靳芹

摘要：細(xì)胞培養(yǎng)是病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究必不可少的重要工具和手段。本文以豬乙型腦炎病毒在豬腎上皮細(xì)胞（PK-15細(xì)胞）增殖培養(yǎng)為例，介紹一下病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法，和一些注意事項(xiàng)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng)；PK-15細(xì)胞

隨著畜牧業(yè)的高速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，動物疫病也成為困擾廣大養(yǎng)殖戶的首要問題。檢測出明確的疫病類型，是做好養(yǎng)殖業(yè)防控治療的關(guān)鍵。對發(fā)病毒株的更深一步的研究，可有助于研制適于當(dāng)前流行疫病的疫苗和藥物制劑。這樣，病毒前期的分離培養(yǎng)就尤為重要，因?yàn)椴《救狈ν暾拿赶到y(tǒng)，又無核糖體等細(xì)胞器，所以不能在任何無生命的培養(yǎng)液內(nèi)生長。試驗(yàn)動物、雞胚以及體外培養(yǎng)的組織細(xì)胞就成為人工增殖的基本工具。細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)動物和雞胚相比，不僅經(jīng)濟(jì)、方便、省時(shí)、省力，而且能提供大量生物性穩(wěn)定的細(xì)胞群體，降低了外界因素的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

1病毒組織細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)所需儀器設(shè)備

干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、普通冰箱、-80℃低溫冰柜、高壓消毒器、恒溫水浴箱、普通離心機(jī)、真空泵、蔡氏濾器、顯微鏡、無菌室、超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、移液管（1mL、5mL、10mL）等。

1.2病毒培養(yǎng)過程所需溶液的配制

1.2.1營養(yǎng)液的配制營養(yǎng)液是組織細(xì)胞中賴以生長和增殖的直接環(huán)境，不僅要求含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，而且必須保證適宜酸堿度、溫度、滲透壓和氣相等。以配制10mL營養(yǎng)液為例：需滅菌蒸餾水7.8mL、EME0.9mL、雙抗（青霉素和鏈霉素）0.2mL、犢牛血清1mL、Na 0.1mL，調(diào)PH值7.2-7.4。

1.1.2維持液配制（以10mL為例）需滅菌蒸餾水8.3mL、MEM0.9mL、雙抗（青霉素和鏈霉素）0.2mL、犢牛血清0.5mL、Na0.1mL調(diào)pH值7.2-7.4。

1.1.3消化液配制（以10 mL為例）滅菌蒸餾水9mL、胰酶1mL。

1.2 PK-15細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮罐中取出凍存的PK-15細(xì)胞（約1.8mL）迅速放入40℃水浴鍋中（大約2min）使其溶解，然后放入離心機(jī)中1000rpm，離心5min，棄凍存液，用1mL吸管，吸培養(yǎng)液使細(xì)胞重新懸浮，吹打細(xì)胞，全部移入培養(yǎng)瓶，放37℃C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察結(jié)果：細(xì)胞都貼壁生長，均勻平鋪在瓶壁上，形狀整齊、輪廓清晰，在無菌操作臺，把細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液倒掉，換維持液，培養(yǎng)24h，把原培養(yǎng)瓶中的維持液倒掉，把消化液分三次加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每次從細(xì)胞貼壁的一面開始消化（輕搖），四面都洗完，把消化液倒掉，把培養(yǎng)液加入培養(yǎng)瓶，分裝成兩瓶。繼續(xù)按上述步驟進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.3豬乙型腦炎病毒接種傳代好的PK-15細(xì)胞

取處理好的病毒組織，12000rpm離心10min，取上清接種于倒掉培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃感作1h（每隔15min慢慢搖動一次，使病毒與細(xì)胞充分作用）；同時(shí)做空白對照。1h后，把接毒瓶與對照瓶同時(shí)加維持液（維持液調(diào)pH7.6），放37℃溫箱，解毒12h后，接毒細(xì)胞無明顯變化，相對于對照細(xì)胞，維持液稍黃，16h后，維持液開始變渾濁，接毒20h后細(xì)胞有了明顯變化，細(xì)胞界限模糊不清晰，細(xì)胞的生長受到抑制，有些細(xì)胞有融合現(xiàn)象，已有兩個或三個細(xì)胞融合為一個細(xì)胞（這時(shí)，要在接毒細(xì)胞和對照細(xì)胞中均加入2mL NaHC03，調(diào)環(huán)境PH7.5-7.7，要使維持液保持一定的PH環(huán)境），接毒24h后，接毒細(xì)胞形狀變細(xì)長，36h后90%細(xì)胞已經(jīng)圓縮，開始收毒，收的乙腦細(xì)胞毒放-80℃低溫冰柜凍36h，然后拿出凍融一次（-80℃病毒放4℃冰箱2min，然后融化再放入-80℃冰柜），3h后，取出病毒按上步驟融化分裝，為第一代病毒。取第一代病毒接種細(xì)胞，按以上操作步驟進(jìn)行傳代。傳代到十代以上，可以保存病毒作為下一步試驗(yàn)用毒。

2病毒組織細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1）培養(yǎng)液配制時(shí)，采用的動物血清是細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，有很強(qiáng)的酸堿緩沖作用和促進(jìn)細(xì)胞貼壁的作用。一般采用犢牛血清，但不是所有病毒都通用一種血清，比如犢牛血清就抑制細(xì)小病毒的生長，要改為5月齡以內(nèi)的胎牛血清。所以，根據(jù)所增殖病毒的不同，加入其適宜的血清。營養(yǎng)液的PH值，細(xì)胞最適生長的PH范圍是7.0-7.4，細(xì)胞通?？赡褪躊H6.6-7.8較大范圍的變化，偏酸或偏堿的環(huán)境持續(xù)時(shí)間不宜超過24h，否則細(xì)胞很快老化。較堿的生長液更適于細(xì)胞貼壁，但培養(yǎng)時(shí)的PH應(yīng)保持在7.2-7.4之間。

2）培養(yǎng)細(xì)胞所用培養(yǎng)瓶，移液管等玻璃器皿潔凈與否，對于細(xì)胞培養(yǎng)十分重要。必須經(jīng)清水沖洗，再于1%優(yōu)質(zhì)洗衣粉的水溶液內(nèi)蒸煮30min，隨后刷洗，并用清水和蒸餾水分別沖洗5～6次以上，烘干。然后經(jīng)包扎于160-170℃干燥滅菌2h，取出備用。

3）細(xì)胞培養(yǎng)和接毒后培養(yǎng)的內(nèi)外環(huán)境一定要保持無菌，工作前后要紫外燈半小時(shí)殺菌，尤其是環(huán)境中不要感染支原體，否則，細(xì)胞培養(yǎng)將無法繼續(xù)。

4）一般細(xì)胞培養(yǎng)到5代以后，可以進(jìn)行接毒。病毒傳代到13代以后基本穩(wěn)定，可以作為下一步試驗(yàn)用毒。一般在接毒培養(yǎng)瓶內(nèi)約有2/3的細(xì)胞發(fā)生折光性增強(qiáng)、凝縮不整及細(xì)胞核變形、破碎、脫落時(shí)，應(yīng)立即收獲。在實(shí)際工作中，往往因病料中病毒含量少或病毒起初不適應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)增殖，初代分離病變不明顯，但通過盲傳而逐步增強(qiáng)，從而達(dá)到分離病毒的目的。

5）不同的病毒，會有自己所敏感的增殖細(xì)胞。因此，實(shí)際工作中，我們要根據(jù)自己所研究的病毒，選擇適宜的培養(yǎng)細(xì)胞。病毒傳到多少代可以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，不同的病毒也會不同，要根據(jù)具體試驗(yàn)結(jié)果而定。