劉思言,毛　穎,姜現(xiàn)瑞,馬鶴銘,王心雪,孫連坤,康勁松*

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué) 病理生理學(xué)系,吉林 長(zhǎng)春130021)

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線粒體應(yīng)激蛋白在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)及意義

劉思言1,毛穎2,姜現(xiàn)瑞2,馬鶴銘1,王心雪2,孫連坤2,康勁松2*

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué) 病理生理學(xué)系,吉林 長(zhǎng)春130021)

腦缺血半暗帶區(qū)是指由于腦缺血所致的腦細(xì)胞點(diǎn)活動(dòng)停止，功能喪失但形態(tài)結(jié)構(gòu)仍然保持完整的組織，位于嚴(yán)重缺血中心區(qū)中衛(wèi)的低灌注區(qū)，具有可逆性及可變性，可轉(zhuǎn)化為正常灌注區(qū)或梗死區(qū)[1]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，缺血灶的中心區(qū)域以神經(jīng)元的壞死為主而缺血半暗帶區(qū)以凋亡為主[2,3]。但最新的研究表明，在線粒體應(yīng)激中，線粒體中非折疊蛋白的增加遠(yuǎn)早于細(xì)胞凋亡[4]，線粒體非折疊蛋白的增加是其產(chǎn)生毒性作用前的一個(gè)廣泛存在的應(yīng)激反應(yīng)，并可剝奪細(xì)胞能量、控制細(xì)胞死亡[5]。目前尚未見(jiàn)線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白與不同腦缺血程度關(guān)系的報(bào)道。

因此，本研究的目的通過(guò)線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)腦缺血灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)缺血半暗帶線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討線粒體應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中的作用，為腦缺血再灌注損傷中的半暗帶形成及調(diào)控提供理論依據(jù)和新的作用靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大白鼠，雄性，體重250-300 g，購(gòu)自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK(吉)2013-0003。取大鼠40只，隨機(jī)分成4組，每組10只。分別為假手術(shù)對(duì)照組，缺血1 h再灌24 h組(1 h)，缺血1.5 h再灌24 h組(1.5 h)，缺血3 h再灌24 h組(3 h)。

1.2主要試劑與儀器

ClpP、cleaved-caspase3、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司，二抗購(gòu)自美國(guó) Pierce 公司。ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司?；瘜W(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó) Synene 公司；-80℃低溫冰箱由日本SANYO公司生產(chǎn)。

1.3大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型的制備

利用本室常規(guī)方法制備大鼠MCAO模型[6]，根據(jù)不同缺血時(shí)間在相對(duì)應(yīng)時(shí)間后將大鼠顱內(nèi)的線栓拔出，恢復(fù)血流進(jìn)行再灌注，時(shí)間為24 h。假手術(shù)組，線栓不插入顱內(nèi)，其余操作同上。以動(dòng)物清醒后爬行時(shí)右轉(zhuǎn)圈,提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲為入選標(biāo)準(zhǔn)。24 h后斷頭處死各組動(dòng)物，迅速分離半暗帶大腦皮質(zhì)[7]，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4HE染色

24 h后用10%水合氯醛將其麻醉，將胸廓剪開(kāi)，暴露心臟，把灌注針頭經(jīng)左心室刺入至主動(dòng)脈，用止血鉗加以固定，然后剪開(kāi)右心房，先用生理鹽水對(duì)其進(jìn)行快速灌注沖洗直至肝臟變白，然后用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)對(duì)其進(jìn)行灌注固定，最后將大鼠斷頭，取出完整大腦，并放置于4%多聚甲醛中固定24 h。用常規(guī)方法經(jīng)過(guò)脫水、透明、包埋和切片制作石蠟切片，接著進(jìn)行HE染色，封片，光鏡下進(jìn)行觀察。

1.5Western Blot檢測(cè)腦組織應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

按1 ml/100 mg的量加入組織裂解液，提取大腦皮層總蛋白。采用Bio-Rad法測(cè)定蛋白濃度，取30 μg上樣，配制12%聚丙烯酰胺凝膠，采用恒壓100V跑電泳，并用恒壓100V將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，之后用10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用兔源的ClpP、cleaved-caspase3及內(nèi)參蛋白β-actin多克隆抗體作為一抗，4℃封閉過(guò)夜。隔天用含吐溫的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)洗膜3次，每次10 min；之后加山羊抗兔二抗，在搖床室溫封閉孵育2 h，TBST再一次洗膜3次，每次10 min，最后用ECL發(fā)光液沖洗，在化學(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)中進(jìn)行顯色，并做灰度值分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1局造性腦缺血對(duì)大鼠腦皮質(zhì)損傷的影響

大鼠大腦HE染色結(jié)果表明，腦缺血1 h再灌注24 h，缺血側(cè)大腦皮質(zhì)出現(xiàn)典型的紅色樣變神經(jīng)元，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮，胞體縮小變形，胞漿呈深伊紅色；缺血1.5 h再灌注24 h，缺血側(cè)大腦皮質(zhì)濃染細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞周圍間隙增寬，腦組織結(jié)構(gòu)稀疏；缺血3 h再灌24 h，腦缺血側(cè)大腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生核溶解，核消失，腦組織結(jié)構(gòu)更加稀疏，正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)消失。說(shuō)明隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)腦損傷加重且腦梗死面積變大。

圖1　大鼠腦皮質(zhì)組織病理學(xué)改變

2.2局造性腦缺血對(duì)線粒體應(yīng)激蛋白及凋亡相關(guān)關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Westernblot結(jié)果表明，凋亡蛋白cleaved-caspase3隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸升高，而線粒體應(yīng)激蛋白ClpP在缺血1.5 h時(shí)表達(dá)量升至最高，缺血3 h有所下降。見(jiàn)圖2。

3討論

腦缺血半暗帶理論的提出，改變了缺血腦組織無(wú)法挽救的舊觀點(diǎn)。半暗帶決定著梗塞灶的大小，決定患者的康復(fù)質(zhì)量，其特殊的臨床意義使它成為腦缺血和腦保護(hù)作用的研究熱點(diǎn)之一。因此，缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵在于及時(shí)挽救缺血半暗帶尚未死亡的神經(jīng)元。

*P<0.05 與假手術(shù)組相比 L：代表腦缺血損傷側(cè)；R：代表未損傷側(cè)

圖2大腦皮質(zhì)凋亡蛋白與線粒體應(yīng)激蛋白的表達(dá)

線粒體應(yīng)激主要反應(yīng)在線粒體內(nèi)非折疊蛋白增加。線粒體未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)(mitochondrial unfolded protein response,UPRmt)是指由線粒體-細(xì)胞核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所誘導(dǎo)的線粒體保護(hù)性基因包括線粒體分子伴侶和蛋白酶重建線粒體蛋白折疊環(huán)境中蛋白的穩(wěn)態(tài)。目前認(rèn)為線粒體應(yīng)激過(guò)程包括三個(gè)層面，伴侶蛋白的改變及對(duì)氧化應(yīng)激、線粒體損害的防御作用；線粒體蛋白酶的降解和損傷；線粒體功能障礙。因此，從線粒體應(yīng)激角度出發(fā)探討其與半暗帶的關(guān)系，及時(shí)調(diào)控線粒體應(yīng)激有望成為減輕腦損傷反應(yīng)的重要途徑。

再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的命運(yùn)主要取決于缺血時(shí)間的長(zhǎng)短，目前大多數(shù)人認(rèn)為腦缺血后再灌注治療時(shí)間窗在2-4小時(shí)之間[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)我們采用了1小時(shí)、1.5小時(shí)和3小時(shí)3個(gè)不同缺血時(shí)間點(diǎn)復(fù)制腦缺血再灌注模型。

本實(shí)驗(yàn)HE結(jié)果證明，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元逐漸失去其正常形態(tài)，腦損傷逐漸加重。進(jìn)一步的Western Blot結(jié)果顯示，活化的凋亡蛋白cleaved-caspase3隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸升高，在缺血3 h時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，說(shuō)明凋亡參與了半暗帶的形成。但是線粒體應(yīng)激相關(guān)蛋白ClpP則出現(xiàn)先增高后降低，在缺血1.5 h時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，早于3 h時(shí)表達(dá)最強(qiáng)的cleaved-caspase3。UPRmt是維持線粒體自身穩(wěn)態(tài)的重要因素，它通過(guò)ClpP產(chǎn)生蛋白片段作為危險(xiǎn)信號(hào)，激活PKR(Protein kinase RNA-activated)，進(jìn)而磷酸化elF2α，阻止蛋白翻譯，并促進(jìn)核編碼的線粒體分子伴侶HSP60等的產(chǎn)生[9]。ClpP表達(dá)升高說(shuō)明在大鼠腦缺血再灌發(fā)生腦損傷時(shí)，線粒體應(yīng)激反應(yīng)也早于細(xì)胞凋亡，對(duì)腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)凋亡可起到防御作用。

綜上所述，腦缺血再灌注損傷過(guò)程中線粒體應(yīng)激反應(yīng)早于細(xì)胞凋亡，因此及時(shí)調(diào)控線粒體應(yīng)激有望成為減輕腦損傷反應(yīng)的重要途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ebinger M,De Silva DA,Christensen S,et al.Imaging the penumbra-strategies to detect tissue at risk after ischemic stroke[J].Clin Neurosci,2009,16(2):178.

[2]Liu M,Eguchi N,Yamasaki Y,et al.Protective role of hematopoietic prostaglandin D synthase in transient focal cerebral ischemia in mice[J].Neuroscience,2009,163(1):296.

[3]Price CD,Yang Z,Karlnoski R,et al.Effect of continuous infusion of asialoerythropoietin on short-term changes in infarct volume,penumbra apoptosis and behaviour following middle cerebral artery occlusion in rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2010,37(2):185.

[4]Pellegrino MW,Nargund AM,Haynes CM.Signaling the mitochondrial unfolded protein response[J].Biochim Biophys Acta,2013,1833(2):410.

[5]Jovaisaite V,Mouchiroud L,Auwerx J.The mitochondrial unfolded protein response,a conserved stress response pathway with implications in health and disease[J].J Exp Biol，2014,217(Pt 1):137.

[6]Wang W,Kang J,Li H,et al.Regulation of endoplasmic reticulum stress in rat cortex by p62/ZIP through the Keap1-Nrf2-ARE signalling pathway after transient focal cerebral ischaemia[J].Brain Inj，2013,27(7-8):924.

[7]Lu Y,Kang J,Bai Y,et al.Hyperbaric oxygen enlarges the area of brain damage in MCAO rats by blocking autophagy via ERK1/2 activation[J].European Journal of Pharmacology,2014,728C:93.

[8]Jin X,Liu J,Yang Y,et al.Spatiotemporal evolution of blood brain barrier damage and tissue infarction within the first 3h after ischemia onset [J].Neurobiology of Disease,2012，48(3):309

[9]Rath E,Berger E,Messlik A,et al.Induction of dsRNA-activated protein kinase links mitochondrial unfolded protein response to the pathogenesis of intestinal inflammation[J].Gut，2012,61(9):1269.

基金項(xiàng)目:吉林大學(xué)白求恩前沿交叉學(xué)科創(chuàng)新項(xiàng)目(No.2013101003)；吉林大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”項(xiàng)目(No.2014A79352); 吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No.20132068);吉林省科技廳項(xiàng)目(No.20150414026GH)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0890-03

(收稿日期：2015-12-18)