應(yīng)外，環(huán)內(nèi)雙鍵也容易發(fā)生氧化或重排反應(yīng)。

圖2 海松烷型二萜酸(1)經(jīng)Gibberella fujikuroi轉(zhuǎn)化得到的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(2)Fig.2 A rearrangement product(2)obtained by biotransformation of 1 with Gibberella fujikuroi

2.3 紫杉烷型二萜(Taxanes)的微生物轉(zhuǎn)化 紫杉烷型二萜是從紅豆杉屬植物TaxusLinn.中得到的一類二萜成分，其中最具代表性的化合物紫杉醇(paclitaxel)，是目前臨床上使用最廣泛的抗癌藥物之一。對紫杉烷二萜的生物轉(zhuǎn)化研究引起了各國學(xué)者的重視，以期將紫杉醇類似物轉(zhuǎn)化為紫杉醇或者尋找到活性和水溶性更好的紫杉醇衍生物。主要的微生物催化反應(yīng)包括氧化反應(yīng)、雙鍵還原反應(yīng)、酯水解反應(yīng)、酰化反應(yīng)、重排反應(yīng)和C-7位羥基的差向異構(gòu)化反應(yīng)等[34]。近年來研究發(fā)現(xiàn)灰色鏈霉菌Streptomycesgriseus能將一紫杉烷衍生物(4)轉(zhuǎn)化成罕見的帶有罕見6/8/6/5環(huán)狀結(jié)構(gòu)的重排產(chǎn)物(5)(見圖3)[35]。戴均貴教授課題組對紫杉烷型二萜的微生物轉(zhuǎn)化及生物合成進(jìn)行了較為深入的研究，利用蘭色犁頭霉Absidiacoerulea和日內(nèi)瓦毛霉M.genevensis2種培養(yǎng)體系對4個紫杉烷型二萜(sinenxan、yunanxane和2個sinenxan衍生物)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到53個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物9α-羥基取代sinenxan A的進(jìn)一步化學(xué)反應(yīng)得到的9α-肉桂酰取代sinenexan A，具有良好的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性[36]。該研究的重要意義在于，對于二萜結(jié)構(gòu)中不活潑的碳原子，可利用微生物酶進(jìn)行選擇性羥基化反應(yīng)，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，這是一個合成先導(dǎo)化合物的有效途徑之一。

圖3 紫杉烷型二萜(4)經(jīng)Streptomyces griseus轉(zhuǎn)化得到的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(5)Fig.3 A rearrangement product(5)obtained by biotransformation of 4 with Streptomyces griseus

同樣含有紫杉烷骨架的化合物還有三尖杉寧堿(cephalomannine)，用一種從東北紅豆杉根際土壤中分離得到的細(xì)菌Luteibactersp.，可將三尖杉寧堿轉(zhuǎn)化生成8個代謝產(chǎn)物，其中兩個產(chǎn)物為糖苷化產(chǎn)物。糖基的引入能大大提高三尖杉寧堿的水溶性，增加其成藥性[37]。

3 四環(huán)類二萜的微生物轉(zhuǎn)化

3.1 貝殼杉烷型二萜(Kauranes)的微生物轉(zhuǎn)化 貝殼杉烷型二萜是一類具有重要生物活性的二萜類化合物，自然界以對映-貝殼杉烷型(ent-kauranes)化合物居多。此類化合物在醫(yī)藥和食品方面有著廣泛的應(yīng)用，有許多此類化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究報(bào)道。Fraga等[38]采用毛霉類M.plumbeus對從植物Sideritiscandicans分得的對映-貝殼杉二萜類化合物candidiol進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化，得到C-3和C-11位羥基化產(chǎn)物，以及一個C-6/11橋氧環(huán)化合物，并推測這個橋氧環(huán)化合物是由C-16/17形成的三元氧環(huán)開環(huán)形成的。該課題組又用M.plumbeus轉(zhuǎn)化candidiol的C-4位羥基差向異構(gòu)體，也得到發(fā)生相似橋氧環(huán)反應(yīng)的產(chǎn)物，同時得到2個糖苷化產(chǎn)物[38]，這是首次利用M.plumbeus對二萜類化合物進(jìn)行糖苷化反應(yīng)的報(bào)道。Candicandiol和epicandicandiol是2個C-7位羥基差向異構(gòu)化的貝殼杉烷型二萜，利用該毛霉菌對它們進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)，2者轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要區(qū)別在前者能得到9β-羥基化物，后者能得到3α-羥基化物，推測可能是由于C-7位羥基的立體方向影響了氧化酶在A環(huán)和B環(huán)的羥化行為[39]。

3.2 貝葉烷型二萜 (Beyeranes)的微生物轉(zhuǎn)化 貝葉烷型二萜包括貝葉烷類及對映-貝葉烷類，在自然界多數(shù)以對映體的形式存在。對于該類二萜的生物活性文獻(xiàn)報(bào)道較少，代表性化合物為異甜菊醇(isosteviol)及其C-3位取代的類似物，具有良好的昆蟲拒食活性。Shwu-Jiuan Lin課題組采用多種微生物系統(tǒng)對異甜菊醇進(jìn)行了微生物轉(zhuǎn)化研究，得到多個非活性碳位點(diǎn)的羥基化衍生物[40-44]。當(dāng)異甜菊酮通過Baeyer-Villiger反應(yīng)生成酯后的產(chǎn)物(6)，再用真菌班尼小克銀漢霉C.bainieri進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，可得到兩個重排產(chǎn)物(7-8)和一個裂環(huán)產(chǎn)物(9)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)X射線單晶體衍射確定(見圖4)[44]。為了得到更多結(jié)構(gòu)新穎且具有生物活性的貝葉烷型化合物，該課題組將異甜菊醇經(jīng)過堿水處理得到肟化產(chǎn)物，再經(jīng)A.niger和犁頭霉屬的A.pseudocylindrospora進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，不僅得到一定數(shù)量的C-1或C-7位羥基化衍生物，還得到含有內(nèi)酰胺基團(tuán)和腈基基團(tuán)的衍生物[43,45]。以上研究提示，異甜菊醇C-8/13位橋環(huán)的結(jié)構(gòu)改造可以結(jié)合化學(xué)反應(yīng)與微生物轉(zhuǎn)化法，能得到更多結(jié)構(gòu)新穎、活性提高的貝葉烷型二萜。此外，異甜菊醇的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物7β-hydroxy-isosteviol以及11β、12β或17位發(fā)生羥基化的異甜菊醇具有抑制埃-巴二氏病毒抗原(Epetein-Barr virus early antigen)的活性[46]。

圖4 貝葉烷二萜衍生物(6)經(jīng)Cunninghamella bainieri轉(zhuǎn)化得到的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(7-8)和內(nèi)酯環(huán)開環(huán)產(chǎn)物(9)Fig.4 Two rearrangement products(7-8)and a lactone ring-cleavage product(9) obtained by biotransformation of 6 with Cunninghamella bainieri

3.3 其他四環(huán)二萜的微生物轉(zhuǎn)化 貝殼杉烷型、阿替生烷型(astisanes)、貝葉烷型和綽奇烷型(trachylobanes)二萜在生物合成和化學(xué)結(jié)構(gòu)上有著緊密聯(lián)系，四類結(jié)構(gòu)在酸水條件下易通過碳正離子重排相互轉(zhuǎn)換。其中，綽奇烷二萜與其他3種四環(huán)二萜最大的區(qū)別在于其C-12、C-13和C-16位形成三元碳環(huán)，嚴(yán)格說為五環(huán)二萜。有相關(guān)研究表明微生物產(chǎn)生的酶系可以促使四類二萜發(fā)生骨架轉(zhuǎn)化。Fraga等用M.plumbeus對一個對映-綽奇烷二萜(trachinodiol，9)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到一系列A環(huán)羥基化產(chǎn)物和一個對映-貝殼杉烷二萜(10)，并推測該對映-貝殼杉烷二萜產(chǎn)物是通過開環(huán)、重排和氧化產(chǎn)生的(見圖5)[47]，說明了綽奇烷型與貝殼杉烷型二萜之間的轉(zhuǎn)化。該重排過程與之前推測的毒馬草屬SideritisL.植物中對映-綽奇烷二萜與對映-貝殼杉烷二萜相互衍生的途徑相似[47]。類似的，Leverrier等[48]用匍枝根霉R.arrhizus對木瓣樹屬植物Xylopiacaudata中分得的一個對映-綽奇烷二萜(ent-trachyloban-18-oic acid，11)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到了3個對映-貝殼杉烷型二萜骨架的羥基化衍生物(12-14)。該結(jié)果進(jìn)一步表明綽奇烷型二萜能經(jīng)微生物酶發(fā)酵后可轉(zhuǎn)化為貝殼杉烷型二萜(圖6)。此外，還得到一個綽奇烷型骨架重排的化合物(15)(圖6)，該重排產(chǎn)物的三元環(huán)由C-12/13/16位重排至C-11/12/13位，此類二萜骨架是首次在自然界發(fā)現(xiàn)[48]。

圖5 綽奇烷二萜衍生物(trachinodiol，9)經(jīng)Mucor plumbeus轉(zhuǎn)化得到的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(10)Fig.5 A rearrangement product(10)obtained by biotransformation of 9 with Mucor plumbeus

另有研究表明貝葉烷型二萜和貝殼杉烷型二萜經(jīng)過微生物發(fā)酵后也能發(fā)生骨架轉(zhuǎn)化。Chang等[41]用灰色鏈霉菌S.griseus和班尼小克銀漢霉C.bainieri對骨架為對映-貝殼杉烷型二萜16α,17-環(huán)氧甜菊醇(steviol-16α,17-epoxide)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到8個對映-貝葉烷型二萜羥基化衍生物。該研究表明，特定的微生物酶系能將貝殼杉烷型二萜轉(zhuǎn)化為貝葉烷型二萜。

4 大環(huán)二萜的微生物轉(zhuǎn)化

常見的大環(huán)二萜類骨架包括西松烷型(cembranes)、假白欖烷型(jatrophanes)、續(xù)隨子烷型(lathyranes)、巴豆烷型(tiglianes)、瑞香烷型(daphnanes)、巨大戟烷型(ingenanes)、麻風(fēng)樹烷型(jatropholanes)及曼西烷型(myrsinanes)等，這類多元大環(huán)二萜類化合物從生源上絕大多數(shù)是從香葉基香葉醇磷酸酯衍生而成。大環(huán)二萜類衍生物多具有明顯生理活性，如從大戟科植物中發(fā)現(xiàn)的巴豆烷型二萜具有顯著的抗腫瘤和抗HIV病毒活性[49]，一直是天然藥物研究中的熱點(diǎn)，但目前為止，對該類二萜的微生物轉(zhuǎn)化研究報(bào)道較少。

假白欖烷二萜多數(shù)具有如羥基、酯、酮等氧化官能團(tuán)，該類二萜主要分布在大戟科大戟屬等植物中。此類二萜具有多種生物活性，最引人注目的是其逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性活性和P-蛋白抑制活性。Pertino等[50]用黑曲霉A.niger對從大戟科植物Jatrophaisabelli中分得的一個假白欖型二萜假白欖酮(jatrophone)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到其C-8/12閉環(huán)的產(chǎn)物，但該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對人胃癌細(xì)胞AGS和人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的細(xì)胞毒活性降低。

金錢松二萜是從土槿皮中分得的一系列結(jié)構(gòu)獨(dú)特的二萜類化合物，土槿皮PseudolaricisCortex為傳統(tǒng)中藥，為松科植物金錢松Pseudolarixkamefer的干燥根皮。該類二萜具有三環(huán)骨架，其中五元環(huán)與七元環(huán)反式稠合，并在稠合碳位置上含有一個內(nèi)酯環(huán)。這類二萜化合物有明顯的抗真菌、抗生育、抗血管生成等活性。Zhang等[51]用真菌球毛殼菌Chaetomiumglobosum對土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，圖6)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，分別得到18-?；彼?pseudolaric acid B 18-oyl-alanine)和18-?；z氨酸(pseudolaric acid B 18-oyl-serine)取代的產(chǎn)物，并經(jīng)X射線單晶體衍射確定其結(jié)構(gòu)和絕對構(gòu)型，不過其抗真菌活性要明顯低于底物土槿皮乙酸。

圖6 對映綽奇烷二萜衍生物(11)經(jīng)Rhizopus arrhizus轉(zhuǎn)化得到的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(12-15)Fig.6 Four rearrangement products(12-15)obtained by biotransformation of 11 with Rhizopus arrhizus

5 小結(jié)與展望

微生物轉(zhuǎn)化是改變各種二萜衍生物底物結(jié)構(gòu)的重要手段，其中最主要的修飾結(jié)構(gòu)反應(yīng)是區(qū)域選擇性和立體選擇性羥化反應(yīng)，羥基化位置與構(gòu)型是由底物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和微生物體酶系共同決定的。不同微生物體系轉(zhuǎn)化底物得到的產(chǎn)物數(shù)量和產(chǎn)率有很大不同，而且轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化體系下可進(jìn)行多步的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。通過微生物轉(zhuǎn)化方法，幾乎可實(shí)現(xiàn)在二萜衍生物的所有位置進(jìn)行羥基化。這些羥基化產(chǎn)物不但增加了水溶性，而且為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾提供活性位點(diǎn)。另一類重要的轉(zhuǎn)化反應(yīng)為重排反應(yīng)，這種復(fù)雜的酶催化體系下的碳骨架重排結(jié)構(gòu)為研究藥物的構(gòu)效關(guān)系以及各種二萜結(jié)構(gòu)之間的生源關(guān)系提供了重要的科學(xué)素材。此外，通過微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與底物在哺乳動物中的代謝產(chǎn)物比較，可對藥物在人體內(nèi)的代謝途徑和產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測，利用微生物轉(zhuǎn)化制備相關(guān)代謝產(chǎn)物，具有成本低、重現(xiàn)性好、易批量制備等特點(diǎn)。

但是現(xiàn)階段的微生物轉(zhuǎn)化尚具有較大的盲目性。微生物轉(zhuǎn)化主要還是通過底物與微生物混合體系共發(fā)酵方法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。這個孵化過程變量多、體系復(fù)雜、難以進(jìn)行分解研究，在合成上無法進(jìn)一步闡述真正催化化學(xué)反應(yīng)的酶系特點(diǎn)。加之菌株一旦發(fā)生變異，酶系類型也可能發(fā)生變化。因此，現(xiàn)階段微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并不能提前預(yù)測反應(yīng)結(jié)果，更難以從底物合成目標(biāo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。因此，為了增加生物合成效率，應(yīng)增加對微生物轉(zhuǎn)化菌株酶系的研究，利用多種生化手段，對轉(zhuǎn)化酶系的分離、提純、表征和功能進(jìn)行研究，闡明底物在特定酶系下的轉(zhuǎn)化過程和轉(zhuǎn)化機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制清楚和目標(biāo)可控的目標(biāo)。

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(編校：王冬梅)

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Research progress on microbial transformations of diterpenoids

WU Yi-qing, YU Jing-xiang, CHENG Zhi-hongΔ

(School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

Diterpenoids are important plant secondary metabolites, which contain 20 carbons. Many well-known drug molecules belong to diterpenoids, such as paclitaxel, andrographolides and ginkgolides. Diterpenoids are a research hotspot in natural product chemistry. Structural modification of diterpenoids by microbial transformations is an important approach for discovery of leading compounds of diterpenoids derivatives. This review article focuses on the microbial transformation of diterpenoids(Labdanes,Clerodanes,Ginkgolides;Abietanes,Pimaranes,Taxanes;Kauranes,Beyeranes;Jatrophanes,Pseudolaricis,et al) including different reaction types, the structure diversity of biotransformed products, and their biological activity changes between substrates and products.

diterpenoids; microbial transformation; labdanes; abietanes

吳亦晴，女，碩士在讀，研究方向：中藥成分的微生物轉(zhuǎn)化，E-mail: yiqingwu13@fudan.edu.cn；程志紅，通信作者，男，博士，副研究員，研究方向：中藥成分的微生物轉(zhuǎn)化，E-mail: chengzhh@fudan.edu.cn。

R284.3

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10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.03