李霓，丁盛，何昌國(guó)

(1.浙江省臨海市中醫(yī)院 藥劑科，浙江 臨海 317000；2.杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司 技術(shù)品質(zhì)部，浙江 杭州 310026)

中藥杜仲炮制方法及與續(xù)斷不同配伍的化學(xué)研究

(1.浙江省臨海市中醫(yī)院 藥劑科，浙江 臨海 317000；2.杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司 技術(shù)品質(zhì)部，浙江 杭州 310026)

目的 分析并研究中藥杜仲炮制方法及與續(xù)斷不同配伍的化學(xué)變化，為杜仲?gòu)?fù)方配伍提供科學(xué)的參考依據(jù)。方法 分別采取清炒法、砂炒法和烘烤法來(lái)炮制杜仲樣品，對(duì)比分析3種炮制方法的結(jié)果，然后采用薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)法、UV光譜法和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)對(duì)烘烤法炮制前后杜仲化學(xué)成分的變化情況。結(jié)果 經(jīng)比較，烘焙法雖然需要的時(shí)間較長(zhǎng)(107 min)，但其斷絲率和成品率分別為(97.89±0.52)%和(89.75±0.93)%，明顯高于清炒法(32 min)的(86.15±0.33)%和(54.00±0.84)%(P<0.05)，以及砂炒法(6 min)的(92.31±0.64)%和(64.73±0.71)%(P<0.05)，且損失率為(9.64±0.98)%，顯著低于其他2種方法的(45.65±0.73)%和(31.43±0.79)%(P<0.05)。經(jīng)炮制，杜仲的木脂素類(lèi)和環(huán)烯醚類(lèi)等化學(xué)成分明顯減少(P<0.05)，但杜仲膠、微量元素、氨基酸和其他成分的變化并不顯著。杜仲和續(xù)斷的配伍比例會(huì)對(duì)生品配伍以及炮制品配伍中的綠原酸含量產(chǎn)生影響，2者關(guān)系密切。結(jié)論 中藥杜仲炮制配伍化學(xué)成分的變化和炮制與配伍的方法具有密切關(guān)聯(lián)。

杜仲；炮制；續(xù)斷；配伍；化學(xué)研究

單味中藥按照一定的中藥理論進(jìn)行配伍和加工，最終形成的藥劑就是中藥復(fù)方藥劑。在構(gòu)成復(fù)方藥劑的各種藥物中，判斷某一種藥物是否有效，或者是否存在有效的藥物，可以從中藥配伍的化學(xué)成分中展現(xiàn)出來(lái)，都需要進(jìn)行深入的研究和分析。隨著我國(guó)科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，先進(jìn)的分析儀器不斷涌現(xiàn)出來(lái)，極大地促進(jìn)了藥物有效成分的檢測(cè)、分離、含量檢測(cè)和分析的發(fā)展和進(jìn)步。從臨床實(shí)踐來(lái)看，湯劑是中藥復(fù)方藥劑的主要類(lèi)型，那么湯劑中所有化學(xué)成分的總和就是中藥復(fù)方藥劑藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。當(dāng)然，在煎煮的過(guò)程中，不同的藥材在經(jīng)過(guò)配伍之后，其中的化學(xué)成分一定會(huì)發(fā)生變化，但是只有各種化學(xué)成分以合理的濃度進(jìn)行搭配才能充分發(fā)揮藥效。本實(shí)驗(yàn)選取杜仲和續(xù)斷作為主要研究對(duì)象。其中續(xù)斷屬于川斷科植物——川續(xù)斷的干燥根，在臨床中的應(yīng)用比較常見(jiàn)，具有非常顯著的續(xù)筋接骨和補(bǔ)肝益腎的作用。生物堿、揮發(fā)油和三萜皂苷等是其最主要的化學(xué)成分[3]。續(xù)斷的主要藥理作用為：抵抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨損傷的快速愈合等。同時(shí)，續(xù)斷還會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成一定的影響。另外，在習(xí)慣性流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)以及腰椎骨質(zhì)增生類(lèi)疾病的臨床診療中，續(xù)斷也具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。為了研究中藥杜仲炮制配伍的化學(xué)變化，為杜仲?gòu)?fù)方配伍提供科學(xué)的參考依據(jù)，本文進(jìn)行了如下報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 杜仲、續(xù)斷均購(gòu)買(mǎi)于安徽毫州市朱氏藥業(yè)有限公司(杜仲批號(hào)：151201，續(xù)斷批號(hào)：160101)，并經(jīng)臨海市中醫(yī)院主任中藥師何昌國(guó)鑒定屬正品；薄層色譜分析儀購(gòu)買(mǎi)于雅特隆公司(型號(hào)：IATROSCAN MK6/MK6s)；UV光譜分析儀購(gòu)買(mǎi)于廈門(mén)中治自動(dòng)化工程有限公司(型號(hào)：CAT.NO.SA)和高效液相色譜分析儀購(gòu)買(mǎi)于上海儀電分析儀器有限公司(型號(hào)：LC-200)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置于大連美侖生物有限公司(批號(hào)：20151154)，甲醇(批號(hào)：160213)、醋酸(批號(hào)：151204)均購(gòu)買(mǎi)于中海南聯(lián)能源有限公司。

1.2 方法

1.2.1 炮制杜仲：炮制杜仲的方法有很多，在本次研究中分別采用清炒法、砂炒法和烘烤法來(lái)炮制杜仲樣品，對(duì)比分析3種炮制方法的結(jié)果，然后采用薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)法、UV光譜法和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)對(duì)烘烤法炮制前后杜仲化學(xué)成分的變化情況。

1.2.2 清炒法、砂炒法和烘烤法比較：清炒法炮制時(shí)間為32 min，砂炒法炮制時(shí)間為6 min，烘烤法炮制時(shí)間為107 min。斷絲率=斷絲個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù)；成品率=樣品處理后達(dá)標(biāo)個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù)；損失率=(總量-剩余有效量)/總量。以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 炮制前后化學(xué)成分變化：檢測(cè)炮制前后木脂素類(lèi)、環(huán)烯醚類(lèi)、杜仲膠、微量元素、氨基酸、其他成分含量，具體方法：分別采用光譜法測(cè)定木脂素類(lèi)含量，用比色法測(cè)定環(huán)烯醚類(lèi)含量，用高效液相色譜法測(cè)定杜仲膠、微量元素以及氨基酸等成分含量。以上檢測(cè)均重復(fù)3次。

1.2.4 高效液相色譜法測(cè)定杜仲中綠原酸方法的建立

① 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)儀器和相關(guān)試劑：高效液相色譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV檢測(cè)器、超聲波清洗器、烘箱、甲醇、醋酸為色譜純[4]。

② 制備溶液：精密稱(chēng)取一定量的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用濃度為70%甲醇溶液配制成濃度為0.0511 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取2 g杜仲生品及炮制品放置在錐形瓶中，對(duì)其進(jìn)行精密測(cè)定，加入40 mL濃度為50%的甲醇溶液[5]。進(jìn)行0.5 h的超聲處理，將超聲溫度參數(shù)設(shè)置為25 ℃，過(guò)濾，將其續(xù)濾液濃縮干燥，用濃度為70%的甲醇溶液在10 mL容量瓶中進(jìn)行定容，等待檢測(cè)。③選擇檢測(cè)波長(zhǎng)：對(duì)190～700 nm掃描的各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較，在327 nm時(shí)色譜峰噪聲較小、峰形較好，同時(shí)結(jié)合杜仲中的主要有效成分綠原酸的吸收波長(zhǎng)，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm[6]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3次。

1.2.5 不同配伍比例對(duì)綠原酸含量的影響：本研究采用醇溶法對(duì)綠原酸進(jìn)行提取：先用氯仿進(jìn)行連續(xù)提取至流出液呈無(wú)色，再改用95%工業(yè)乙醇提取提盡綠原酸。將所得乙醇提取液減壓濃縮成浸膏,與干凈細(xì)沙拌合后,用熱水提取數(shù)次,使綠原酸轉(zhuǎn)溶于水中,棄去殘?jiān)?；所得水溶液用乙醚萃?進(jìn)一步除去脂溶性雜質(zhì);向脫脂后的水溶液中加入飽和硫酸銅溶液,至沉淀完全,并稍有過(guò)量為止。此時(shí),水中的綠原酸與金屬離子結(jié)合生成不溶性鹽;用離心分離法分離出沉淀并除去沉淀中的金屬離子后將所得濾液用有機(jī)溶劑萃取數(shù)次,回收溶劑,得綠原酸粗品,經(jīng)分步結(jié)晶和重結(jié)晶等方法精制,即得綠原酸純品。

① 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：精密稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品80 mg，用95%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混勻。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL到250 mL容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混勻，此為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。330 nm處測(cè)定吸光度，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并求出相應(yīng)的回歸方程。

② 樣品中綠原酸含量測(cè)定:準(zhǔn)確稱(chēng)取中草藥提取物樣品各1.083 5 g，置于250 mL錐形瓶中，量取50 mL 95%的乙醇溶解樣品，并置于85 ℃的恒溫水浴箱中，回流4 h。冷卻至溫，過(guò)濾，然后加95%的乙醇將提取液定容于250 mL容量瓶，待用；準(zhǔn)確吸取樣品提取液5 mL于25 mL容量瓶中，加95%的乙醇稀釋到刻度，得到待測(cè)樣品液。以95%的乙醇作空白，在327 nm處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待測(cè)樣品液濃度。

③ 回收率測(cè)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取中草藥提取物樣品0.20 g，分別加入一定量的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，按上述操作方法進(jìn)行，用紫外分光光度法測(cè)定吸光度，得出綠原酸含量，計(jì)算回收率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 炮制結(jié)果比較 經(jīng)比較，烘焙法雖然需要的時(shí)間較長(zhǎng)，但其斷絲率和成品率，明顯高于清炒法以及砂炒法，且損失率顯著低于其他2種方法。組間各指標(biāo)均存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 3種炮制方法的基本結(jié)果比較Tab.1 Comparison of three kinds of processing methods(±s,n=3)

*P<0.05，與清炒法比較，compared with stir-fried；#P<0.05，與砂炒法比較，compared with sand fry

2.2 烘烤法炮制前后的化學(xué)成分變化 經(jīng)炮制，杜仲的木脂素類(lèi)和環(huán)烯醚類(lèi)等化學(xué)成分明顯減少(P<0.05)，但杜仲膠、微量元素、氨基酸和其他成分的變化并不顯著。具體數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 烘烤法炮制前后各種化學(xué)成分的變化情況Tab.2 The changes of every chemical compositions pre- and post-treatment of baking method(±s，n=3)

ΔP<0.05，與炮制前比較，comparedwithpre-processing

2.3 不同配伍比例對(duì)綠原酸含量的影響 經(jīng)研究分析可知，杜仲和續(xù)斷的配伍比例會(huì)對(duì)生品配伍以及炮制品配伍中的綠原酸含量產(chǎn)生影響，2者關(guān)系密切。具體數(shù)據(jù)如下表3所示。

表3 不同配伍比例對(duì)綠原酸含量的影響Tab.3 The effect of different compatibility proportion on chlorogenic acid

3 討論

在本次研究中，烘焙法雖然需要的時(shí)間較長(zhǎng)，但其斷絲率和成品率及損失率，顯著優(yōu)于其他2種方法，組間各指標(biāo)均存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這一研究結(jié)果表示，在對(duì)中藥杜仲炮制配伍進(jìn)行化學(xué)研究時(shí)，烘烤法是炮制杜仲的首選方法，對(duì)于提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性具有顯著優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，經(jīng)炮制，杜仲的木脂素類(lèi)和環(huán)烯醚類(lèi)等化學(xué)成分明顯減少(P<0.05)，但杜仲膠、微量元素、氨基酸和其他成分的變化并不顯著。這一研究結(jié)果表明，炮制前后，杜仲的化學(xué)成分會(huì)發(fā)生一定的變化，尤其是木脂素類(lèi)和環(huán)烯醚類(lèi)等成分的變化，可以有效提高杜仲的藥理作用[7]。

另外，本組的研究結(jié)果還顯示：經(jīng)研究分析可知，杜仲和續(xù)斷的配伍比例會(huì)對(duì)生品配伍以及炮制品配伍中的綠原酸含量產(chǎn)生影響，2者關(guān)系密切。同時(shí)，我們還可以從表3看出，如果2者的配伍比例相同，炮制品配伍所得到綠原酸含量 要略高于生品配置，但差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，可以進(jìn)行如下推論：杜仲不能直接入藥，只有經(jīng)過(guò)炮制后才能入藥。當(dāng)杜仲與續(xù)斷在1:1時(shí)綠原酸含量最低，在各個(gè)配伍比例中杜仲的量是相同的，且隨著續(xù)斷加入量的改變綠原酸含量均有所增加。綜上所述，中藥杜仲炮制配伍化學(xué)成分的變化和炮制的方法具有密切關(guān)聯(lián)。

[1] 高飛，傅超美，胡慧玲，等.關(guān)于中藥炮制機(jī)制研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)的思考[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，5(30):352-355.

[2] 越皓，皮子鳳，趙宇峰，等.電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析附子炮制中的化學(xué)成分變化[J].分析化學(xué)，2011，13(7):959-963.

[3] 崔景朝，趙自明.中藥配方顆粒研究進(jìn)展(Ⅱ)——中藥單煎與合煎對(duì)比研究概況[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，26(4):240-245.

[4] 呂邵娃，董書(shū)羽，郭玉巖，等.數(shù)據(jù)分析技術(shù)在中藥譜效關(guān)系中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，10(15):226-230.

[5] 孫娥，徐鳳娟，張振海，等.基于化學(xué)成分轉(zhuǎn)化-腸吸收屏障網(wǎng)絡(luò)耦聯(lián)作用的中藥炮制機(jī)制研究體系的構(gòu)建[J].中國(guó)中藥雜志，2014，12(3):370-377.

[6] 秦昆明，王彬，陳林偉，等.代謝組學(xué)在中藥現(xiàn)代研究的應(yīng)用與展望[J].中國(guó)中藥雜志，2014，9(16):3010-3017.

[7] 尉芹，韓建國(guó)，董娟娥，等.不同炮制方式對(duì)中藥材杜仲葉品質(zhì)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2011，24(1):85-87.

(編校：王儼儼)

Chemical research on different processed methods ofEucommiaulmoidesand compatibilities withHimalayanTeaselRoot

LI Jiao-ni1Δ, DING Sheng2, HE Chang-guo1

(1.Department of Pharmacy, Linhai Hospital of Traditional Chinese Medicine, Linhai 317000, China; 2.Department of Technology and Quality, Hangzhou Huqingyutang Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310026, China)

ObjectiveTo analyze and study the chemical research of different processed methods ofEucommiaulmoidesand compatibilities withHimalayanTeaselRoot, provide scientific reference for extraction of compound compatibility.MethodsTheEucommiaulmoideswas respectively processed by stir-fried, sand fry and baking method, and the three methods were compared.Then the chemical constituent change were detected by thin-layer chromatography (TLC), UV spectrometry and high performance liquid chromatography (HPLC) for baking method before and after processing.ResultsAlthough baking method needs a longer time of 107 min, but the rate of broken wires and yield were (97.89±0.52)%and (89.75±0.93)%, which were significantly higher than the stir-fried method of(86.15±0.33)% and (54.00±0.84)%, and the method of sand fry of (92.31±0.64)% and (64.73±0.71)%, and the loss rate was (9.64±0.98)%, which was significantly lower than other two methods of 4(45.65±0.73)% and (31.43±0.79)%, with significant differences between groups (P<0.05).After processing, cortex eucommiae lignans and cycloalkene ether chemical components decreased significantly (P<0.05), while the gutta-percha, trace elements, amino acids and other ingredients, with no significant difference.The compatibility proportion ofEucommiaulmoidesandHimalayanTeaselRoot affected chlorogenic acid content,with the close relationship.ConclusionThe change of chemical composition and different processed methods and compatibilities is closely related.

Eucommiaulmoides; processing;HimalayanTeaselRoot; compatibility; chemical research

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.055

李峧霓，通信作者，男，本科，主管中藥師，研究方向：中藥炮制與中藥藥理，E-mail:lijiaoni1208@163.com。

R283

A