何姍，王朝臣，王樹卿

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402）

?

吸附法發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖固定細胞的條件研究

何姍，王朝臣，王樹卿

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402）

摘要：經(jīng)優(yōu)化篩選，選擇聚氨酯泡沫（HP）為載體，在pH值為7.0，溫度36℃，轉(zhuǎn)速240 r/min因素下，研究優(yōu)化了吸附法一級種子固定化的培養(yǎng)條件，結(jié)論是40 mL培養(yǎng)基裝0.3 g載體（約為30片HP片）培養(yǎng)14 h。在此基礎(chǔ)上對二級種子固定化的培養(yǎng)時間進行了優(yōu)化，結(jié)論是5 h，相比一級固定化，二級固定化性能明顯增加。

關(guān)鍵詞：D-核糖；吸附法；種子固定化；

D-核糖是一種具有重要生理功能的五碳糖，在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的用途［1］。D-核糖最主要的生產(chǎn)方法是微生物發(fā)酵法。固定化技術(shù)是將細胞或酶限制在一定空間范圍內(nèi)并連續(xù)使用的一種方法，固定化細胞不但可以提高生產(chǎn)效率，延長細胞壽命，增加生產(chǎn)能力而且在生產(chǎn)后期易于細胞的分離、回收［2］。目前固定化細胞的方法主要有包埋法［3］和吸附法［4］。其中吸附法相比包埋法操作簡單、相比游離發(fā)酵D-核糖產(chǎn)量高和載體廉價等優(yōu)點［5］。吸附法固定細胞主要是在種子培養(yǎng)階段進行固定，因此，本文主要對種子培養(yǎng)階段的條件進行了探索，以期達到提高發(fā)酵產(chǎn)量、縮短發(fā)酵周期。

1　材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種

D-核糖生產(chǎn)菌株－轉(zhuǎn)酮酶缺陷型枯草芽孢桿菌。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏7.0，蛋白胨15.0，山梨醇5.0，氯化鈉2.0，磷酸氫二鉀2.0磷酸二氫鉀1.0，瓊脂26，調(diào)pH值7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏5.0，磷酸氫二鉀3.0，磷酸二氫鉀1.0，葡萄糖20.0，調(diào)pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖150.0，硫酸銨7.0，硫酸錳0.05，玉米漿20.0。加碳酸鈣15.0。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)：接菌種于斜面培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)24 h。

種子培養(yǎng)：接一環(huán)菌于裝有40 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，旋轉(zhuǎn)式搖床240 r/min，36℃培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)：以15片聚氨酯泡沫（HP）接入裝有30 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，旋轉(zhuǎn)式搖床240 r/ min，36℃培養(yǎng)。

1.2.2分析測定方法

菌絲體干重測定：菌絲體于80℃烘干至恒重后稱量。

2　結(jié)果與討論

固定化細胞應(yīng)具有穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以在一定的pH值和溫度下，不會被破壞［3］；雖然提高轉(zhuǎn)速有助于發(fā)酵生產(chǎn)［6］，但是搖床轉(zhuǎn)速有限，只能通過裝液量的優(yōu)化來約束溶氧水平和蒸發(fā)量，進而彌補轉(zhuǎn)速不足。所以實驗選定pH值為7.0，溫度36℃，240 r/min進行其他因素試驗研究。

2.1載體的選擇

作吸附固定化的載體很多，其共同點是空隙率高。雖然多孔玻璃、海綿片、陶瓷片、小磚片、木屑、硅藻土、多孔硅和焦炭都是易得的載體，但是不同的載體對不同的菌種固定化性能是不同的。本文選取木屑、小磚片、聚氨酯泡沫（HP）做了對比試驗，其中HP片的空隙率可達90%以上。由于磚片密度較大經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)在瓶底磨損太多，對固定化細胞的表征影響很大，所以選擇放棄。以下是HP和木屑的實驗數(shù)據(jù)見表1。

試驗結(jié)果表明，以上兩種載體都能吸附細胞，而且都能生產(chǎn)目的產(chǎn)物，證明吸附法固定可行。但木屑固定化中游離細胞和固定化的細胞總和較HP中的小很多，表明木屑對這種菌的生長可能有副作用。而HP空隙率的固定化效率和固定化能力都是較大的，而且HP常見、廉價，所以最終確定HP為吸附固定化載體。

表1　不同載體比較

2.2一級種子固定化

2.2.1一級種子固定化時間的確定

趙艷麗等［5］固定化時間一般是12 h，本實驗選擇從10 h開始計數(shù)以“載體吸附細胞干重/載體干重”為表征［7，8］，以大口三角瓶每瓶裝載體0.202 g種子液40 mL進行種子培養(yǎng)。實驗數(shù)據(jù)見圖1。

圖1　一級種子固定化時間曲線

圖1表明隨著時間的延長，固定化效果增強，14 h后固定化效果開始降低，雖然到了16 h，固定化效果再次出現(xiàn)增強趨勢，考慮到時間、效率，本試驗最終確定固定化時間是14 h。

2.2.2一級種子固定化載體量優(yōu)化

種子固定化階段載體的多少可能會影響菌體的生長或影響固定化效果，綜合考慮多方面因素，載體量與裝液量應(yīng)該有一個適合的比例，對此作了實驗，結(jié)果見圖2。

圖2　載體量影響圖

圖2表明載體量對載體的固定性能有一定的影響，載體量增大固定性能下降明顯；而載體量的增加總的固定細胞數(shù)也會增加，綜合考慮以上兩點，從圖中可以看出選擇0.3 g載體為宜，這樣既可有較好的固定化性能又可以兼顧到總的固定細胞量。本試驗最終確定固定化載體量為“0.3 g載體/40 mL種子液”。

2.2.3種子固定化裝液量確定

最初，根據(jù)以前做的游離細胞實驗裝液量數(shù)據(jù)選擇了40mL，在此將保持載體量與裝液量的比不變對裝液量的時間曲線進行平行擴大實驗，實驗數(shù)據(jù)見圖3。

圖3　不同裝液量時間曲線

圖3表明40 mL的裝液量較為合適。最后決定一級固定化用40 mL培養(yǎng)基，0.3 g載體，培養(yǎng)14 h。

2.3二級種子固定化

由于是搖瓶培養(yǎng)，在一級培養(yǎng)轉(zhuǎn)二級培養(yǎng)時染菌幾率大，所以其他條件不宜進行優(yōu)化，本實驗是以一級固定化的裝液量和載體量不變只確定二級種子固定化時間，實驗結(jié)果見圖4。

圖4　二級種子培養(yǎng)時間曲線

圖4可見在二級種子培養(yǎng)初期載體固定性能有所下降，這應(yīng)該是載體與培養(yǎng)基之間存在細胞量的平衡導(dǎo)致的。二級固定化時間較短而且后期固定化效果下降，這應(yīng)該是因為自以及固定化后載體已經(jīng)吸附了大量細胞，到二級固定化的后期營養(yǎng)不足菌種自溶造成的。為此對后期的種子剩余液做了鏡檢，觀察有大量細胞自溶，但此不能說明載體內(nèi)部的細胞生長狀況，所以這一現(xiàn)象還需其他方法檢測。

由于生產(chǎn)D-核糖所用的枯草芽孢桿菌在種子階段成鏈狀生長，選擇二級種子固定可以延長種子在載體空隙中的生長時間，使菌體生長的更加長而粗壯數(shù)量更多，從而使空隙與菌體之間固定更加牢固，對固定化效果會有所加強。該實驗數(shù)據(jù)表明二級固定化較一級固定化固定化性能明顯增加。

3　結(jié)論

3.1本文首先對吸附載體進行了選擇，選擇幾種常見廉價的載體中做實驗，確定用HP做載體，吸附固定化枯草芽孢桿菌。

3.2文章對一級種子固定化進行了研究，優(yōu)化了時間、裝液量、載體量等重要參數(shù)。結(jié)果顯示以40 mL培養(yǎng)基裝0.3 g載體（約為30片HP片）培養(yǎng)14效果最好。

3.3二級種子固定化在一級種子固定化參數(shù)基礎(chǔ)上只對培養(yǎng)時間進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示二級種子固定化培養(yǎng)時間以5 h為益。結(jié)果還表明在固定化后期存在菌體自溶現(xiàn)象。

參考文獻：

［1］Zimmer H G．The oxidative pentose phosphate pathway in the heart regulation［J］．physiological significance，and clinical impli?cation．Basic Research in Cardiology，1992，87（4）：303—316.

［2］成慶利，滑冰．固定化細胞研究進展［J］.河南教育學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2003，12（2）：53-54.

［3］肖美艷，陳志文，等.包埋法固定化細胞技術(shù)研究進展［J］.生物工程進展，2003，24（4）∶158-160.

［4］鄧曉泉.吸附法固定微生物細胞研究進展［J］.生物工程進展，1993，13（4）∶6-8.

［5］趙艷麗，胡斌，等.固定化發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（9）∶97-100.

［6］彭彥峰.發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖參數(shù)分析方法和發(fā)酵工藝研究［D］.河北工業(yè)大學(xué)，2003.

［7］生物合成藥物學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［8］張志平.中國新抗生素研究進展［J］.中國抗生素雜志，1998，23 （2）∶81.

Study on fermentation of d-ribose by immobilized cells through adsorption method

HE Shan，WANG Chao-chen，WANG Shu-qing
（Tianjin Bohai Vocational Technical College，Tianjin 300402）

Abstract:Choosing polyurethane foam（HP）as the carrier after optimal screening，studying and optimizing the culture conditions of adsorption method D-ribose level one seeds immobilization，in the factors that pH value of 7.0，temperature 36℃，the rotation rate of shaking table 240 r/min.The result is 40 ml culture medium，installed 0.3 g carrier（about 30 piece of HP piece）and cultured 14 h.Based on this，optimized the culture time of level two seeds immobilization，the conclusion is 5 h，compared with level one immobilization，level two immobilization obviously improves the features.

Key words：D-ribose；adsorption method；seeds immobilization conditions

doi：10.3969/j.issn.1008-1267.2016.01.010

中圖分類號：TQ929

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1267（2016）01-0028-04

收稿日期：2015-09-15