車榮曉，王　芳，王艷芬，鄧永翠，張　靜，馬　雙，崔驍勇,*

1 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京　100049 2 格里菲斯大學(xué)，布里斯班　4111 3 南京師范大學(xué)，南京　210023

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土壤微生物總活性研究方法進(jìn)展

車榮曉1,2，王芳1，王艷芬1，鄧永翠3，張靜1，馬雙1，崔驍勇1,*

1 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049 2 格里菲斯大學(xué)，布里斯班4111 3 南京師范大學(xué)，南京210023

摘要:微生物總活性是指在某一時(shí)段內(nèi)微生物所有生命活動(dòng)的總和，它直接決定著微生物行使生理、生態(tài)功能的能力，是微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，也是難點(diǎn)。迄今為止，還沒(méi)有建立直接測(cè)定微生物總活性的方法，只能用一些相關(guān)指標(biāo)來(lái)間接反映它。目前常用的指標(biāo)主要包括微生物的呼吸速率、生長(zhǎng)速率以及胞內(nèi)RNA含量等。與其它一些基質(zhì)和環(huán)境相比，測(cè)定土壤中的微生物總活性更為困難。通過(guò)總結(jié)研究土壤微生物總活性常用的3種方法，在簡(jiǎn)略概括傳統(tǒng)的土壤微生物呼吸測(cè)定法的基礎(chǔ)上，詳細(xì)介紹了放射性同位素標(biāo)記法和RNA直接表征法的原理和操作流程，整理歸納了一些重要應(yīng)用案例，比較分析了不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為選擇研究土壤微生物總活性的適宜方法提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：土壤微生物；微生物總活性；土壤微生物呼吸；微生物生長(zhǎng)活性；土壤RNA

當(dāng)前微生物生態(tài)學(xué)的研究正從兩個(gè)方面展開(kāi)：即微生物多樣性和微生物功能，前者關(guān)注特定環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)，廣泛采用分子生物學(xué)研究方法，并取得了顯著進(jìn)展；后一方面的研究深化了對(duì)微生物介導(dǎo)的特定生態(tài)過(guò)程的理解。微生物生態(tài)學(xué)研究的最終目標(biāo)是建立微觀尺度的微生物群落結(jié)構(gòu)與宏觀尺度的生態(tài)系統(tǒng)功能之間的聯(lián)系，而微生物活性正是整合兩者不可或缺的紐帶。鑒于其極端重要性，微生物活性已經(jīng)成為相關(guān)研究必須測(cè)定的基本指標(biāo)，粗略檢索發(fā)現(xiàn)，近些年每年都有上百篇生態(tài)、環(huán)境、土壤等方面的研究論文測(cè)定了微生物活性，但是基于研究目的和實(shí)驗(yàn)條件的不同，微生物活性的內(nèi)涵和測(cè)定方法也有很大的差異，因此迫切需要界定微生物活性的含義，完善和開(kāi)發(fā)微生物活性的測(cè)定方法。

微生物活性又稱為微生物代謝活力[1]，嚴(yán)格意義上是指微生物在某一時(shí)段內(nèi)所有生命活動(dòng)的總和，或在環(huán)境介質(zhì)中微生物介導(dǎo)的所有過(guò)程的總和。從上述定義可以看出，直接測(cè)定微生物活性近乎是不可能的。基于此，絕大部分研究用特定代謝過(guò)程的速率來(lái)反映微生物的特定活性，如跟氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)的固氮活性[2]、硝化及反硝化活性[3]，與碳轉(zhuǎn)化相關(guān)的纖維素分解活性[4]等。這些研究為理解微生物在生態(tài)系統(tǒng)的特定功能過(guò)程中的作用提供了重要基礎(chǔ)，但是往往不能反映環(huán)境中微生物整體的代謝狀態(tài)和綜合生態(tài)系統(tǒng)功能。另一些研究則試圖尋找相關(guān)指標(biāo)(proxy)，間接反映微生物的總活性[5- 7]。

任何生命活動(dòng)都需要能量供給，因此與能量供給相關(guān)的指標(biāo)可以用來(lái)表征微生物總活性。這些指標(biāo)主要包括微生物的ATP含量、呼吸速率等。由于ATP指征法存在較大的缺陷，現(xiàn)在更多采用呼吸速率反映微生物總活性[8- 10]。通常認(rèn)為微生物活性與生長(zhǎng)速率有正相關(guān)關(guān)系，即生長(zhǎng)速率快的微生物具有更高的活性，所以微生物的生長(zhǎng)速率也已成為表征微生物總活性的重要指標(biāo)之一。早先的研究多采用平板計(jì)數(shù)或測(cè)量微生物生物量等方法測(cè)定微生物的生長(zhǎng)速率，這些方法效率較低，已逐漸被放射性同位素標(biāo)記法取代[6]。RNA與生物體內(nèi)各種酶的合成密不可分，而酶是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，隨著RNA提取和定量方法的發(fā)展，用微生物胞內(nèi)RNA濃度來(lái)表征微生物總活性的方法逐步完善，并被推廣應(yīng)用[5]。

相比于其他環(huán)境介質(zhì)，土壤基質(zhì)具有更為復(fù)雜的組成和結(jié)構(gòu)，對(duì)微生物總活性的測(cè)定有較大的干擾，測(cè)定更加困難。目前有關(guān)土壤微生物總活性的研究主要采用土壤微生物呼吸測(cè)定法、放射性同位素標(biāo)記法及RNA直接表征法進(jìn)行，其中土壤微生物呼吸測(cè)定法作為研究微生物總活性的經(jīng)典方法已為國(guó)內(nèi)外研究者所熟知，而放射性同位素標(biāo)記法和RNA直接表征法出現(xiàn)的時(shí)間相對(duì)較短，雖然在國(guó)際上已有大量的研究和應(yīng)用[5- 6]，但在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)該方法的研究報(bào)道。在此，簡(jiǎn)要概述土壤微生物呼吸測(cè)定法，詳細(xì)介紹放射性同位素標(biāo)記法和RNA直接表征法在研究微生物總活性中的應(yīng)用，比較各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，供微生物生態(tài)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和微生物工程等領(lǐng)域的相關(guān)研究人員參考。

1土壤微生物呼吸測(cè)定法

微生物呼吸是指微生物通過(guò)分解有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生能量的過(guò)程，它是微生物幾乎所有生命活動(dòng)的能量來(lái)源。因此，呼吸作用的強(qiáng)弱在很大程度上可以反映微生物的總活性，而基于呼吸速率的微生物活性測(cè)定也已成為土壤微生物研究最常用的方法之一。

土壤微生物呼吸速率常用的測(cè)定方式有3種：CO2釋放速率、O2消耗速率和呼吸引起的溫度變化，其中尤以前兩種方法最為常用。為排除動(dòng)、植物的影響，土壤微生物呼吸速率多在非原位狀態(tài)下測(cè)定：即采集土壤樣品，去除其中的植物根系后，置于一定的溫度、水分等條件下培養(yǎng)。在此過(guò)程中CO2或O2濃度的變化一般采用氣相色譜儀、紅外氣體分析儀(IRGA)、氧電極或?qū)ｉT(mén)的呼吸儀等儀器測(cè)定[7]，溫度變化的測(cè)定則需要高精度測(cè)溫裝置[7]。

微生物呼吸測(cè)定能較為準(zhǔn)確地反映微生物總活性，且技術(shù)要求低，因此最早得到廣泛的應(yīng)用。呼吸作用是碳循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，CO2是呼吸作用的主要產(chǎn)物，又是最主要的溫室氣體之一，隨著全球變暖問(wèn)題日益凸顯，微生物在碳素轉(zhuǎn)化中的作用愈發(fā)廣受關(guān)注。測(cè)定微生物呼吸既能反映土壤微生物總活性，又能表征其在碳素轉(zhuǎn)化中的生態(tài)功能，因此該方法至今仍是測(cè)定土壤微生物活性最常用的方法之一。在測(cè)定土壤微生物呼吸速率的同時(shí)，結(jié)合多種土壤酶活性的分析[11- 13]，可以更準(zhǔn)確地反映和理解土壤微生物總活性。

微生物呼吸測(cè)定法也存在明顯的缺陷。首先，CO2生成速率或O2消耗速率實(shí)際上反映的是有機(jī)碳礦化速率和有氧呼吸速率，與真實(shí)的微生物呼吸速率之間可能會(huì)有較大偏差[14]；而測(cè)定土壤溫度的變化又難以排除環(huán)境溫度變化的影響，應(yīng)用范圍較窄。其次，要準(zhǔn)確測(cè)定土壤微生物呼吸必須消除植物根系呼吸和土壤動(dòng)物呼吸的影響，導(dǎo)致該方法難以實(shí)現(xiàn)原位測(cè)定。再次，該方法不能獲得活性微生物種類的信息，不能建立微生物總活性與活性微生物種類之間的聯(lián)系。

綜上所述，該方法適用于土壤動(dòng)、植物干擾較少，又不需要了解土壤活性微生物種類的研究?；贑O2生成速率的土壤微生物總活性測(cè)定適用于有機(jī)碳作為微生物的主要能源的土壤；基于O2消耗速率的方法則更適用于通氣性良好、微生物以有氧呼吸為主的土壤；而基于溫度變化的測(cè)定方法，因?yàn)樾枰O(shè)置無(wú)呼吸對(duì)照，則更適用于室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

2放射性同位素標(biāo)記法

通常生長(zhǎng)速率快的微生物也具有更高的代謝活性，因此生長(zhǎng)速率也是表征微生物總活性的常用指標(biāo)之一。微生物大分子的合成速率與微生物的生長(zhǎng)速率有很好的相關(guān)性，由于放射性同位素檢測(cè)的靈敏度很高，在環(huán)境中只需添加痕量的放射性同位素標(biāo)記的大分子前體物質(zhì)，經(jīng)短時(shí)間孵育后，通過(guò)測(cè)定微生物體內(nèi)相應(yīng)大分子物質(zhì)的放射性活度，就可以反映微生物的生長(zhǎng)速率。該類方法由于只添加痕量的前體物質(zhì)，在孵育階段對(duì)微生物的生長(zhǎng)、代謝影響較小，因此成為測(cè)定微生物生長(zhǎng)速率的常用方法。經(jīng)過(guò)大量嘗試和篩選，目前應(yīng)用最多的前體物質(zhì)為胸腺嘧啶核苷(TdR)、亮氨酸(Leu)以及醋酸鹽。在土壤微生物研究中，放射性胸腺嘧啶核苷標(biāo)記法、放射性亮氨酸標(biāo)記法常用于測(cè)定土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)速率；放射性醋酸鹽標(biāo)記法常用于測(cè)定真菌的生長(zhǎng)速率(表1)。

胸腺嘧啶核苷是DNA合成的前體之一，與微生物的分裂、增殖密切相關(guān)。早在1974年Thomas等就已使用放射性胸腺嘧啶核苷標(biāo)記法測(cè)定土壤微生物的生長(zhǎng)速率[15]，該方法曾一度成為研究水生環(huán)境中微生物生長(zhǎng)速率的標(biāo)準(zhǔn)方法。但近期有研究發(fā)現(xiàn)，很大一部分微生物并不能吸收胞外胸腺嘧啶核苷，因此該方法測(cè)定的結(jié)果不能準(zhǔn)確反映微生物總活性[16]。

亮氨酸是蛋白質(zhì)合成的前體之一，與微生物的生長(zhǎng)、代謝關(guān)系密切。環(huán)境中絕大多數(shù)微生物都能直接利用胞外亮氨酸[16]，而且微生物胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量要顯著高于DNA含量，所以亮氨酸標(biāo)記法已有取代胸腺嘧啶核苷標(biāo)記法的潛勢(shì)[17]。盡管在有些研究中兩種方法得到的結(jié)果較為一致[18- 19]，但在另外一些研究中這兩種方法測(cè)得的微生物生長(zhǎng)速率差異較大[20- 21]。建議最好將兩種方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行土壤微生物總活性研究，在條件無(wú)法滿足時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮使用放射性亮氨酸標(biāo)記法。

醋酸鹽是真菌麥角固醇合成的前體物質(zhì)。盡管并不是只有真菌才能利用醋酸鹽，但是麥角固醇卻是真菌所特有的，是其細(xì)胞膜的重要組分。因此，可以通過(guò)分離并測(cè)定麥角固醇的放射性活度，排除其它微生物的影響?；诖?，放射性醋酸鹽標(biāo)記法可用于測(cè)定真菌的生長(zhǎng)速率。Pennanen等在1998年首次使用這一方法研究土壤中真菌的生長(zhǎng)速率[22]，此后，該方法被廣泛應(yīng)用于此類研究中[23- 25]。

應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記法測(cè)定土壤微生物總活性的傳統(tǒng)方法不需要分離提取土壤微生物，而是直接向用蒸餾水制備的土壤懸濁液中施入放射性標(biāo)記的前體物質(zhì)。此后B??th改進(jìn)了這一方法，先將土壤中的微生物使用“混勻-離心”的方法提取出來(lái)，之后再進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記[26]。流程改進(jìn)后可以有效地排除同位素標(biāo)記物質(zhì)被土壤顆粒吸附引起的干擾[6]?，F(xiàn)在，胸腺嘧啶核苷和亮氨酸標(biāo)記法一般采用B??th改進(jìn)的流程[27]，但由于從土壤中提取真菌的效率較低，采用醋酸鹽標(biāo)記法研究土壤真菌總活性時(shí)一般采用不提取真菌的傳統(tǒng)流程。不管采用傳統(tǒng)方法還是B??th改進(jìn)的方法，在放射性同位素標(biāo)記的前體加入之前都要將待測(cè)體系置于測(cè)試溫度下穩(wěn)定10min左右；在施入放射性同位素標(biāo)記的前體后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的孵育時(shí)間(一般Leu和TdR標(biāo)記法為1—2 h；醋酸鹽標(biāo)記法為4 h左右)；孵育結(jié)束后向體系中加入適量5%的福爾馬林，殺死微生物并終止反應(yīng)；之后選用合適的方法提取相應(yīng)的大分子物質(zhì)(Leu標(biāo)記法需提取蛋白質(zhì)；TdR標(biāo)記法需提取DNA；醋酸鹽標(biāo)記法則需要提取麥角固醇)，并溶于NaOH溶液[28]；最后用液體閃爍儀測(cè)定相應(yīng)大分子物質(zhì)的放射性活度，并結(jié)合孵育時(shí)間計(jì)算微生物的生長(zhǎng)速率[26]。

表1　放射性同位素標(biāo)記法測(cè)定土壤微生物活性的主要應(yīng)用案例

Rousk等已經(jīng)對(duì)放射性同位素標(biāo)記法的應(yīng)用案例做了較為詳盡的總結(jié)[6]，但對(duì)近年的研究做了一些簡(jiǎn)單補(bǔ)充(表1)?？梢钥闯?，該方法在農(nóng)田、草地以及森林等主要陸地生態(tài)系統(tǒng)類型上都有著廣泛的應(yīng)用。如前所述，現(xiàn)在土壤細(xì)菌生長(zhǎng)速率和活性研究多采用放射性亮氨酸標(biāo)記法，僅有一個(gè)研究結(jié)合了放射性亮氨酸標(biāo)記法和放射性胸腺嘧啶核苷標(biāo)記法[25]。為提高同位素標(biāo)記法的檢測(cè)效率和靈敏度，現(xiàn)在細(xì)菌生長(zhǎng)速率的測(cè)定一般采用B??th改進(jìn)的操作流程；而因?yàn)閺耐寥乐刑崛≌婢y度較大，真菌的相關(guān)研究多采用傳統(tǒng)操作流程的放射性醋酸鹽標(biāo)記法。

應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記法測(cè)定土壤微生物的生長(zhǎng)速率和總活性有兩個(gè)問(wèn)題備受關(guān)注：一是該方法的測(cè)量結(jié)果能在多大程度上反映原位的狀況？針對(duì)這一問(wèn)題開(kāi)展的研究表明，改變一些重要的環(huán)境條件，微生物仍然能夠在數(shù)小時(shí)內(nèi)維持其原有的生長(zhǎng)速率不變，并且該方法的操作環(huán)節(jié)較易完成，一般對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響很小[26,38- 39]，因此，其測(cè)定結(jié)果可以較為準(zhǔn)確地反映土壤原位真實(shí)的微生物生長(zhǎng)速率和總活性。第二個(gè)問(wèn)題是，該方法能否特異性地測(cè)定土壤細(xì)菌或真菌的總體生長(zhǎng)速率和總活性？研究發(fā)現(xiàn)，不管采用傳統(tǒng)操作流程，還是采用B??th改進(jìn)的流程，TdR或Leu標(biāo)記法都能特異性地測(cè)定土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)速率和總活性[39- 40]。由于麥角固醇是真菌所特有的，所以醋酸鹽標(biāo)記法測(cè)定真菌生長(zhǎng)速率和總活性的特異性也較好。

當(dāng)然，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記法測(cè)定土壤微生物總活性也存在3個(gè)無(wú)法避免的缺陷。首先，放射性同位素可能會(huì)給待測(cè)微生物造成較大損害，從而影響測(cè)定結(jié)果。其次，該方法無(wú)法給出微生物的種類組成信息，只能得到較單一的土壤微生物總體生長(zhǎng)速率結(jié)果。第三，微生物生長(zhǎng)速率并不完全等價(jià)于微生物活性[5]，微生物生長(zhǎng)速率能在多大程度上表征微生物總活性也是最值得關(guān)注的問(wèn)題和研究課題。事實(shí)上，微生物活性由生長(zhǎng)活性和非生長(zhǎng)活性兩部分構(gòu)成，而微生物生長(zhǎng)速率僅能反映微生物的生長(zhǎng)活性。已有研究發(fā)現(xiàn)微生物在某些脅迫條件下會(huì)提高自身的非生長(zhǎng)活性[41]，而且土壤中的微生物絕大部分都處于非生長(zhǎng)狀態(tài)[42- 43]，沒(méi)有生長(zhǎng)活性，只有非生長(zhǎng)活性。因此，直接用微生物生長(zhǎng)速率表征微生物活性有時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大偏差。

綜上所述，放射性同位素標(biāo)記法在測(cè)定微生物生長(zhǎng)速率方面有較大優(yōu)勢(shì)，但作為微生物總活性的間接指標(biāo)，由于其只能指示生長(zhǎng)活性，存在較大的局限性?？梢杂糜诮票碚鳡I(yíng)養(yǎng)供應(yīng)及其它環(huán)境條件良好、微生物生長(zhǎng)活性占主導(dǎo)的土壤中微生物的總活性。

3RNA直接表征法

蛋白質(zhì)是絕大多數(shù)生命活動(dòng)的直接承擔(dān)者，在翻譯過(guò)程中，信使RNA(mRNA)是模板，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)是搬運(yùn)氨基酸的工具，核糖體RNA(rRNA)是構(gòu)成翻譯工廠的核心組件，它們與蛋白質(zhì)合成關(guān)系極為密切，因此通過(guò)RNA來(lái)反映微生物活性已成為一種重要的研究手段[5]。在微生物活性的研究中，mRNA常用于表征某一特定代謝過(guò)程的活躍程度，而rRNA可用于表征微生物總活性，也是本文討論的重點(diǎn)。用RNA測(cè)定土壤微生物總活性有其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)：能同時(shí)獲得微生物的代謝活性信息和活性微生物群落結(jié)構(gòu)信息；不需要孵育過(guò)程，原位測(cè)定簡(jiǎn)單易行。因此該方法已經(jīng)被廣泛采用，2013年的評(píng)述論文報(bào)道當(dāng)時(shí)已經(jīng)檢索到用該方法研究微生物總活性的報(bào)道100余篇[5]。

rRNA直接表征法測(cè)定微生物總活性有著堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。首先，rRNA是核糖體的核心組分，是蛋白質(zhì)合成的催化中心，因此胞內(nèi)rRNA的量與胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速率有著緊密的關(guān)系。其次，已有研究顯示多種微生物胞內(nèi)rRNA的含量與其生長(zhǎng)速率、代謝活性有高度相關(guān)性[44- 46]。再次，微生物的死亡和休眠往往伴隨著rRNA的降解[47- 48]，只有活性微生物中存在大量rRNA。

早期的研究多測(cè)定rRNA的總量來(lái)表征微生物總活性，而現(xiàn)在多趨向于直接分析SSU rRNA的拷貝數(shù)來(lái)表征微生物總代謝活性。這是因?yàn)槲⑸矬w內(nèi)SSU rRNA(核糖體小亞基rRNA)與rRNA總量有良好的線性相關(guān)關(guān)系，而且SSU rRNA基因是微生物研究中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記。通常16S rRNA用于表征土壤細(xì)菌和古菌總活性；18S rRNA則用于表征土壤真菌總活性。

SSU rRNA表征法測(cè)定微生物總活性的操作流程如下：1)土壤樣品采集；2)土壤總RNA和土壤總DNA提?。?)土壤總RNA反轉(zhuǎn)錄；4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定SSU rRNA基因和SSU rRNA的拷貝數(shù)；5)通過(guò)克隆文庫(kù)、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)、高通量測(cè)序等技術(shù)確定土壤活性微生物的群落組成。其中樣品保存、RNA提取及活性表征方式需要特別注意。

(1)樣品的保存問(wèn)題

相比基于DNA的微生物生態(tài)學(xué)研究，用于RNA研究的土壤樣品的保存要求更為嚴(yán)格。通常要求樣品在采集后即刻進(jìn)行液氮速凍；在運(yùn)輸過(guò)程中無(wú)法實(shí)現(xiàn)液氮保存時(shí)，可用干冰凍存作為短期的替代選擇；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)則要求-80 ℃凍存。此外，現(xiàn)在有很多試劑公司已推出RNA保護(hù)液類產(chǎn)品，可抑制RNA的合成和降解，實(shí)現(xiàn)常溫下樣品的短期保存。

不當(dāng)?shù)谋４娣椒赡芤餜NA降解，甚至導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。更為嚴(yán)重的是保存方法不當(dāng)還會(huì)造成實(shí)驗(yàn)假象。過(guò)高的保存溫度——例如簡(jiǎn)單的冷凍保存或常溫保存——并不能完全阻止微生物體內(nèi)RNA的合成與降解。而通常樣品保存的條件與土壤原位環(huán)境條件差異較大，這會(huì)導(dǎo)致測(cè)定時(shí)樣品中的RNA實(shí)際反映的是樣品保存條件下的微生物活性狀態(tài)，而非采樣時(shí)土壤原位條件下的微生物活性狀態(tài)。常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)假象有16S rRNA表征的活性細(xì)菌群落比16S rRNA基因表征的總細(xì)菌群落的種間親緣關(guān)系更近，微生物總活性在各處理間無(wú)顯著差異等。

總結(jié)近期用rRNA直接表征法研究土壤微生物活性的報(bào)道(表2)，結(jié)果顯示用液氮或-80 ℃保存土壤樣品時(shí)，活性微生物群落結(jié)構(gòu)能反映試驗(yàn)處理間的差異，我們待發(fā)表的數(shù)據(jù)也證實(shí)增溫會(huì)顯著改變活性細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)(土樣為液氮保存)。在較高溫度下保存土壤樣品，則可能降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。例如，M?nnist?等研究積雪在不同月份對(duì)活性微生物群落的影響[49]，5月份采集的土壤樣品保存在4 ℃，6月份的樣品在環(huán)境溫度下保存，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5、6月份的土壤活性細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。雖然作者在文中提及他們所采用的土壤保存方法不會(huì)影響用rRNA研究土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但是我們很難辨別這種群落差異是不是因?yàn)闃悠繁４娣绞讲划?dāng)所造成的假象。再如Angel等調(diào)查沿降水梯度的活性微生物群落[50]，僅用冰盒保存土壤樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性微生物群落結(jié)構(gòu)僅在水分含量不同的土壤間表現(xiàn)出差異，但有理由懷疑溫度的效應(yīng)可能被不當(dāng)?shù)谋４娣椒ㄔ斐傻募傧笏谏w。

表2　RNA直接表征法測(cè)定土壤微生物總活性的主要應(yīng)用案例

圖1　土壤RNA提取電泳圖Fig.1　Electrophoretogram of soil RNA　a：正常的土壤RNA電泳圖；b：有基因組DNA殘留的土壤RNA電泳圖

(2) 土壤RNA提取問(wèn)題

土壤RNA有多種提取方法，劉華等總結(jié)了包括Trizol法、SDS-Phenol法和試劑盒法在內(nèi)的多種方法[55]。對(duì)于有機(jī)質(zhì)含量較高的土壤，建議優(yōu)先選擇試劑盒法；若采用常規(guī)方法則需用核酸純化柱去除雜質(zhì)。所提取RNA的質(zhì)量多用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，理論上會(huì)出現(xiàn)3條較亮的電泳條帶，自上到下分別對(duì)應(yīng)LSU rRNA(核糖體大亞基 rRNA)、SSU rRNA和5.8/5S rRNA，mRNA等則呈彌散狀分布于LSU rRNA 條帶下方。但實(shí)際上5/5.8S rRNA條帶一般不可見(jiàn)，故電泳圖譜出現(xiàn)兩條清晰條帶即可證明RNA提取是成功的(圖1a)。由于在細(xì)胞內(nèi)LSU rRNA和SSU rRNA的拷貝數(shù)之比為1，所以條帶的亮度主要由片段的長(zhǎng)度決定。因?yàn)?8S rRNA長(zhǎng)度為18S rRNA的2.4倍左右，所以真核生物中判別RNA提取質(zhì)量的另一方法是根據(jù)兩個(gè)條帶的亮度，第一條亮帶的亮度達(dá)到第二條亮帶的兩倍即為成功。但23S rRNA與16S rRNA長(zhǎng)度比一般在1.8左右，所以原核生物RNA兩個(gè)條帶的亮度差異不是特別明顯。此外，若在SSU rRNA 條帶上方仍有條帶出現(xiàn)則證明所提取的RNA中混有殘留的基因組DNA(圖1b)，需用DNA酶消化去除。

(3) 活性表征的方式

推薦使用單位質(zhì)量(一般為每克)干土中SSU rRNA的拷貝數(shù)表征土壤微生物總活性，用SSU rRNA與SSU rRNA基因拷貝數(shù)的比值表征微生物的平均活性。有些研究用每納克核酸中SSU rRNA的拷貝數(shù)表征微生物總活性(表2)，這種表示方法實(shí)際上反映的是土壤核酸的組成比例，與微生物活性關(guān)系不大。采用該指標(biāo)并不合理，甚至可能會(huì)掩蓋試驗(yàn)的處理效應(yīng)，得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

當(dāng)然，用rRNA直接表征土壤微生物的活性也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)[5]。首先，微生物胞內(nèi)SSU rRNA含量與微生物活性之間的量化關(guān)系還未完全確立，僅有的少數(shù)研究也發(fā)現(xiàn)這一量化關(guān)系在不同微生物之間有較大的差異[5,56- 58]，因此在群落和生態(tài)系統(tǒng)尺度上是否有確定的關(guān)系還存在疑問(wèn)。其次，尚未有研究確定微生物胞內(nèi)SSU rRNA含量是否與微生物的非生長(zhǎng)活性相關(guān)，因此SSU rRNA能否表征微生物總活性還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。再次，因?yàn)橥寥繰NA和DNA一般是分別提取的，采用不同的方法體系，用SSU rRNA與DNA的比值表征微生物平均活性會(huì)因此產(chǎn)生不確定性[59]。

SSU RNA表征法在指示微生物總活性方面有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力，在表征活性微生物群落結(jié)構(gòu)方面已有較為廣泛的應(yīng)用[60- 61]。但一般認(rèn)為該方法在微生物處于生長(zhǎng)穩(wěn)態(tài)時(shí)的使用效果最好，如果要應(yīng)用于其他條件，則需要輔以其它驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，以確立SSU rRNA拷貝數(shù)與微生物總活性的關(guān)系。

4結(jié)論

綜上所述，土壤微生物呼吸測(cè)定法、放射性同位素標(biāo)記法和RNA直接表征法是基于不同的原理來(lái)指示土壤微生物總活性的，各有長(zhǎng)處，同時(shí)也都有明顯的缺陷(表3)。土壤微生物呼吸測(cè)定法非常適用于表征微生物總活性，但該方法的主要問(wèn)題在于現(xiàn)存測(cè)定方法并不能真實(shí)反映微生物總的呼吸強(qiáng)度，但在通氣性良好的土壤中，微生物呼吸方式大多為有氧呼吸，可以通過(guò)O2消耗速率近似反映微生物總活性；在微生物以有機(jī)碳作為最主要的能量來(lái)源時(shí)，CO2生成速率可以較好地反映微生物總呼吸。放射性同位素標(biāo)記法測(cè)定的指標(biāo)為生長(zhǎng)速率，因此它適合于表征微生物的總體生長(zhǎng)活性，也可在有利于微生物良好生長(zhǎng)的環(huán)境中近似表征微生物總活性。在我國(guó)，由于放射性標(biāo)記物質(zhì)的購(gòu)買、運(yùn)輸、環(huán)境釋放和測(cè)定等受到極大的限制，該方法的生態(tài)學(xué)應(yīng)用非常困難。RNA直接表征法相比于前兩種方法有明顯的優(yōu)勢(shì)，它既能原位測(cè)定微生物總活性，又能提供微生物種類組成信息。但是，目前在實(shí)驗(yàn)證據(jù)上對(duì)它能否準(zhǔn)確地反映土壤微生物總活性還存在疑問(wèn)。在方法的選擇上需要根據(jù)實(shí)際情況綜合考量，確定合適的方法開(kāi)展土壤微生物總活性研究；在條件允許的情況下，建議將幾種方法組合使用。

表3　3種土壤微生物活性研究方法的比較

致謝：感謝周小奇博士、Jackie Wilkinson對(duì)本文寫(xiě)作的幫助。

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A reviewon the methods for measuring total microbial activity in soils

CHE Rongxiao1,2, WANG Fang1, WANG Yanfen1, DENG Yongcui3, ZHANG Jing1, MA Shuang1, CUI Xiaoyong1,*

1UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China2GriffithUniversity,Brisbane4111,Australia3NanjingNormalUniversity,Nanjing210023,China

Abstract：Total microbial activity (TMA) in soils is vital for understanding the roles of microorganisms in ecosystem processes. It can be defined as the sum of physiological activities of all the microbes at a given moment. As TMA is difficult to measure directly, a series of proxies, such as respiration rates, growth rates, and cellular RNA concentration, have been proposed. Here, methods used to measure soil TMA are synthesized and compared. (1) Respiration may be the process most closely related to life activities. Thus, respiration rates are the most commonly used proxies of soil TMA. The main limitation is that current methods to determine respiration rates usually cannot accurately reflect actual respiration rates. When respiration rates are measured using CO2 production or O2 consumption rates, they indicate carbon mineralization or aerobic respiration rates, respectively. (2) Microbes with higher growth rates are usually more active. Thus, growth rates are also widely used to indicate soil TMA. As biomacromolecule synthesis is approximately proportional to microbial growth rates, incorporation of radioactive isotope labeled precursors (i.e., thymidine, leucine, and acetate) can be employed to estimate microbe growth rates. Generally, trace radioactively labeled precursors are added to slurries (traditional methods) or extracted microbial suspensions (B??th′s methods). After a brief incubation, microbes are killed and the corresponding biomacromolecules are extracted to measure their radioactivity. Thymidine and leucine incorporation are commonly used to measure heterotrophic bacterial growth rates, while acetate incorporation is used to estimate growth rates of saprotrophic fungi. Radioactive isotope labeling methods are robust tools to estimate the growth rates of soil microbes. However, one critical problem is that TMA includes both growth activity and non-growth activity, whereas these methods only reflect the former. (3) Evidently, none of the methods based on respiration rates or incorporation of radioactive isotope labeled precursors can accurately link microbial activity with their identities. However, this issue can be resolved through using methods based on RNA. RNA correlates closely with protein synthesis, which is involved in most metabolic processes. Therefore, RNA concentration is assumed an ideal indicator of microbial activity. Generally, mRNA can be used to indicate the activity of specific metabolic processes, including nitrogen fixation and denitrification, whereas rRNA is a proxy of soil TMA. As cellular concentrations of small subunit rRNA (SSU rRNA) are proportional to total cellular rRNA concentrations, SSU rRNA copies can serve as an indicator of soil TMA and the ratio of SSU rRNA copies to SSU rRNA gene copies can be used to determine average microbial activity in soil. Additionally, active microbial community structure can be illustrated using profiling methods, such as clone library, T-RFLP, and high-throughput sequencing, based on SSU rRNA. These approaches can simultaneously identify soil microbes and their activity via in situ measurements. However, there is still no adequate evidence to support the assertion that the methods based on SSU rRNA can accurately reflect microbial activity, especially for non-growth activity. In conclusion, none of these methods are perfect to determine soil TMA; and a combination of suitable methods should be selected for individual ecosystems.

Key Words:soil microbes; total microbial activity; soil microbial respiration; microbial growth activity; soil RNA

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41230750); 中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略先導(dǎo)專項(xiàng)B課題(XDB05010200)

收稿日期:2014- 10- 26; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015- 08- 24

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: cuixy@ucas.ac.cn

DOI:10.5846/stxb201410262093

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