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(1．成都大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 四川 成都　610106； 2．成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 四川 成都　611131)

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16批不同來源僵蠶白僵菌素含量測(cè)定及微量元素分析

牛蓓1， 郭曉恒1， 嚴(yán)鑄云2， 宋登敏1， 劉濤1

(1．成都大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 四川 成都610106； 2．成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 四川 成都611131)

摘要：目的：對(duì)16批不同來源僵蠶進(jìn)行白僵菌素含量測(cè)定及微量元素分析.方法：采用HPLC法測(cè)定白僵菌素的含量，色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈—水—四氫呋喃(5.5∶3.5∶1)梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速1 mL·min-1，柱溫為常溫.用原子光譜吸收法對(duì)藥材中的Mg、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn、Cr、Ni、Pb、Cd 10種元素進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果：白僵菌素含量在線性范圍線性關(guān)系良好(r=0.9999)，加樣回收率為99.19%，不同來源僵蠶的蠶白僵菌素含量差異較大.微量元素測(cè)定發(fā)現(xiàn)，僵蠶中鎂、鉛的含量較高.結(jié)論：16批不同來源僵蠶白僵菌素質(zhì)量差別較大，無明顯地域特征.但條肥壯，斷面充實(shí)，明亮，質(zhì)硬的僵蠶及其炮制品，白僵菌素的含量普遍較高，質(zhì)量較好，與傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別一致.

關(guān)鍵詞：僵蠶；白僵菌素;高效液相色譜法；原子光譜吸收法

0引言

僵蠶，又稱白僵蠶、天蟲、姜蠶，主治祛風(fēng)定驚，化痰散結(jié)，臨床多用于治療驚風(fēng)抽搐，咽喉腫痛、皮膚瘙癢、頜下淋巴結(jié)炎、面神經(jīng)麻痹等癥.研究表明，其具有抗凝、抗血栓、促進(jìn)微循環(huán)、抗癌、降糖、增加免疫、鎮(zhèn)靜催眠等功效[1-2].僵蠶是以白僵菌對(duì)蠶娥科昆蟲家蠶的幼蟲感染或人工接種致死后的干燥體，主產(chǎn)區(qū)為四川、山東、浙江、江蘇、廣東，其中四川產(chǎn)藥材為主流品種[3-7]，其藥效成分不明確，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善[1].白僵菌素是由僵蠶中提取得到的一種環(huán)狀三羧酸鈦，與僵蠶的抗驚厥、鎮(zhèn)靜的藥理作用有關(guān)[8-9]，但未見其含量調(diào)查的相關(guān)報(bào)道.為此，本研究對(duì)不同來源的僵蠶，按傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別進(jìn)行分類后，分別測(cè)定了其中白僵菌素的含量和微量元素含量，補(bǔ)充完善了僵蠶的物質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)研究.

1材料與方法

1.1藥材和試劑

實(shí)驗(yàn)所用16個(gè)批次不同來源藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定為僵蠶，白僵菌素為本實(shí)驗(yàn)室分離所得.

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括:乙腈為色譜純，三氯甲烷、甲醇、硝酸、高氯酸等試劑均為分析純，水為超純水(Ω>18 M)；Cu、Mg、Zn等標(biāo)準(zhǔn)溶液(%SBG2069-90，1000 μg·mL-1)由國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院提供，稀釋至所需濃度后使用.

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：530G型分光光度計(jì)(安捷倫科技上海儀器有限公司)；SHIMADZU型高效液相色譜儀，LC-10A型泵，SPD-10A型檢測(cè)器，N2000型色譜工作站，KQ50型超聲波清洗器，十八烷基硅烷鍵合硅膠柱Diamonsil C18(5 μ，250×4.6 mm)，迪馬公司(柱號(hào)：8037434)，AA-7700型原子吸收光譜儀(北京東西電子技術(shù)研究所)，Mg、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn、Cr、Ni、Pb、Cd等10種元素空心陰極燈，烘箱，電子分析天平，電動(dòng)碾磨機(jī)等.

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液制備.

精密稱取經(jīng)硅膠干燥器干燥數(shù)月的白僵菌素樣品適量，加甲醇制成20.8 μg/mL的對(duì)照品溶液.

1.3.2供試品溶液制備.

精密稱取16個(gè)批次的僵蠶粗粉各2.0 g，加入90%甲醇20 mL，稱定，加熱回流90 min，取出， 放置至室溫再稱定，用90%甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL，蒸干，再以甲醇定容至10 mL，離心，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液.

1.3.3色譜條件色譜柱.

實(shí)驗(yàn)色譜條件為：色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈—水—四氫呋喃(5.5∶3.5∶1)梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速 1 mL/min，柱溫為常溫，進(jìn)樣量10 μL.

1.3.4方法學(xué)評(píng)價(jià).

1)線性關(guān)系考察.分別精密吸取白僵菌素對(duì)照溶液20.8 μg/mL手動(dòng)進(jìn)樣4、8、12、16、20 μL，測(cè)定白僵菌素峰面積積分值.以白僵菌素的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，其峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2)精密度試驗(yàn).取“1.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20.8 μg/mL，按“1.3.3”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，通過計(jì)算RSD以考察儀器的精密度.

3)穩(wěn)定性試驗(yàn).精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定白僵菌素峰面積，通過計(jì)算RSD以考察本樣品的穩(wěn)定性.

4)重復(fù)性試驗(yàn).取同一批樣品5份，精密稱定，依“1.3.2”項(xiàng)下方法平行制備5份供試液，分別精密吸取供試品溶液5 μL注入液相色譜儀，按“1.3.3”項(xiàng)下方法下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜峰面積，通過計(jì)算RSD考察本方法的重復(fù)性.

5)加樣回收率試驗(yàn).精密稱取已知含量的僵蠶藥材5份，分別精密添加“1.3.1”項(xiàng)下各白僵菌素對(duì)照品貯備溶液適量0.416 mg，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算各成分的加樣回收率和RSD，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì).

1.3.5白僵菌素含量測(cè)定.

按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備16批供試品溶液，平行3份，按“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定白僵菌素的含量.

1.3.6微量元素測(cè)定.

本研究選擇采用硝酸+高氯酸的混合酸體系(4∶1)作為消化液.對(duì)4種類型的僵蠶(具體見表2)進(jìn)行處理.消化過程中通過控制溫度使溶液保持微沸狀態(tài)，既可以使樣品消化完全，又能避免溫度過高使溶液碳化.樣品用AA-7700型原子吸收光譜儀進(jìn)行分析[10]，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Heml進(jìn)行聚類分析相似性分析.

2結(jié)果與討論

2.1含量測(cè)定條件選擇

2.1.1供試品溶液制備方法選擇

實(shí)驗(yàn)中，分別考察了甲醇、90%甲醇、無水乙醇3種試劑對(duì)白僵菌素提取效果的影響，結(jié)果以90%甲醇提取效果較好；分別考察了超聲提取、加熱回流提取60 min、索氏提取3種提取方法對(duì)白僵菌素提取效果的影響，以加熱回流提取60 min效果較好；分別考察了加熱回流30 min、45 min、60 min、90 min、120 min，結(jié)果在90 min時(shí)提取完全，白僵菌素含量最高.

2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定與流動(dòng)相選擇.

1)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇.取白僵菌素對(duì)照品溶液，在波長(zhǎng)200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行DAD全波長(zhǎng)掃描，在波長(zhǎng)215 nm處有最大吸收，因此選擇215 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).

2)流動(dòng)相的選擇.比較了乙腈—水、甲醇—水、甲醇—水—磷酸、乙腈—甲醇—四氫呋喃、乙腈—水—四氫呋喃及其不同比例，結(jié)果顯示，乙腈—水—四氫呋喃分離度較好，選為流動(dòng)相.

3)流動(dòng)相流速的考察：分別考察了1 mL/min、0.8 mL/min、0.6 mL/min 3種流速，結(jié)果顯示，1 mL/min時(shí)分離度較好，出峰時(shí)間合適.

2.2色譜柱分離情況

按照“1.3.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，各成分分離度良好，以外標(biāo)法計(jì)算含量，理論板數(shù)按刺五加苷E峰計(jì)算，不得低于3 000.在上述色譜條件下，對(duì)照品與樣品色譜情況見圖1.

圖1　色譜柱分離情況

2.3HPLC分析方法評(píng)價(jià)

2.3.1方法的回歸方程和線性關(guān)系.

分別按“1.3.4”項(xiàng)下“1)”方法進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)回歸處理，計(jì)算得回歸方程，y=1915103.44x+4262.0566,r=0.9999.說明白僵菌素進(jìn)樣量在0.083～0.416 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈較好的線性關(guān)系.

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn).

按“1.3.4”項(xiàng)下“2)”方法進(jìn)行測(cè)定，RSD為0.8994%，表明儀器精密度良好.

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn).

按“1.3.4”項(xiàng)下“3)”方法進(jìn)行測(cè)定，RSD為2.17%，供試品溶液在0～24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好.

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn).

按“1.3.4”項(xiàng)下“4)”方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定白僵菌素含量白僵菌素含量RSD<3%，說明本方法的重復(fù)性良好.

2.3.5加樣回收率試驗(yàn).

按“1.3.4”項(xiàng)下“5)”方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果白僵菌素的平均回收率為99.19%，RSD為1.40%(具體見表1)，說明本方法較準(zhǔn)確.

2.4不同來源地僵蠶中白僵菌素含量測(cè)定

精密稱取不同來源的樣品2 g，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按“1.3.5”項(xiàng)下方法測(cè)定.結(jié)果見表1.對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得白僵菌素含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，其RSD為2.80%.

以白僵菌素為指標(biāo)成分對(duì)不同來源的僵蠶進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示不同來源的僵蠶未炮制品和炮制品白僵菌素含量不一.將不同來源的僵蠶按藥材特征[6-7]分為4組(見表1).實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，不同來源地的僵蠶的白僵菌素含量有較大的差異.平均含量高低依次為：第4組0.4320 mg/g、第3組為0.3978 mg/g、第1組為0.2775 mg/g、第2組為0.1772 mg/g.可見，此次采集的僵蠶所得白僵素含量與炮制與否無明顯相關(guān)性，傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別質(zhì)量較好的僵蠶(條肥壯，斷面充實(shí)，明亮，質(zhì)硬的僵蠶及其炮制品)，白僵菌素的含量相對(duì)較高.

2.5僵蠶中微量元素測(cè)定

石墨爐—原子吸收光譜法常用于測(cè)定重金屬含量，其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性較好[10]，在丹參、白術(shù)等藥材中都有應(yīng)用[10-11].本研究將此法用于測(cè)定僵蠶的微量元素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明僵蠶富含多種微量元素，且含量較高(見表2).《中國(guó)藥典》2015版規(guī)定重金屬含量標(biāo)準(zhǔn)為Pb元素<5.0 ppm，Cd元素<0.2 ppm.數(shù)據(jù)表明， 如何控制僵蠶中的重金屬含量有待深入研究.通過聚類分析相似性分析，結(jié)果顯示微量元素中除了Mg元素外，其余元素含量在4組中無明顯差異，但炮制品比未炮制品僵蠶中的Mg元素的含量有所下降(見圖2).

表116不同來源僵蠶樣品白僵菌素含量測(cè)定(n=3)

表2　所測(cè)僵蠶中微量元素含量(mg/g)

注：分組情況與表1相同.

圖2　所測(cè)僵蠶中微量元素聚類相似性分析

3結(jié)論

本研究以白僵菌素為研究對(duì)象，對(duì)不同來源的16個(gè)批次的僵蠶進(jìn)行了含量測(cè)定.結(jié)果表明：僵蠶中白僵菌素的含量差別較大(0.0316～0.6259 mg/g)；條肥壯，斷面充實(shí)，明亮，質(zhì)硬的僵蠶中，白僵菌素的含量普遍較高，與傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)鑒別一致，而與炮制與否無明顯相關(guān)性，此表明可將白僵菌素作為僵蠶質(zhì)量評(píng)價(jià)的一個(gè)待選指標(biāo).目前，重金屬含量超標(biāo)為中藥應(yīng)用的制約因素，16個(gè)批次的僵蠶樣品中Pb元素的含量較高，如何控制僵蠶中的重金屬含量有待深入研究.本研究利用傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別、白僵菌素測(cè)定與重金屬含量檢測(cè)，分別對(duì)不同來源的16個(gè)批次的僵蠶樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，為僵蠶的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇提供參考.

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Content Determination and Trace Elements Analysis of Bombyx Batryticatu Beauvericin from 16 Different Sources

NIUBei1,GUOXiaoheng1，YANZhuyun2，SONGDengmin1，LIUTao1

(1.school of Medicine ,Chengdu University， Chengdu 610106， China;2.School of Chinese Pharmacy,Chengdu University of TCM, Chengdu 611131， China)

Abstract:The paper is going to determine the content and analyze the trace elements of bombyx batryticatu beauvericin from 16 different sources.The HPLC methods are used for the content determination of beauvericin from bombyx batryticatu.Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm) is adopted for gradient elute with the mobile phase consisting of acetonitrile-water-tetrahydrofuran (5.5∶3.5∶1). The detection wavelength is set at 215 nm.The flow rate is 1.0 mL/min.The column temperature is room temperature.The determination of trace elements (Mg,Ca,Fe,Zn,Cu,Mn,Cr,Ni,Pb,Cd) is done by Atomic Absorption Spectrometry.The results show that the content of beauvericin from bombyx batryticatu in linear range generates good linear relation (r=0.9999) and good recovery rate(99.19%).The content of beauvericin from different bombyx batryticatu varies a lot.The trace elements determination shows that the content of Pb and Mg is higher in bombyx batryticatu.The conclusion drawn in the paper is that the quality of beauvericin from 16 different sources differs a lot,and no obvious regional features are shown.But bombyx batryticatu and its processed products with whole material fullness,bright and hard sections have generally higher content of beauvericin of better quality,which is consistent with the traditional identification by experience.

Key words:Bombyx batryticatu;beauvericin;HPLC;atomic absorption spectrometry

文章編號(hào)：1004-5422(2016)02-0120-04

收稿日期：2016-04-28.

基金項(xiàng)目：四川省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)課題(2003A07)資助項(xiàng)目.

作者簡(jiǎn)介：牛蓓(1974 — )， 女， 博士， 講師， 從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究.

中圖分類號(hào)：R917；R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A