王成財(cái)，梁文波

(1. 大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 大連 116000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

靈芝多糖對(duì)荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠T細(xì)胞亞群及AQP1、AQP3表達(dá)的影響

王成財(cái)1,2，梁文波1Δ

(1. 大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 大連 116000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

目的 研究靈芝多糖對(duì)荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠T細(xì)胞亞群及AQP1、AQP3表達(dá)的影響。方法 選擇BALB/c裸鼠30只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，皮下注射膀胱癌T24細(xì)胞建立荷膀胱癌動(dòng)物模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、順鉑組、靈芝多糖+順鉑組各10只，順鉑組給予順鉑25 mg/kg腹腔注射，順鉑+靈芝多糖組小鼠給予靈芝多糖200 mg/kg灌胃，順鉑25 mg/kg腹腔注射，對(duì)照組給予相當(dāng)體積的生理鹽水灌胃。測(cè)定腫瘤組織的體積和質(zhì)量、外周血中T細(xì)胞亞群的含量以及腫瘤組織中AQP1、AQP3、Caspase-3、Bax的mRNA含量。結(jié)果 順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織的體積、腫瘤組織質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織體積、腫瘤組織質(zhì)量明顯低于順鉑組(P<0.05)；順鉑組、順鉑+靈芝多糖組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，順鉑+靈芝多糖組CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+均明顯高于順鉑組(P<0.05)；順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，順鉑+靈芝多糖組鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯低于順鉑組(P<0.05)；順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于順鉑組(P<0.05)。結(jié)論 靈芝多糖干預(yù)能夠抑制荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，調(diào)節(jié)凋亡基因、AQP1、AQP3的表達(dá)水平。

膀胱癌；靈芝多糖；T細(xì)胞亞群；水通道蛋白；凋亡

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中超過(guò)70%為淺表性膀胱癌，多數(shù)能夠通過(guò)手術(shù)切除，但是術(shù)后的復(fù)發(fā)率較高。有研究表明，淺表性膀胱癌(superficial bladder cancer，SBC)往往術(shù)后容易復(fù)發(fā)，術(shù)后需要進(jìn)行膀胱灌注化療[1]。因此，膀胱癌術(shù)后繼續(xù)進(jìn)行藥物輔助治療以預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)有助于改善患者的預(yù)后情況。膀胱癌的復(fù)發(fā)與免疫逃逸、細(xì)胞凋亡異常有關(guān)，選用具有免疫調(diào)節(jié)功能和促凋亡效應(yīng)的藥物能夠預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)[2]。靈芝多糖是具有抗腫瘤效應(yīng)的中藥材，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能、減少血管新生來(lái)抑制腫瘤的發(fā)展[3]。本研究分析了靈芝多糖對(duì)荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠T細(xì)胞亞群及AQP1、AQP3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c裸鼠30只，雌性，6～8周，體重15～25 g，購(gòu)買于康生物科技股份有限公司(合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0005)，購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)周，飼養(yǎng)條件：室溫18～27 ℃，相對(duì)濕度40～70%。本次研究報(bào)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 藥物與試劑：人膀胱癌細(xì)胞株T24購(gòu)買于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；細(xì)胞培養(yǎng)用液體、消化酶購(gòu)買于Hyclone公司；靈芝多糖購(gòu)買于杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司；CD3、CD4、CD8抗體購(gòu)買于上海鑫樂生物科技有限公司(美國(guó)Biolegend原裝)；Trizol提取液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)買于Invitrogen公司，熒光定量PCR試劑購(gòu)買于Promega公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)ITienno公司)；PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf公司)；凝膠成像系統(tǒng)(法國(guó)VILBERLOURMAT公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；流式細(xì)胞儀(CyFlow Cube,CyFlow Ploidy Analyser)(德國(guó)PARTEC公司)。

1.2 方法

1.2.1 荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠模型的建立[3]：復(fù)蘇膀胱癌細(xì)胞株T24，培養(yǎng)后進(jìn)行消化和傳代，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞并調(diào)節(jié)密度至1.0×107/L，將200 μL腫瘤細(xì)胞懸液接種在小鼠右側(cè)腋窩的皮下組織。待腫瘤組織生長(zhǎng)至縱徑4～5 mm后表示荷瘤模型建立成功。采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只小鼠分為空白對(duì)照組、順鉑組、順鉑+靈芝多糖組各10只。

1.2.2 藥物干預(yù)方法：順鉑組給予生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)干預(yù)18 d，給予順鉑25 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)干預(yù)5 d；順鉑+靈芝多糖組小鼠給予靈芝多糖200 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)干預(yù)18 d，順鉑25 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)干預(yù)5 d；對(duì)照組給予相當(dāng)體積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)干預(yù)18 d，生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續(xù)干預(yù)5 d。

1.2.3 腫瘤體積和質(zhì)量：于實(shí)驗(yàn)第19天在SPF實(shí)驗(yàn)室操作臺(tái)按動(dòng)物福利學(xué)將小鼠脫頸斷頭處死， 處死小鼠后解剖得到腫瘤組織，用電子天平對(duì)腫瘤組織進(jìn)行稱重，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤組織的體積。

1.2.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群含量：處死小鼠后取外周血組織，分別孵育CD3、CD4、CD8的熒光抗體，緩沖液洗滌后1 500 r/min離心5 min，PBS重懸并用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3+、CD4+、CD8+的比例，計(jì)算CD4+/CD8+的比例。

1.2.5 腫瘤組織中基因的表達(dá)量：取腫瘤組織置于勻漿器，用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用Promega公司的qPCR Master MI型進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,(AQP)AQP1上游引物序列：5’-GCTCACCCGCAACTTCTCA-3’，下游：5’-TCCTCTATTTGGGCTTCATCTC-3’(212bp)；AQP3上游引物序列 :5′-TGGTGGCTTCCTCACCATCAA-3′, 下游:5′-CGAGCCCAAAA-ACAATCCCAGC-3′(209 bp)；caspase-3 上游引物序列：5′-GACTAGCTTCTTCAGAGGCGA-3′;下游:5′-ATTCCGTTGCCAC-CTTCCTG-3′(322bp)；Bax上游引物序列 ：F 5’-GGCGAATT-GGAGATGAAC-3’，下游：5’-CCGAAGTAGGAGAGGAGG-3’(307 bp)，(94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火1s，72 ℃延伸1 min，共34循環(huán)；72 ℃延伸10 min，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共32循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min)，反應(yīng)體系為cDNA 1 μL、Master mix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O8.2 μL。得到擴(kuò)增曲線后，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目的基因水通道蛋白(AQP)AQP1、AQP3、Caspase-3、Bax的mRNA含量。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積和質(zhì)量 順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織的體積、腫瘤組織質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織體積、腫瘤組織質(zhì)量明顯低于順鉑組(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠的腫瘤體積和質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of tumor volume and mass between three groups(±s)

*P<0.05，與對(duì)照組比較comparedwithcontrolgroup；#P<0.05，與順鉑組比較comparedwithcisplatingroup

2.2 外周血T細(xì)胞亞群含量 順鉑組、順鉑+靈芝多糖組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+均明顯高于順鉑組(P<0.05)。見表2及圖1。

表2 3組小鼠外周血T細(xì)胞亞群的含量比較Tab 2 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between three groups(±s)

*P<0.05，與對(duì)照組比較comparedwithcontrolgroup;#P<0.05，與順鉑組比較comparedwithcisplatingroup

圖1 3組小鼠外周血T細(xì)胞亞群的含量比較(n=10)Fig.1 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between three groups(n=10)

2.3 腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯低于順鉑組(P<0.05)。見表3及圖2。

表3 3組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量比較Tab.3 Comparison of mRNA of Caspase-3 and bax in tumor tissues between three groups(±s)

*P<0.05，與對(duì)照組比較comparedwithcontrolgroup；#P<0.05，與順鉑組比較comparedwithcisplatingroup

圖2 3組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量比較，M：Marker；C：對(duì)照組；S：順鉑組；L：順鉑+靈芝多糖組。Fig.2 Comparison of mRNA in Caspase-3 and Bax of tumor tissues betweem three groupsM:Marker, C:Control group;S:Cisplatin group; L:Cisplatin combined ganoderma lucidum polysaccharide group

2.4 腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量 順鉑組、順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于順鉑組(P<0.05)。見表4及圖3。

表4 3組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量Tab.4 Comparison of mRNA in AQP1 and AQP3 of tumor tissues betweem three groups(±s)

*P<0.05，與對(duì)照組比較comparedwithcontrolgroup；#P<0.05，與順鉑組比較comparedwithcisplatingroup

圖3 3組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量比較，M：Marker；C：對(duì)照組；S：順鉑組；L：順鉑+靈芝多糖組。Fig.3 Comparison of mRNA in AQP1 and AQP3 of tumor tissues between 3 groups M:Marker, C: Control group; S: Cisplatin group; L: Cisplatin combined ganoderma lucidum polysaccharide group

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，目前主要的治療方法是手術(shù)切除，輔助以術(shù)后放療和化療。但是，放療和化療的不良反應(yīng)多、患者耐受性較差，且在長(zhǎng)期放療和化療過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)藥物和放射線耐受的情況，影響整體治療效果。如何通過(guò)有效的藥物輔助治療來(lái)預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)是臨床的重要課題。

靈芝多糖為靈芝屬真菌絲體次生代謝產(chǎn)物，由三股單糖鏈構(gòu)成的大分子化合物，是從靈芝孢子粉中提取的水溶性多糖成分。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，其抗腫瘤作用備受關(guān)注[4]。最早關(guān)于靈芝多糖的研究證實(shí)，該藥物對(duì)S180肉瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖能夠通過(guò)抑制血管新生、調(diào)節(jié)免疫功能的途徑來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與對(duì)照組、順鉑組比較，順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織的體積顯著縮小、腫瘤組織的質(zhì)量顯著減輕。提示靈芝多糖能夠抑制荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。已有研究報(bào)道，靈芝多糖具有明確的免疫調(diào)節(jié)作用[7-10]。CD4+細(xì)胞可協(xié)助B細(xì)胞分泌抗體和調(diào)節(jié)其他T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，CD8+細(xì)胞常表現(xiàn)細(xì)胞毒活性，是主要的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞[11]。本實(shí)驗(yàn)研究中，本文研究中，順鉑+靈芝多糖組CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+均明顯高于順鉑組，提示靈芝多糖能夠增強(qiáng)荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠的細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。

目前關(guān)于靈芝多糖與膀胱癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚缺乏研究。Bax和Caspase-3是已知的促凋亡基因，Bax能夠促進(jìn)線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞漿，進(jìn)而激活Caspase所介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)并引起細(xì)胞凋亡[12-13]。我們對(duì)膀胱癌組織中促凋亡基因表達(dá)量的分析證實(shí)，與順鉑組比較，順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中Bax、Caspase-3的mRNA含量明顯降低。說(shuō)明靈芝多糖干預(yù)能夠下調(diào)荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠腫瘤組織中凋亡基因的表達(dá)。水通道蛋白(AQP)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的增殖相關(guān)分子，包括AQP0-AQP12共13名成員，參與不同組織和器官水通透性的調(diào)節(jié)。已有研究報(bào)道，AQP1、AQP3高表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、復(fù)發(fā)密切相關(guān)[14]。AQP1主要參與腫瘤血管通透性的調(diào)節(jié)，能夠促進(jìn)腫瘤血管新生以及細(xì)胞增殖，同時(shí)也有利于腫瘤的遷移和侵襲[15]；AQP3的主要生物學(xué)效應(yīng)是促進(jìn)細(xì)胞的遷移，既有利于腫瘤細(xì)胞穿過(guò)微血管屏障并向遠(yuǎn)處遷移，也能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增加新生血管形成[16]。本實(shí)驗(yàn)研究中，順鉑+靈芝多糖組小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3的mRNA含量明顯低于對(duì)照組與順鉑組，Huang等[17]也有類似的文獻(xiàn)報(bào)道，提示靈芝多糖有助于下調(diào)小鼠腫瘤組織中AQP1、AQP3表達(dá)水平。

本文研究表明，靈芝多糖干預(yù)能夠抑制荷膀胱癌T24細(xì)胞小鼠的腫瘤生長(zhǎng)、增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，調(diào)節(jié)促凋亡基因、AQP1、AQP3的表達(dá)，可作為膀胱瘤化療輔助用藥，其可能作用機(jī)制還有待于更多的基礎(chǔ)研究與臨床研究去證實(shí)。

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(編校：師維康)

Effect ofganodermalucidumpolysaccharides on T cell subsets and AQP1, AQP3 expression of bladder cancer T24 cell line bearing mice

WANG Cheng-cai1,2, LIANG Wen-bo1Δ

(1. Department of Oncology, Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University, Dalian 116000, China; 2. Department of Urinary Surgery, the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo study the effect ofganodermalucidumpolysaccharides on T cell subsets and AQP1, AQP3 expression of bladder cancer T24 cell line bearing mice.Methods60 BALB/C nude mice were selection as experimental animals, bladder tumor bearing animal models were made by bladder cancer T24 cells subcutaneous injection, and were randomly divided into control group, cisplatin group,ganodermalucidumpolysaccharides and cisplatin group, cisplatin group given 25 mg/kgcisplatin intraperitoneal injection, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group given 200 mg/kgganodermalucidumpolysaccharide lavage, 25 mg/kg cisplatin intraperitoneal injection, the control group given quite a volume normal saline lavage. Then tumor volume and weight, peripheral blood T cell subsets and AQP1, AQP3, Caspase-3, Bax mRNA content in tumor tissue were determined.ResultsCisplatin group, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide tumor volume and mass were significantly lower than the control group (P<0.05), cisplatin andganodermalucidumpolysaccharide tumor volume and mass were significantly lower than that cisplatin group (P<0.05); Cisplatin group, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharides group CD4+T cells, CD8+ T cells , CD4+/ CD8+were significantly higher than that of control group (P<0.05), cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group CD4+T cells, CD4+/ CD8+were significantly higher than that of cisplatin group(P<0.05); Cisplatin group, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group mices tumor tissues Bax, Caspase 3 mRNA content were significantly lower than the control group (P<0.05), cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group Bax,caspase 3 mRNA content were significantly lower than that of cisplatin group (P<0.05); Cisplatin group, cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group mice tumor tissue AQP1, AQP3 mRNA content were significantly lower than the control group (P<0.05); Cisplatin combinedganodermalucidumpolysaccharide group AQP1, AQP3 mRNA content were significantly lower than cisplatin group (P<0.05).Conclusionganodermalucidumpolysaccharide can inhibit tumor growth and enhance cellular immune function of bladder cancer T24 cell line bearing mice, and adjust the expression of pro-apoptotic genes, AQP1 and AQP3.

Bladder cancer;ganodermalucidumpolysaccharide; T cell subsets; water channel protein; apoptosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.008

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(201202131)

王成財(cái)，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：泌尿系腫瘤,E-mail：wangchengc2004@163.com；梁文波，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤免疫治療，E-mail：dllwb@126.com。

R69

A