胡楊 胡丹雄 廉凱* 覃威 晏雄偉

論著·臨床研究

硫化氫在骨巨細(xì)胞瘤中的檢測(cè)及其在病情評(píng)估中的意義*

胡楊1胡丹雄2廉凱1* 覃威1晏雄偉1

目的檢測(cè)骨巨細(xì)胞瘤組織硫化氫濃度并研究其臨床意義。方法檢測(cè)骨巨細(xì)胞瘤患者腫瘤組織和瘤旁正常組織硫化氫、胱硫醚合成酶（Cystathionine beta synthase,CBS）和胱硫醚裂解酶（Cystathionine gamma synthase,CSE）表達(dá)并比較其差異，分析骨巨細(xì)胞瘤患者硫化氫濃度與臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果骨巨細(xì)胞瘤組織中硫化氫濃度、CBS和CSE的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著高于瘤旁正常組織骨巨細(xì)胞瘤患者腫瘤組織中硫化氫濃度在性別、年齡和腫瘤部位中無明顯差異（均，在腫瘤最大徑、Jaffe分級(jí)和Campanacci分級(jí)中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均腫瘤最大徑越大、Jaffe分級(jí)越高及Campanacci分級(jí)越高硫化氫濃度越高。結(jié)論骨巨細(xì)胞瘤中硫化氫濃度顯著升高，與臨床病理因素密切相關(guān)，可能在骨巨細(xì)胞瘤病情評(píng)估中具有重要意義。

骨巨細(xì)胞瘤；硫化氫；病情

骨巨細(xì)胞瘤多侵犯四肢長骨末端，約50%發(fā)生在膝關(guān)節(jié)周圍，侵襲破壞力大，易局部復(fù)發(fā)，故尋找病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物對(duì)骨巨細(xì)胞瘤的診斷與治療具有重要意義[1,2]。硫化氫是人體內(nèi)第3種氣體信號(hào)分子，由胱硫醚合成酶（CBS）以及胱硫醚裂解酶（CSE）催化L-半胱氨酸而生成，大量研究表明硫化氫在腫瘤和炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3,4]，但目前在硫化氫及其合成酶CBS和CSE與骨巨細(xì)胞瘤的關(guān)系方面尚無相關(guān)研究。本研究檢測(cè)骨巨細(xì)胞瘤患者硫化氫、CBS和CSE表達(dá)，研究硫化氫在骨巨細(xì)胞瘤病情評(píng)估中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013年1月～2015年6月本科診治的骨巨細(xì)胞瘤患者為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：首次就診，既往未行手術(shù)、放療或化療等治療；均經(jīng)X線、CT、MRI和術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診；排除合并其他腫瘤等。本研究共納入32例骨巨細(xì)胞瘤患者，包括男15例，女17例；年齡20～50歲，平均年齡（36.8±4.5）歲。本組患者均取骨巨細(xì)胞瘤組織及對(duì)應(yīng)瘤旁正常組織做后續(xù)檢測(cè)。

1.2 硫化氫檢測(cè)

采用敏感硫電極法檢測(cè)骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織硫化氫含量。采用敏感硫電極測(cè)定溶液中S2-，間接反映硫化氫的濃度。取骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織加入反應(yīng)瓶，加入0.5mLHCl（1mol/L），使組織硫化氫釋放，反應(yīng)瓶中小燒杯內(nèi)加入0.5mLNaOH（1mol/L），以吸收硫化氫，用雙層石蠟?zāi)ぱ杆俜饪?。將反?yīng)瓶置于37℃水浴箱孵育4小時(shí)。取出小燒杯內(nèi)液體，加入0.5 mL抗氧化液。采用酸度計(jì)測(cè)定溶液中的電壓值。使用標(biāo)準(zhǔn)S2-溶液用抗氧化液稀釋成1、10、20、40、80、100 mol/L溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算S2-濃度，S2-間接反映硫化氫的濃度。

1.3 CBS和CSE的mRNA表達(dá)檢測(cè)

根據(jù)蛋白質(zhì)提取試劑盒操作說明提取巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織總RNA，采用RT-PCR檢測(cè)CBS和CSE的mRNA表達(dá)，以GAPDH為對(duì)照，引物序列見表1，PCR后的產(chǎn)物采用凝膠電泳后顯像檢測(cè)。

表1 RT-PCR檢測(cè)CBS和CSE的mRNA表達(dá)引物序列

1.4 CBS和CSE蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot檢測(cè)CBS和CSE蛋白質(zhì)表達(dá)，以每孔20g的上樣量行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，脫脂牛奶封閉1小時(shí)后，以兔抗CBS和CSE一抗4°C孵育過夜，TBST（10 min×3次）漂洗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2小時(shí)，TBST洗膜，ECL顯影，以-actin為內(nèi)參拍照分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織硫化氫濃度、CBS和CSE的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)對(duì)比采用檢驗(yàn)。不同臨床病理因素中硫化氫濃度對(duì)比采用檢驗(yàn)。認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織硫化氫對(duì)比

骨巨細(xì)胞瘤組織中硫化氫濃度為（0.63±0.11）nmol/mg，瘤旁正常組織中硫氫濃度為（0.12±0.01）nmol/mg，骨巨細(xì)胞瘤組織中硫化氫濃度顯著高于瘤旁正常組織（圖1）。

圖1 骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織硫化氫濃度對(duì)比

2.2 骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織CBS和CSE的mRNA對(duì)比

骨巨細(xì)胞瘤組織中CBS和CSE的mRNA表達(dá)水平均顯著高于瘤旁正常組織（均，具體結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織CBS的mRNA對(duì)比

圖3 骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織CSE的mRNA對(duì)比

2.3 骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織CBS和CSE蛋白質(zhì)對(duì)比

骨巨細(xì)胞瘤組織中CBS和CSE蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于瘤旁正常組織（均具體結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織CBS蛋白質(zhì)表達(dá)對(duì)比

圖5 骨巨細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織CBS蛋白質(zhì)表達(dá)對(duì)比

2.4 硫化氫與臨床病理因素的關(guān)系

比較本組骨巨細(xì)胞瘤患者腫瘤組織中硫化氫在不同臨床病理因素中的差異，硫化氫濃度在性別、年齡和腫瘤部位中無明顯差異（均，在腫瘤最大徑、Jaffe分級(jí)和Campanacci分級(jí)中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均，腫瘤最大徑越大、Jaffe分級(jí)越高及Campanacci分級(jí)越高硫化氫濃度越高（表1）。

3 討論

骨巨細(xì)胞瘤具有潛在的侵襲性惡變，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，加上其對(duì)放化療治療不敏感，導(dǎo)致目前骨巨細(xì)胞瘤的療效及預(yù)后較差，故尋找能早期診斷骨巨細(xì)胞瘤對(duì)病情評(píng)估具有決定意義。骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，隨著快速雜交及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)在骨巨細(xì)胞瘤中的應(yīng)用，基因突變、基因表達(dá)譜及信號(hào)通路等基因組學(xué)實(shí)踐被認(rèn)為參與骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，其中信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常被認(rèn)為是骨巨細(xì)胞瘤最主要的發(fā)病機(jī)制[5,6]。硫化氫作為人體內(nèi)第3種氣體信號(hào)分子，體內(nèi)由CBS及CSE催化L-半胱氨酸而生成，大量研究表明一碳單位以及含巰基物質(zhì)廣泛參與含巰基物質(zhì)代謝以及藥物轉(zhuǎn)化，而硫化氫合成途徑位于一碳單位與轉(zhuǎn)硫途徑的關(guān)鍵位置，廣泛參與-SH與-SS-的代謝循環(huán)，并且其終末產(chǎn)物正是體內(nèi)最重要的還原性物質(zhì)谷胱甘肽。研究表明，硫化氫具有促進(jìn)血管新生的作用，腫瘤細(xì)胞通過促進(jìn)CBS和CSE的合成而增加硫化氫的合成，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[7]，而有些體外實(shí)驗(yàn)則表明硫化氫具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲及誘導(dǎo)凋亡等功能[8,9]?；谶@些證據(jù)，推測(cè)硫化氫可能與骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制存在關(guān)聯(lián)，本研究中，骨巨細(xì)胞瘤的腫瘤組織的硫化氫濃度、CBS和CSE的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著高于瘤旁正常組織，證實(shí)硫化氫與骨巨細(xì)胞瘤的關(guān)系。

表1 不同臨床病理因素中硫化氫濃度差異對(duì)比

表1 不同臨床病理因素中硫化氫濃度差異對(duì)比

目前評(píng)估骨巨細(xì)胞瘤的病情的指標(biāo)包括Jaffe分級(jí)和Campanacci分級(jí)，前者為病理學(xué)分級(jí)，分級(jí)越高表示惡性程度越大；后者為影像學(xué)分級(jí)，分級(jí)越高表示病情越重，預(yù)后越差。Jaffe分級(jí)無法在術(shù)前提供客觀科學(xué)證據(jù)，而Campanacci分級(jí)多受影像學(xué)檢測(cè)儀器及閱片人員主觀影響，均無法提供準(zhǔn)確的病情評(píng)估證據(jù)，故分子水平的標(biāo)志物可能較傳統(tǒng)的Jaffe分級(jí)和Campanacci分級(jí)更能反映病情。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性硫化氫及其合成酶CBS和CSE在膀胱癌組織中表達(dá)水平顯著高于正常組織，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其與膀胱癌的分期和分級(jí)緊密相關(guān)，表明其可用于評(píng)估膀胱癌的病情及預(yù)后[10]。本研究中，比較本組骨巨細(xì)胞瘤患者腫瘤組織中硫化氫在不同臨床病理因素中的差異，發(fā)現(xiàn)硫化氫濃度在性別、年齡和腫瘤部位中無明顯差異（均在腫瘤最大徑、Jaffe分級(jí)和Campanacci分級(jí)中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均腫瘤最大徑越大、Jaffe分級(jí)越高及Campanacci分級(jí)越高硫化氫濃度越高，這些證據(jù)表明硫化氫可能在骨巨細(xì)胞瘤病情評(píng)估中具有重要意義。新型氣體信號(hào)分子硫化氫的研究在國際上也尚處于起步階段，在骨巨細(xì)胞瘤方面更是空白，故本實(shí)驗(yàn)意義重大，可能為骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制及診斷治療探索提供新的研究方向。

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Expression of hydrogen sulfide in patients with giant cell tumor of bone and value in evaluation of disease condition

Hu Yang1,Hu Danxiong2,Lian Kai1,et al.1 Department of Orthopedics,Xiangyang Central Hospital,Affiliated to Hu Bei University of Arts and Science,Xiangyang Hubei,441021;2 Xiaohe Township Hospital,Xiangyang Hubei, 441021,China

Objective To detect the hydrogen sulfide in patients with giant cell tumor of bone and study its value in evaluation of disease condition.Methods Hydrogen sulfide,cystathionine gamma synthaseandcystathionine gamma synthase expressions in patients with giant cell tumor of bone were detected and compared.The differences of hydrogen sulfide in different clinicopathological factors were compared.Results The hydrogen sulfide,cystathionine gamma synthase and cystathionine gamma synthase expressions in tumor tissues were significantly higher than in adjacent normal tissues.The differences of hydrogen sulfide in tumor diameter,Jaffe staging and Campanacci staging were statistics significantConclusion The hydrogen sulfide in patients with giant cell tumor of bone is significantly high and correlates with clinicopathological factors,which may play an important role in disease condition evaluation of disease condition.

Giant cell tumor of bone;Hydrogen sulfide;disease condition;

R738.1

B

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.05.008

swgk2016-03-00044

胡楊（1983-）男，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：骨科。

*[通訊作者]廉凱（1968-）男，博士，主任醫(yī)師。研究方向：骨科。

2016-03-07）

湖北省衛(wèi)生廳一般項(xiàng)目（JX6B36）

1湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院骨科（襄陽市中心醫(yī)院），湖北襄陽441021；2湖北襄陽宜城市小河衛(wèi)生院，湖北襄陽441201