刁遠(yuǎn)明　　詹　瑧　　周　韜　　張偉偉　　張李唯　　董　偉　　張軍峰

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州　510006；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京　210023

表皮生長因子對化療損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的保護作用

刁遠(yuǎn)明1，2詹瑧2▲周韜2張偉偉2張李唯2董偉2張軍峰2

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210023

目的探討表皮生長因子（EGF）對5-氟尿嘧啶（5-FU）化療損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（OP9）的保護作用。 方法首先建立5-FU化療損傷OP9細(xì)胞模型并摸索EGF作用劑量。然后，將實驗分為空白對照組、模型組、實驗組。用25 μg/mL 5-FU作用OP9細(xì)胞作為模型組，用20 ng/mL的EGF處理25 μg/mL 5-FU損傷的OP9細(xì)胞作為實驗組，并設(shè)常規(guī)培養(yǎng)的OP9細(xì)胞作為空白對照組。分別用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞凋亡，一氧化氮（NO）測試盒、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒分別檢測NO、iNOS、TNOS及Caspase-3的含量。結(jié)果與空白對照組比較，模型組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，EGF可以顯著保護5-FU損傷的OP9細(xì)胞，使其存活率升高（P＜0.01）。與空白對照組比較，模型組細(xì)胞早期凋亡率明顯提高（P＜0.05），Caspase-3含量明顯增加（P＜0.05），NO生成明顯增多（P＜0.05），iNOS表達(dá)明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組化療損傷OP9細(xì)胞的早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），Caspase-3含量明顯下降（P＜0.05），iNOS的表達(dá)明顯受到抑制（P＜0.01），NO的生成明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論EGF可能通過降低Caspase-3含量抑制細(xì)胞凋亡，減少NO的過度生成，發(fā)揮其細(xì)胞保護作用。

表皮生長因子；5-氟尿嘧啶；OP9細(xì)胞；化療損傷

［Abstract］Objective To investigate the protective effect of epiderma1 growth factor（EGF）on 5-F1uorouraci1（5-FU）chemotherapy-injured mouse bone marrow stroma1 ce11s（OP9）.Methods First，the OP9 injury mode1 was estab1ished by using 5-FU and the effect of EGF on OP9 injury mode1 was exp1ored.Then，the experiment was divided into b1ank contro1 group，mode1 group and experimenta1 group.The OP9 ce11s treated with 25 μg/mL 5-FU were used as the mode1 group.The mode1 ce11s treated with 20 ng/mL EGF were used as the experimenta1 group，and the norma1 OP9 ce11s were used as b1ank contro1 group.CCK-8 assay was used to detect ce11 viabi1ity.Ce11 apoptosis was detected by FCM. NO，iNOS，TNOS，Caspase-3 were detected by nitric oxide（NO）test kit，nitric oxide synthase（NOS）assay kit，Caspase-3 active assay kit.Results Compared with the b1ank contro1 group，the ce11 surviva1 rate of mode1 group was significant1y decreased（P＜0.01），and compared with the mode1 group，EGF cou1d significant1y protect OP9 ce11s from 5-FU damage，and increased the surviva1 rate of ce11s（P＜0.01）.Compared with the b1ank contro1 group，the ear1y apoptosis rate of mode1 group was significant1y enhanced（P＜0.05），the content of Caspase-3 was significant1y increased（P＜0.05），the NO production was significant1y increased（P＜0.05），and the expression of iNOS was significant1y rose（P＜0.05）.Compared with the mode1 group，the ear1y apoptosis rate of injury OP9 ce11s of the experimenta1 group was significant1y decreased（P＜0.05），the content of Caspase-3 was significant1y reduced（P＜0.05），the iNOS expression was significant1y inhibited（P＜0.01），and NO generation was 1essened（P＜0.05）.Conclusion EGF might inhibit apoptosis through decreasing the content of Caspase-3 and reducing the excessive production of NO to p1ay its ro1e in ce11 protection.

［Key words］Epiderma1 growth factor；5-F1uorouraci1；OP9 ce11s；Chemotherapy injury

化療是治療惡性腫瘤的一種重要手段，其臨床作用日益突出，但是腫瘤化療的毒副作用以及對患者生活質(zhì)量所造成的影響也成為影響其療效的重要原因之一?；熕幬镌诳焖贇缒[瘤細(xì)胞的同時，對人體中處于活躍分裂狀態(tài)的細(xì)胞也具有極大的殺傷力，這是其化療毒副作用的根源。開發(fā)研究新的高效低毒藥物、降低化療毒副作用是當(dāng)前的研究熱點［1］。表皮生長因子（EGF）通過結(jié)合表皮生長因子受體（EGFR）刺激細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生等過程中起到重要作用［2-4］。另外，有研究表明，EGF可促進小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖，是小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外大量培養(yǎng)和快速增殖的有效刺激因子［5］。因此，筆者猜測EGF很可能對化療藥物損傷的機體的正常細(xì)胞有一定的保護作用。然而，EGF對腫瘤化療藥物損傷的小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞是否具有保護作用及其可能的作用機制目前尚未有相關(guān)研究報道，因此，本研究以EGF為主要研究對象，對其化療輔助作用進行初步探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（OP9），由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

1.1.2試劑 胎牛血清（貨號1428479，GIBCO公司）；MEMα培養(yǎng)基（貨號12000022，GIBCO公司）；胰蛋白酶（GIBCO公司）；6孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（平底）（CORNING公司）；5-氟尿嘧啶 （5-FU，AMRESCO公司，批號0597）；EGF（PEPROTECH公司，純度＞98%，批號0906390-1）；CCK8試劑盒 （日本同仁化學(xué)研究所，貨號GC762）；Caspase-3活性檢測試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)）；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒（eBioscience公司）；一氧化氮（NO）測試盒、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀（Power Wave X340，美國BIOTEK公司）；超凈工作臺（蘇凈公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；顯微鏡（日本OLYMPUS）；熒光顯微鏡（BX41，日本OLYMPUS）；超純水凈化系統(tǒng)（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LS-B50L，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；FACS Ca1ibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；電子天平（德國sartorius）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞按1×105個/mL接種在培養(yǎng)瓶中，加入MEMα培養(yǎng)體系，二氧化碳培養(yǎng)箱溫育（37℃、5%CO2），24 h后換液。細(xì)胞為梭型貼壁生長，待細(xì)胞生長至70%～80%時，用0.25%的胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.25-FU化療損傷模型的建立 細(xì)胞以1×105個/孔密度接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h后，加入5-FU使其終濃度為12.5、25、50、100、200 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，培養(yǎng)時間終止后，加入CCK8試劑10 μL，37℃反應(yīng)2 h，450 nm波長檢測各孔吸光度值（A）。按公式計算細(xì)胞存活率：存活率=［（A實驗孔-A本底）/A空白對照組-A本底）］×100%。根據(jù)結(jié)果選定5-FU適宜的作用時間和損傷濃度。

大多數(shù)教師把教學(xué)的百分之九十的精力放在了教學(xué)設(shè)計上，聽課中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)教師游戲設(shè)計的精彩多樣，可是到了評價的階段卻是相當(dāng)?shù)牧邌荩皇遣萋实匾粠Ф^。殊不知，教學(xué)評價才是游戲深化、幼兒發(fā)展最直接的因素。

1.2.3CCK8法檢測EGF對5-FU化療損傷OP9細(xì)胞模型存活率的影響 細(xì)胞以1×105個/孔密度接種于96孔板上，24 h后，EGF組分別加入1.25、2.5、5、10、20 ng/mL的EGF及25 μg/mL 5-FU，模型組加入終濃度為25 μg/mL 5-FU，空白對照組始終用完全培養(yǎng)液，每組6孔。分別于藥物作用24 h后加入CCK8試劑10 μL，同實驗“1.2.2”項下操作并計算細(xì)胞存活率。實驗重復(fù)3次。

1.2.4實驗分組及給藥實驗分設(shè)空白對照組、模型組、實驗組。模型組加入終濃度為25 μg/mL 5-FU，實驗組加入20 ng/mL EGF溶液及終濃度為25 μg/mL 5-FU，空白對照組加入等量培養(yǎng)液。

1.2.5Anexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于6孔板，按“1.2.4”的實驗分組及給藥，24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞制備成的細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，離心半徑為6 cm，棄上清，用PBS洗2次，再加入1 mL PBS重懸成單細(xì)胞懸液，按Anexin V-FITC/PI雙染試劑盒操作，F(xiàn)CM分析細(xì)胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.2.6Caspase-3試劑盒檢測Caspase-3酶活性按“1.2.4”的實驗分組及給藥，24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞制備成的細(xì)胞懸液，冰浴裂解細(xì)胞后，4℃高速離心，取上清液一部分按Caspase-3活性檢測試劑盒相關(guān)步驟處理，測定各組樣品中Caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度，通過pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算出樣品中催化產(chǎn)生的pNA的量。另取一部分上清液樣品用Bradford法測定蛋白，通過蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算出每個樣品中所含的蛋白的量。每個樣品pNA的量比上樣品中所含的蛋白的量即為單位重量蛋白中所含的Caspase-3的酶活力單位。實驗重復(fù)3次。

1.2.7NO、NOS試劑盒檢測NO和NOS含量 按“1.2.4”的實驗分組及給藥，24 h后，取細(xì)胞上清液，按NO測試盒相關(guān)步驟處理，測定各組NO變化情況。同時取細(xì)胞上清液，按NOS測定試劑盒相關(guān)步驟處理，測定各組NOS的活性變化情況。實驗重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩樣本單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.15-FU對OP9細(xì)胞存活率的影響

不同濃度5-FU處理OP9細(xì)胞后，細(xì)胞受到不同程度的損傷，與空白對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1　5-FU對OP9細(xì)胞存活率的影響（±s，n=6）

表1　5-FU對OP9細(xì)胞存活率的影響（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；5-FU：5-氟尿嘧啶

組別　5-FU終濃度（μg/mL）　24 h A450　　存活率（%）48 h A450　　存活率（%）空白對照組5-FU組0 12.5 25 50 100 200 0.5518±0.0087 0.4382±0.0118*0.4224±0.0107*0.4126±0.0127*0.3980±0.0071*0.3886±0.0112*100.00 78.98 76.55 74.67 72.13 70.43 0.5758±0.0141 0.4418±0.0052*0.4170±0.0090*0.4074±0.0087*0.4026±0.0132*0.3954±0.0150*100.00 76.72 72.42 70.75 69.92 68.67

考慮到5-FU對細(xì)胞損傷過多可能導(dǎo)致?lián)p傷難以修復(fù)，參考文獻［6-8］，結(jié)合鏡下所見細(xì)胞狀態(tài)及后續(xù)預(yù)實驗結(jié)果，本研究選用25 μg/mL 5-FU作用24 h作為造模條件。

2.2EGF對5-FU化療損傷OP9細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的EGF可以不同程度地保護5-FU化療損傷的OP9細(xì)胞，使其存活率升高，其中10、20 ng/mL 的EGF與模型組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2　EGF對5-FU化療損傷OP9細(xì)胞存活率的影響（±s，n=6）

表2　EGF對5-FU化療損傷OP9細(xì)胞存活率的影響（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別　EGF濃度（μg/mL）　A450　　存活率（%）空白對照組模型組EGF組--1.25×10-32.5×10-35×10-31×10-22×10-20.8782±0.0266 0.6538±0.0256*0.6772±0.0113 0.6877±0.0197 0.6973±0.0364 0.7230±0.0315#0.7450±0.0285#100.00 74.44 77.11 78.30 79.40 82.32 84.83

2.3EGF對化療損傷OP9細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)“2.2”實驗結(jié)果，本研究進一步觀察了20 ng/mL EGF對化療損傷OP9細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞早期凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），EGF干預(yù)后，實驗組細(xì)胞早期凋亡率較模型組明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1　表皮生長因子對化療損傷OP9細(xì)胞凋亡的影響

2.4EGF對化療損傷OP9細(xì)胞的Caspase-3活性的影響

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞Caspase-3含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），EGF干預(yù)后，實驗組Caspase-3含量明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3　EGF對化療損傷OP9細(xì)胞Caspase-3活性的影響（±s，n=3）

表3　EGF對化療損傷OP9細(xì)胞Caspase-3活性的影響（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)；EGF：表皮生長因子

組別　EGF濃度（ng/mL）　Caspase-3（酶活力單位）空白對照組模型組實驗組--2 0 1009.00±56.57 1053.00±68.59*773.00±98.99#

2.5EGF對化療損傷OP9細(xì)胞NO、NOS的影響

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），EGF干預(yù)后，實驗組NO含量明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），iNOS呈現(xiàn)相同的變化趨勢，而TNOS各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4　EGF對化療損傷OP9細(xì)胞NO、NOS的影響（±s，n=3）

表4　EGF對化療損傷OP9細(xì)胞NO、NOS的影響（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)；EGF：表皮生長因子；NO：一氧化氮；NOS：一氧化氮合酶；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；TNOS：總一氧化氮合酶

組別　EGF濃度（ng/mL）NO （A550）NOS（A530）iNOS　TNOS空白對照組模型組實驗組--2 0 0.0723±0.0005 0.0866±0.0055*0.0736±0.0035#0.1743±0.0102 0.2227±0.0261*0.1547±0.0037##0.2345±0.0332 0.2235±0.0289 0.2595±0.0728

3　討論

骨髓基質(zhì)細(xì)胞是成體骨髓中的一類多能干細(xì)胞，具有多向分化的潛能，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等［9-10］。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的這種特性，使其處于一種活躍分裂狀態(tài)，也常常成為化療藥物攻擊的對象而被“誤傷”。因此，本實驗設(shè)計選用5-FU作為損傷骨髓基質(zhì)細(xì)胞的化療藥物，模擬臨床化療損傷過程，首次摸索建立了5-FU損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的化療損傷模型。研究結(jié)果顯示，不同濃度5-FU處理OP9細(xì)胞后，細(xì)胞受到不同程度的損傷。

本研究首次觀察了EGF對化療損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞是否具有保護作用。研究結(jié)果顯示，不同濃度的EGF可以不同程度地保護5-FU化療損傷的OP9細(xì)胞，使其存活率升高。細(xì)胞凋亡研究結(jié)果顯示，EGF可顯著降低化療損傷OP9細(xì)胞早期凋亡率，結(jié)果提示EGF的保護作用與細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)。

對于NO與細(xì)胞凋亡，有學(xué)者［11］認(rèn)為NO對不同細(xì)胞及同一種細(xì)胞的不同分化階段的凋亡作用有異質(zhì)性，在體內(nèi)，NO促進還是抑制細(xì)胞凋亡取決于其濃度、氧化還原的環(huán)境及細(xì)胞內(nèi)的保護機制。本研究結(jié)果顯示5-FU刺激后促使骨髓基質(zhì)細(xì)胞NO合成顯著增多，且iNOS表達(dá)亦顯著升高，NO的含量高低與iNOS表達(dá)水平相一致，與TNOS無明顯相關(guān)性。因此，筆者認(rèn)為5-FU刺激后骨髓基質(zhì)細(xì)胞大量分泌NO促進細(xì)胞自身的凋亡，EGF作用后，主要通過抑制iNOS的表達(dá)來減少NO的過度生成，從而減少凋亡，發(fā)揮其細(xì)胞保護作用。

Caspase-3激活是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志分子事件，已成為細(xì)胞凋亡通路研究的經(jīng)典指標(biāo)［12-15］。本研究顯示，EGF可以降低Caspase-3含量，提示其對化療損傷的保護作用可能與降低Caspase-3含量相關(guān)。EGF保護化療損傷OP9細(xì)胞的具體作用機制尚待進一步深入研究。

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Protective effect of epidermal growth factor on the chemotherapy-injured mouse bone marrow stromal cells

DIAO Yuanming1，2ZHAN Zhen2▲ZHOU Tao2ZHANG Weiwei2ZHANG Liwei2DONG Wei2ZHANG Junfeng2
1.Schoo1 of Basic Medica1 Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；2.Schoo1 of Basic Medica1 Science，Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Province，Nanjing 210023，China

R392.12

A

1673-7210（2016）04（c）-0008-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（81473593、814734 58）；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目（YQ2015 042）。

刁遠(yuǎn)明，女，博士，副教授；研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)、中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究。

2016-01-07本文編輯：張瑜杰）