楊賽，郭俏，段康民

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，陜西 西安 710069)

中藥抗細(xì)菌感染機理之淺見

楊賽，郭俏，段康民Δ

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，陜西 西安 710069)

抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用是人類醫(yī)學(xué)史上最重要的突破之一。但由于病原菌耐藥性的蔓延，傳染病再次對人類健康構(gòu)成巨大的威脅。中藥蘊藏著大量生物活性物質(zhì)，是新型抗生素開發(fā)的獨特而重要的資源。盡管有些傳統(tǒng)中藥有明確的臨床使用效果，中藥抗菌成分的臨床應(yīng)用卻極少，其作為抗生素藥品在國際醫(yī)藥界使用的情況甚少。結(jié)合本實驗室研究結(jié)果，本研究闡述了中藥抗細(xì)菌感染的新的分子機理。不同于傳統(tǒng)抗生素通過抑菌、殺菌而發(fā)揮作用，一些傳統(tǒng)中藥的有效成分實則是“抗致病藥物”，這類抗感染成分在臨床上具有病原菌產(chǎn)生抗性幾率低、對正常菌群影響小等優(yōu)勢。

中藥成分；抗致病藥物；抗生素；病原菌；藥物靶點

不斷出現(xiàn)的新病原體以及病原體抗藥性的蔓延，已對人類健康構(gòu)成巨大威脅。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的“世界抗結(jié)核藥物的抗性”報告指出，多重抗藥性結(jié)核已在世界范圍流行，在45個國家(包括我國)存在對幾乎所有可用藥物具有抗性的結(jié)核[1]。多重抗藥性的銅綠假單孢菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)等引起的醫(yī)院內(nèi)感染更是相當(dāng)普遍。對大多數(shù)甚或所有的現(xiàn)有臨床抗生素都有抗性的超級菌(super bugs)也已出現(xiàn)。更嚴(yán)重的是，使用新研制的以殺菌或抑菌為作用方式的抗生素，病原菌會不可避免地出現(xiàn)抗藥性[2]。普遍存在的交叉抗藥性，使多種抗生素同時失效。

中藥作為抗細(xì)菌感染藥物，上千年的醫(yī)療應(yīng)用可以說明其有效。青蒿素類抗瘧疾藥物是中藥作為抗微生物藥品的一個成功例子。它們來源于植物甜蒿木或青蒿，青蒿素最初于1971年在我國發(fā)現(xiàn)[3]。青蒿素對瘧源寄生蟲包括對其他藥品有抗性的瘧源蟲作用迅速、有效。在副作用極小的情況下，可以降低血液中寄生蟲的數(shù)量而迅速退熱。這些化合物在nM濃度范圍內(nèi)比其它任何抗瘧疾藥物都更迅速地阻止寄生蟲的新陳代謝并殺死瘧原蟲[4]。青蒿素類抗瘧疾藥物早已成為抗瘧疾藥物的中流砥柱。2015年我國科學(xué)家屠呦呦因青蒿素的發(fā)現(xiàn)而獲得諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎，使中藥再度成為人們關(guān)注的熱點。但迄今為止，中藥中的抗生素成分及機理尚未被充分研究。雖然，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，中藥中具有抗菌作用的化合物有多種，然而真正有效、可作為臨床用藥的成分卻不多。作為抗細(xì)菌感染藥品在國際醫(yī)藥界使用的中藥成分迄今為止近乎不存在。檢索傳統(tǒng)中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(TCMD中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫)中從3922種中藥和藥用植物中提取的9127種化合物，發(fā)現(xiàn)有135個化合物具有抗金黃色葡萄球菌活性，卻沒有任何一種成分應(yīng)用于臨床治療金黃色葡萄球菌感染。普遍存在的問題是抗菌效果不佳，很多是在高濃度下才表現(xiàn)出抗菌性能；其他問題則是體外有抗菌性能，而體內(nèi)沒有效果或毒性太大。為什么中藥抗菌作用明確，卻找不到確實有效的抗菌成分？有關(guān)中藥抗細(xì)菌感染的藥效機理的研究更是匱乏。造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于傳統(tǒng)的中藥抗生素成分研究受其思維模式和技術(shù)手段所限造成的。

1 抗細(xì)菌感染的新途徑

傳統(tǒng)抗生素的作用方式是通過不同靶點，抑制病原菌生長或殺死病原菌。最常見的靶點是核糖體、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁及核酸等，抗菌機制主要包括干擾蛋白質(zhì)的合成、抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、破壞細(xì)胞膜以及抑制核酸的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制等。但是，近年來的研究表明控制病原菌的感染，可以有其它的途徑。以病原菌致病因子及其調(diào)控途徑為靶點，旨在控制病原菌致病能力的新型抗感染途徑近年來正引起極大關(guān)注，呈現(xiàn)無限的潛力。

病原菌的致病性取決于其產(chǎn)生的一系列致病因子或稱毒性因子。它們的作用是幫助病原菌進入宿主、使病原菌逃避宿主免疫反應(yīng)或是導(dǎo)致宿主組織損壞直接造成病癥。這些包括幫助病原菌擴散或破壞宿主組織的酶類，起黏附作用的纖毛，內(nèi)、外毒素以及生物被膜形成相關(guān)因子等。抑制這些致病因子的表達(dá)或功能，將會阻止病原菌對人體的破壞，從而控制病原菌引起的感染。

同時，病原菌細(xì)胞之間的信號傳遞系統(tǒng)往往是調(diào)節(jié)病原菌致病性的樞紐[5]，它控制著病原菌的致病因子表達(dá)及生物被膜的形成，尤其是在慢性感染和難以治愈的感染中，病原菌的致病因子和致病過程呈現(xiàn)群體表達(dá)特性，受有多細(xì)胞特性的群體行為所控制。以上是造成慢性感染治療失敗的重要原因[5]。細(xì)菌細(xì)胞之間的信號傳遞系統(tǒng)中，“群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)” (quorum sensing，QS)是一個依賴于細(xì)胞數(shù)量的基因調(diào)控系統(tǒng)[7]。系統(tǒng)中的自導(dǎo)物(autoinducer 或AI)隨細(xì)胞的數(shù)量增加而變化，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量，系統(tǒng)中的自導(dǎo)物達(dá)到一定的域值時可以與一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，開始誘導(dǎo)或抑制數(shù)量眾多的基因表達(dá)，使細(xì)菌表現(xiàn)多細(xì)胞特性的群體行為。在革蘭氏陰性菌中最常見的自導(dǎo)物是酰基高絲氨酸內(nèi)酯類(acyl-homoserine lactone)分子，而在革蘭氏陽性菌中則是短肽類。而不同細(xì)菌種類之間還存在所謂“通用群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)”。這一系統(tǒng)的信號分子由luxS基因產(chǎn)物合成，是一類4,5-dihydroxy-2,3- pentanedione (DPD)的自催化衍生物[8-10]，稱作二型自誘導(dǎo)物(AI-2)。微生物細(xì)胞間的信息傳遞系統(tǒng)控制著包括次生代謝物的生產(chǎn)、細(xì)胞外分泌物的生成等重要細(xì)胞功能。在病原菌中群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控致病因子的表達(dá)及生物被膜的形成[5]。而人體中80%的感染可能涉及生物被膜。在生物被膜中，病原菌的抗藥性比游離狀要高50～5000倍[11]。生物被膜的形成及發(fā)育受群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制。因此，病原菌細(xì)胞之間的信號傳遞對病原菌致病過程至關(guān)重要，阻斷這一過程可以使病原菌失去致病能力。

針對致病因子及其調(diào)控系統(tǒng)的新型抗生素或稱“抗致病藥物”不僅可以控制感染，而且因其不對病原菌生存產(chǎn)生選擇壓力，病原菌將不太可能產(chǎn)生抗藥性。同時，這類藥物將不會像傳統(tǒng)抗生素那樣影響人體的正常微生物群體，而這些正常微生物群體對人體健康有著不可忽視的作用[12-13]。

2 中藥抗細(xì)菌感染的新機理

由于中藥的特性，中藥在使用時往往是幾種全藥混合使用，藥物成分極為復(fù)雜。所以，中藥療效很多情況下是復(fù)合成分作用，數(shù)種成分共同作用達(dá)到單個成分起不到的作用效果；而另一些情況下，有效成分可能是體內(nèi)代謝后生成的新化合物起作用。這些不僅是中藥抗生素成分研究的難題，也是整個中藥現(xiàn)代化研究需要解決的問題。除此之外，本課題組的前期研究結(jié)果揭示[14-15]，就中藥抗感染機理而言，有些中藥具有鮮為人知的“抗致病”功能，真正起作用的并非其傳統(tǒng)的抗菌、抑菌功能。換言之，傳統(tǒng)研究方法和思維方式在某種意義上使得一些中藥的真正作用機理不被了解，因而其真正的有效成分也許被遺漏掉了。

本課題組以77種與“清熱解毒”有關(guān)的中藥為對象 (見表1)，使用傳統(tǒng)的水提取和醇提取方法提取濃縮其化合物，對銅綠假單胞菌典型的的致病因子基因和群體感應(yīng)基因進行篩選測試。銅綠假單胞菌是一個機會致病菌，其致病因子基因的研究比較深入，它又是研究群體感應(yīng)系統(tǒng)的模式菌。銅綠假單胞菌可以在人群中引起嚴(yán)重感染，是患者在醫(yī)院期間發(fā)生感染的最主要的病原菌之一。在最近美國傳染病學(xué)會(IDSA)的大型抗生素可用性研究(The Antimicrobial Availability Task Force)確認(rèn)的幾個對人類健康威脅最大、但針對性藥物研究又很少的病原菌中，銅綠假單孢菌為其一[16]。銅綠假單孢菌尤其容易感染器官移植、燒傷、免疫系統(tǒng)受抑制的患者，如癌癥和艾滋病患者等，并常?？梢栽斐苫颊咚劳?。銅綠假單胞菌的一個重要特性是它對許多抗生素具備很高的內(nèi)在抗藥性[17]，使其成為難以治療的病原菌。銅綠假單胞菌也是研究細(xì)菌致病性和抗藥性的重要對象。銅綠假單胞菌的致病性由為數(shù)眾多的包括外毒素、彈性蛋白酶、溶血素等在內(nèi)的致病因子決定，同時它有3種不同的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)：酰基高絲氨酸內(nèi)酯為基礎(chǔ)的las和rhl系統(tǒng)以及喹諾酮為基礎(chǔ)的PQS(Pseudomonas Quinolone Signal)系統(tǒng)。這些群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控著大部分已知致病因子的表達(dá)。

表1 制備水提取物和醇提取物的中藥的名單

對這些中藥提取物的篩選結(jié)果表明，本課題組所選的中藥絕大多數(shù)都含有影響致病因子基因或群體感應(yīng)基因表達(dá)的成分。圖1所示是20種中藥對7個代表性致病因子的影響結(jié)果?？梢娒恳环N中藥的水提物或是其醇提物或是二者都至少對一個致病因子有調(diào)控作用。

圖1 20種中藥的水提及醇提物對銅綠假單胞菌代表性致病因子基因表達(dá)調(diào)控的熱點圖綠色為抑制，紅色為促進，黑色為沒有影響，顏色深淺表示影響程度；W：水提物，Eth：醇提物Fig.1 The heat map that the expression regulation of Pseudomonas aeruginosa representative pathogenic factor gene under the work of 20 kinds Chinese herbs water and alcohol extractGreen, suppress; red, promote; black, no effect; the degree of the color indicates the degree of influence; W: water extract, Eth: alcohol extract

代表性樣品對病原菌運動性和蘇鼠李糖脂合成基因的抑制作用(見圖2)。左右圖為同一個平板在白光下的照片和自身發(fā)光照片。報道菌體涂布在整個平板上，基因表達(dá)水平由菌體發(fā)光強度(明暗度)表示。3種中藥(爵床科植物、敗醬科植物和蘿藦科植物) 提取物所在濾紙片的周圍發(fā)光明顯降低 (右圖)，表明3種中藥對rhlA有抑制，且它們對細(xì)菌生長沒有影響，無抑菌圈(左圖)。白頭翁與仙鶴草的提取物可以明顯抑制銅綠假單胞菌的泳動能力，大青葉的提取物對泳動沒有影響(左圖)。黃連的提取物則可以明顯抑制銅綠假單胞菌的叢動能力(右圖)。

圖2銅綠假單孢菌致病因子基因rhlA表達(dá)和運動性受中藥粗提物的抑制A：rhlA表達(dá)受中藥粗提物的抑制，1：爵床科植物提取物；2：敗醬科植物提取物；3：蘿藦科植物提取物；B：運動性受中藥粗提物的抑制，Sample 5：白頭翁提取物；Sample 52：仙鶴草提取物；Sample 23：大青葉提取物；Sample 2：黃連Fig.2 The herbs extract suppress the expression of rhlA and the motility of Pseudomonas aeruginosaA: The herbs extract suppress the expression of rhlA.1: Acanthaceae extracts; 2: Valerianaceae extracts ; 3: Asclepiadaceaeextracts.B:The herbs extract suppress the motility.Sample 5: Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel extract; Sample of 52: Agrimonia Pilosa Ledeb.extract; Sample 23: Isatis indigotica Fort.extract; Sample 2: Coptis chinensis Franch extract

在篩選中，發(fā)現(xiàn)約60%的中藥材的提取物含有效抗致病成分，陽性率似乎高得不同尋常。但是考慮到所選中藥材都是具有抗感染、消炎作用，成分來源是經(jīng)過長期臨床驗證了的有效中藥，這提示了中藥中某些成分尚未發(fā)現(xiàn)的抗致病效用可能相當(dāng)普遍。

總之，清熱解毒中藥普遍存在抗致病因子或抑制群體感應(yīng)作用的成分，其作用也許是這類中藥真正的抗感染藥效機理。同時應(yīng)當(dāng)注意的是，有些中藥成分對病原菌的致病因子或其調(diào)節(jié)因子具有促進作用，因而可能會在體內(nèi)對病原菌感染的控制起負(fù)作用。因此，甄別中藥的有效成分，選擇利用真正的“抗致病”成分極為重要。

3 中藥抗細(xì)菌感染成分的研究展望

針對病原菌致病因子的“抗致病藥物”是當(dāng)前抗生素研究的新理念、新范式(paradigm)。傳統(tǒng)抗生素殺滅細(xì)菌的這一策略從根本上存在問題。病原微生物是繁殖快、易突變、變化復(fù)雜的生物，注定會逃脫抗生素等對其生存構(gòu)成的壓力。任何以殺滅活性、抑制生長為作用方式的藥物最終都將導(dǎo)致病原菌對其產(chǎn)生抗藥性[2]。2001年第一個進入臨床使用的Oxazolidinone 類抗生素 Linezolid, 在2002年已有抗藥性菌株出現(xiàn)。相反，針對致病性的新型抗感染藥物卻呈現(xiàn)不同的景象。針對致病因子纖毛的抑制物(稱作pilicides)成功地阻止了泌尿系統(tǒng)致病菌的附著及生物膜形成[18]，證明此類“抗致病藥物”具有巨大的應(yīng)用前景。

中藥中存在大量抗銅綠假單胞菌致病藥物成分的實驗結(jié)果表明，中藥中某些成分尚未發(fā)現(xiàn)的抗致病效用可能相當(dāng)普遍。抑制致病因子表達(dá)從而控制感染，對于病原菌來說，不像有殺菌、抑菌作用的傳統(tǒng)抗生素那樣有生存壓力，因此抗性產(chǎn)生的幾率相對較小。人們普遍認(rèn)為的“中藥不易形成抗藥性”，這也許是一個事實，一個由其特殊作用機理決定的特性。鑒于這一類新型抗細(xì)菌感染藥物的特殊作用機理，這類新型抗致病藥物相對傳統(tǒng)抗生素具有極大的潛力優(yōu)勢。

以中藥為資源，研究開發(fā)新型抗生素或抗致病藥物，還需要結(jié)合新的技術(shù)和方法。發(fā)現(xiàn)新的抗生素的傳統(tǒng)方法是利用整體病原菌細(xì)胞篩選對其生長有抑制的物質(zhì)。這一方法的優(yōu)點是篩選到的活性物質(zhì)都可以進入細(xì)胞，但這種方法靈敏度低，要求所篩選的有效物質(zhì)在樣品中的濃度要大，低濃度的有效物往往被漏掉。而近些年使用的體外靶點篩選法以微生物生命活動中重要的酶等為作用靶點，體外篩選有針對性的抑制劑等，這一方法有高靈敏度的優(yōu)點，但許多在體外靶點所研究出的抗生素物質(zhì)由于不能進入細(xì)胞而往往在體內(nèi)(invivo)試驗中失敗。胞內(nèi)靶點的方法可以結(jié)合二者的優(yōu)勢。以熒光素酶基因為標(biāo)記的報道子和熒光蛋白為標(biāo)記的報道子可以用來建立致病因子基因報道體，具有實時、定量、簡便等特點，是近年來使用較多的方法。隨著技術(shù)發(fā)展，相信更好、更多的新方法將為研究中藥抗細(xì)菌感染成分提供選擇。

最后，抗致病藥物由于其特性的限制，并不會取代以抑菌、殺菌為目的的傳統(tǒng)抗生素。對某些細(xì)菌感染比如菌血癥，傳統(tǒng)抗生素的使用也許更有優(yōu)勢，因為這種情況下快速清除病原菌極為重要。在未來，由現(xiàn)代方法技術(shù)和創(chuàng)新性思維研制的、來源于中藥的抗致病藥物將很可能和傳統(tǒng)抗生素一起，共同成為人類抵御細(xì)菌感染的有效武器。

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(編校：王儼儼)

Perspectives on antibacterial activities of traditional Chinese medicine and its potential mechanisms

YANG Sai, GUO Qiao, DUAN Kang-minΔ

(College of Life Science and Technology, Northwest University, Key Laboratory of Resources Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Xi’an 710069, China)

The discovery and use of antibiotics is one of the most important breakthroughs in medical history.However, the uprising and spread of the drug-resistance bacterial pathogens have posed a great threat on human health once again.There is an urgent need to develop new antibiotics.Traditional Chinese medicine contains a large volume of bioactive substances suited for novel antibiotic development.However, clinical use of antibiotics of Chinese medicine originis are very rare despite the fact that Chinese medicine has been used for infectious diseases for many years.In this paper, we propose a new mechanism of action for Chinese medicine in treating infectious diseases based on our experimental data.Unlike conventional antibiotics which kill pathogens or inhibit their growth, the traditional Chinese medicine probably function through repressing bacterial pathogenicity.That is, they are actually “antipathogenic drugs”.There are several advantages these antipathogenic drugs possess over traditional antibiotics, including that pathogens are less likely to develop resistance and the drugs have less effect on normal members of the human microbe.

Chinese herbs; disease-causing agents; antibiotics; pathogenic bacteria; drug target

國家自然科學(xué)基金(31570131)；中國博士后科學(xué)基金(2014M562444)

楊賽，男，碩士，研究方向：銅綠假單胞菌致病性以及耐藥性研究，E-mail:1127207674@qq.com；段康民，通信作者，男，博士，教授，研究方向：微生物群體間的信號傳遞、病原菌致病機理、新抗菌靶點和中藥及天然產(chǎn)物中新型抗生素篩選，E-mail：kduan@nwu.edu.cn。

R259；R51

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.04