潘紅娟，王雅麗，呂　爽，劉鐵梅

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長(zhǎng)春130033)

?

富血小板血漿制備方法穩(wěn)定性的研究

潘紅娟，王雅麗，呂爽，劉鐵梅*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長(zhǎng)春130033)

富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)含有超過生理濃度數(shù)倍的血小板，作為一種自體血來源的產(chǎn)品，因獲取過程創(chuàng)傷較小、制備簡(jiǎn)便及具有生物學(xué)治療潛能等方面的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于組織再生、創(chuàng)面修復(fù)、感染治療和功能重建等領(lǐng)域[1，2]。但目前實(shí)驗(yàn)及臨床大都使用自體血液提取生長(zhǎng)因子，這無(wú)疑會(huì)對(duì)患者機(jī)體形成二次創(chuàng)傷[3]，為了用盡可能少的血液制備出血小板含量較高且能滿足臨床需要量的PRP，本文將對(duì)PRP的制備方法提供新的參考。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

取15例健康成年男性自愿者的外周血各40 ml，年齡 18-50歲，平均34歲。其納入標(biāo)準(zhǔn)為 ：①血紅蛋白>120 g/L，血小板>100×109/L。②采血前5 d 內(nèi)未服用影響血小板功能和凝血系統(tǒng)的藥物。③無(wú)傳染性疾病、相關(guān)血液疾病、嚴(yán)重心血管疾病及感染等。所有自愿者知情并同意采血用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器

一次性采血袋(天津金耀氨基酸有限公司)，50 ml無(wú)菌離心管(Thermo scientific公司)，20 ml一次性注射器(山東新華安得醫(yī)療用品有限公司)，9#腰椎穿刺針(蘇州偉康醫(yī)療器械有限公司)，一次性塑料管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；TDZ5-WS 臺(tái)式低俗離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)，蘇凈安泰超凈工作臺(tái)(北京華威興業(yè)科技有限公司)，BC-6800 全自動(dòng)血液分析儀(上海同舸醫(yī)療器械有限公司)。

1.3PRP 制備方法

1.3.1制備PRP

將200 ml一次性采血袋中的CPD-A抗凝劑除去22 ml，使其剩余6 ml；用裝有 5 ml抗凝劑的 一次性采血袋于每例志愿者肘前靜脈采血40 ml。搖勻后，取2 ml 抗凝血作全血細(xì)胞分析，3 ml用于細(xì)菌培養(yǎng)，40 ml 注入 50 ml無(wú)菌離心管中，剩余的1 ml血液棄掉，于常溫下制備 PRP。根據(jù)血液中各組分的沉降系數(shù)不同，以660 g/min 離心10 min 后，全血分為 3 層，上層為上清液，下層為紅細(xì)胞，兩層交界處一淺黃色層即 PRP 層。用20 ml 注射器吸取下層紅細(xì)胞，約剩余紅細(xì)胞層(1±0.3) ml。將剩余血液以相同條件離心后，可見在底部紅細(xì)胞表面有白膜樣物質(zhì)，即為血小板和白細(xì)胞沉積層 ；其上部為透明的血漿層。再次以20 ml 注射器吸取上層大部分乏血小板血漿，保留離心管中約 (6±0.2) ml 血漿。靜置15 min后輕搖離心管約 5 min，使血小板充分重懸于剩余血漿中，即得到 PRP。上述除采血外，其他操作均在無(wú)菌室及超凈工作臺(tái)進(jìn)行。

1.3.2血細(xì)胞分析

分別將2 ml 抗凝靜脈血和制備的 PRP 采用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析，測(cè)定血小板及白細(xì)胞濃度。

1.3.3細(xì)菌培養(yǎng)

對(duì)3 ml抗凝血及制備的PRP進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，一周后記錄結(jié)果，整個(gè)過程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)全血和 PRP 中血小板及白細(xì)胞濃度比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，并對(duì)全血和 PRP 中血小板及白細(xì)胞濃度、PRP 中血小板和白細(xì)胞的回收率及富集系數(shù)采用 Pearson 檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1血細(xì)胞分析

經(jīng)對(duì)全血及PRP中的血小板、白細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果如圖1、圖2所示：由圖可以看出PRP中血小板及白細(xì)胞與全血中血小板及白細(xì)胞呈正相關(guān)趨勢(shì)，分析相關(guān)系數(shù)血小板計(jì)數(shù)r=0.938(P<0.01)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)r=0.884(P<0.01)均呈顯著的正相關(guān)。

圖1　全血及PRP中的血小板計(jì)數(shù)

圖2　全血及PRP中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)

經(jīng)計(jì)算得，全血和PRP中血小板濃度分別為(183.97±33.48)×109/L及(1009.91±219.43)×109/L，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.981，P<0.01)。全 血和 PRP 中 白 細(xì) 胞 濃 度 分 別 為(6.22±1.48)×109/L和(19.31±7.40)×109/L，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.272，P<0.01)。PRP 中血小板和白細(xì)胞濃度的變異系數(shù)分別為 21.73% 和38.32%(表1)。

表1　全血和PRP中血小板及白細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

計(jì)算 PRP 中血小板、白細(xì)胞的回收率和富集系數(shù)，富集系數(shù)=PRP 中血小板或白細(xì)胞濃度/全血中血小板或白細(xì)胞濃度，回收率 =PRP 中血小板或白細(xì)胞總數(shù)/全血中血小板或白細(xì)胞總數(shù)×100%。計(jì)算得PRP中血小板的富集系數(shù)為5.46±0.45，回收率為84.37±4.32；白細(xì)胞的富集系數(shù)為3.02±0.71，回收率為46.90±11.37。并且PRP 中白細(xì)胞的回收率和富集系數(shù)間顯著相關(guān)(r=0.947，P<0.01)，而PRP中血小板的回收率和富集系數(shù)間相關(guān)性較差(r=0.502，P>0.05)，見表2。

表2　PRP中血小板和白細(xì)胞富集系數(shù)及回收率的比較

2.2全血和PRP的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌培養(yǎng)1周，所用培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

3討論

自上世紀(jì)90年代富血小板血漿技術(shù)問世以來，富血小板血漿逐漸成為組織工程領(lǐng)域尤其是骨創(chuàng)傷缺損修復(fù)方面的研究熱點(diǎn)[4]，并在臨床中的應(yīng)用越來越廣泛，同時(shí)也出現(xiàn)了多種富血小板血漿的制備方法。經(jīng)典的制備方法有(1)Anitua[5]法 ：160 g離心6 min一次離心法，(2)Landersberg[6]法： 兩次均為200 g離心10 min的二次離心法；(3)Aghaloo[7]法：分兩次離心，第一次215 g離心10 min，第2次863 g離心10 min等；李明等[8]指出當(dāng)離心血量較大時(shí)，這些方法制備的PRP的血小板濃度并不理想，較大的血量需要較大的離心管直徑及較高的離心力。對(duì)于PRP中血小板的有效濃度，Giusti等[9]發(fā)現(xiàn)人肌腱細(xì)胞培養(yǎng)中血小板濃度在(500-1000)×109/L之間刺激細(xì)胞的增殖、遷移及膠原合成的作用最為顯著，當(dāng)血小板濃度為2 000×109/L和3 000×109/L時(shí)，PRP的促細(xì)胞增殖作用明顯減弱。同樣Graziani等[10]體外研究發(fā)現(xiàn)，PRP制劑對(duì)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的促增殖作用具有劑量依賴性；當(dāng)血小板計(jì)數(shù)為(800-1000)×109/L之間時(shí)能夠達(dá)到更好的促增殖作用。本實(shí)驗(yàn)采血量為40 ml，加入6 ml抗凝劑，其抗凝劑與全血的比例為1∶6.7，其血液被稀釋而使全血及PRP中血小板、白細(xì)胞計(jì)數(shù)均偏低。本實(shí)驗(yàn)中血小板的富集系數(shù)與回收率的相關(guān)系數(shù)r=0.502，并不顯著性相關(guān)(P>0.05)，可能是由于制備的PRP較多(1∶6.7)導(dǎo)致PRP的富集系數(shù)相對(duì)較低而回收率較高造成的。但PRP中血小板濃度(1009.91±219.43)×109/L、富集系數(shù)(5.46±0.45)及PRP的量尚可滿足臨床需要。此實(shí)驗(yàn)采用二次離心法，兩次均為660 g離心10 min，避免了離心力過大離心時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致血小板活化及生長(zhǎng)因子的過早釋放。

白細(xì)胞中含有中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，在機(jī)體的宿主防御中發(fā)揮著重要作用。中性粒細(xì)胞被病原體，毒素等激活后，生成具有高度殺菌活性的次氯酸和其它的活性氧衍生物，及其胞內(nèi)的多種水解酶對(duì)病原體或異物具有消化作用；并且單核細(xì)胞的吞噬作用及淋巴細(xì)胞的免疫功能均對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用[11]。目前對(duì)于PRP中白細(xì)胞的含量及有無(wú)并沒有明確的要求。Wasterlain等[12]表示理想的骨科PRP制備應(yīng)該有高比率的血小板和白細(xì)胞，從而合成代謝大于分解代謝，以利于骨折的愈合。但也有報(bào)道稱富白細(xì)胞PRP用于治療跟腱炎可能會(huì)增加患者的局部疼痛[13]。本實(shí)驗(yàn)PRP中白細(xì)胞的濃度為(19.31±7.40)×109/L，富集系數(shù)為3.02±0.71，其在各種臨床疾病中的作用還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)與研究。

本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)分析(1)第1次離心后采用去除紅細(xì)胞，第2次離心后去除上層的P-PRP的方法，減少了多次抽吸血小板及轉(zhuǎn)移試管對(duì)血小板的刺激，從理論上降低了血小板的活化；(2)由于不同疾病、不同性別患者的紅細(xì)胞壓積的不同，第1次離心后去除紅細(xì)胞的體積并不相同，本實(shí)驗(yàn)用20 ml的離心管吸取紅細(xì)胞，最終使管底剩余約(1±0.3)ml的紅細(xì)胞，保證了每次制備的PRP中血小板的數(shù)量及PRP的有效體積，并減少沉降在紅細(xì)胞層的血小板的丟失，但同時(shí)使PRP中紅細(xì)胞的量增加。(3)本實(shí)驗(yàn)為了盡可能的減少對(duì)患者的二次傷害，全血中加入抗凝劑的體積相對(duì)較大且制備的PRP的量也較大，這使得全血及PRP中血小板及白細(xì)胞的濃度均偏低。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dhillon MS,Behera P,Patel S,et al.Orthobiologics and platelet rich plasma[J].Indian J Orthop,2014,48(1):1.

[2]付維力,李棋,李箭.富血小板血漿制備技術(shù)及其組分的研究進(jìn)展[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2014,28(12):1560.

[3]呂敏.同種異體富血小板血漿標(biāo)準(zhǔn)化制備的研究[D].西安:第四軍醫(yī)大學(xué),2013:1-67.

[4]康健,袁文.富血小板凝膠制備方法的比較與優(yōu)選[J].中國(guó)組織工程研究,2014,18(3):476.

[5]Anitua E.Plasma rich in growth factors:preliminary results of use in the preparation of future sites for implants[J].Int J Oral Maxillofac Implants,1999,14:529.

[6]Landesberg R,Roy M,Glickman RS,et al.Quantification of Growth Factor Levels Using a Simplifed Method of Platelet-Rich Plasma Gel Preparation[J].J Oral Maxillofac Surg,2000,58:297.

[7]Aghaloo TL,Moy PK,Freymiller EG.Investigation of platelet-rich plasma in rabibitcranial defects:A pilot study[J].J Oral Maxillofac Surg,2002,60(10):1176．

[8]李明,張長(zhǎng)青,袁霆,等.富血小板血漿制備套裝的評(píng)估研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2011,25(1):112.

[9]Giusti I,D’ Ascenzo S,Mancò A,et al.Platelet concentration in platelet-rich plasma affects tenocyte behavior in vitro[J].BioMed research international,2014.

[10]Graziani F,Ivanovski S,Cei S,et al.The in vitro effect of different PRP concentrations on osteoblasts and fibroblasts[J].Clinical oral implants research,2006,17(2):212.

[11]葉露露,單桂秋,馬靜,等.富血小板血漿抑菌作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)輸血雜志,2014,27(2):216.

[12]Wasterlain AS,Braun HJ,Dragoo JL.Contents and formulations of platelet-rich plasma[J].Operative Techniques in Orthopaedics,2012,22(1):33.

[13]Young A,McNaught CE.The physiology of wound healing[J].Surgery(Oxford),2011,29(10):475.

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目(20152004)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-1008-03

作者簡(jiǎn)介：劉鐵梅(1965-).女，博士，教授、主任醫(yī)師，輸血科主任，主要從事臨床輸血工作。

(收稿日期：2015-06-28)