李朦 劉宏偉

[摘要]背景：脂肪源性干細胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）因其具備來源豐富、取材容易、具有多向分化潛能特點而成為現(xiàn)今成體干細胞研究的熱點，同時其在臨床研究及應用中也擁有廣闊的前景。完善的提取設施及最符合臨床使用規(guī)范的細胞使用及保存方法，是ADSCs能更安全有效的應用于臨床的關鍵所在。目的：通過對現(xiàn)有的細胞保存介質、保存方法及保存時間進行綜述，為臨床即用型脂肪源性干細胞的短期運送及保存提供理論基礎。方法：廣泛查閱近年相關文獻，對脂肪源性干細胞的研究歷史、臨床應用及其他成體干細胞的保存方式及臨床轉化應用進行綜合論述。結果：4℃條件下保存細胞，對短期內細胞的活性和生物學特性影響最小，相對室溫條件下有明顯優(yōu)勢；血清是細胞培養(yǎng)中重要的成分之一，包含各種血漿蛋白、生長因子、碳水化合物等多種物質，能提供氨基酸、維生素、無機物等細胞生長必需物質，對脂肪源性干細胞的存活力及細胞增殖亦有促進作用；富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）內含豐富的血小板，是全血中血小板數量3倍以上，能釋放出多種生長因子，如血小板衍生生長因子（Platelet derived growth factor，PDGF）、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）、類胰島素生長因子（Insulin like growth factot，IGF）等，對脂肪源性干細胞的細胞增殖及分化功能有明顯的促進作用。結論：4℃條件下使用含豐富的生長因子及無毒性的血清及PRP可能是較好的保存細胞活性及能安全使用的保存介質。

[關鍵詞]脂肪源性干細胞；人血清；富血小板血漿；細胞保存

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）04-0100-04

問充質干細胞是備受關注的一類具有多向分化潛能的成體干細胞，其可在體外培養(yǎng)擴增，誘導分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞及肌肉細胞等多種組織細胞，如骨髓源性問充質干細胞、臍帶問充質干細胞等，但因其取材創(chuàng)傷大、純化率低且數量有限，不能廣泛用于實驗研究及臨床應用。2001年Zuk等從人脂肪組織中分離出了可以自我更新、具有多向的分化潛能的成纖維樣細胞群，即脂肪源性干細胞（Adipose-derived stromal vascular fraction cells/stem cells，SVF/ADSCs）。ADSCs因其具有來源豐富、取材容易、增殖迅速、低免疫原性和免疫調節(jié)作用，不涉及道德倫理問題等優(yōu)點，而受到廣泛關注及研究。ADSCs作為成體干細胞家族的新成員，在再生醫(yī)學領域展現(xiàn)了廣闊的應用前景，并可能作為一種新的細胞產品或新技術用于臨床研究及治療。由于臨床治療的特點和需求，作為細胞產品從制備完成到治療使用前的這一時間段（包括細胞產品的運輸過程）如何保持細胞產品活力的最佳狀態(tài)或進入人體后能發(fā)揮較好的治療效果，保存方法是一個值得高度關注的問題。

ADSCs來自脂肪組織，可通過脂肪抽吸技術獲取脂肪組織，使用膠原酶消化后離心可從抽吸的脂肪懸濁液中分離出血管基質碎片（stromal vascular fraction，SVF），ADSCs就包含于SVF中。有文獻報道，在脂肪移植的早期，ADSCs的存在可以促進血管再生、增加毛細血管密度和血供；利用ADSCs進行自體脂肪移植即加入細胞輔助脂肪移植技術（cell-assisted lipotransfer，CAL）能顯著提高脂肪移植的成活率并保有持續(xù)性，其存活率可達70%。通過研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs不僅可以通過自我復制分化為脂肪細胞，還可以分化為血管內皮細胞或周圍細胞，并且有研究指出在缺氧的環(huán)境下ADSCs可以分泌血管生長因子，通過表達血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulinike growth factors，IGF）等來阻止脂肪細胞凋亡的發(fā)生，維持脂肪細胞的成活率。

1臨床應用型細胞的長期保存

臨床實踐中干細胞的應用已有一定的發(fā)展，目前采用干細胞治療的疾病有70多種，包括代謝性疾病、腫瘤、血液性疾病和免疫缺陷性疾病，如臍帶問充質干細胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC）、骨髓問充質干細胞、造血干細胞（Hematopoietic stem cell，HSC）等的應用。然而細胞的臨床應用還存在著許多問題，特別是細胞的提取需要在嚴格的藥品生產質量管理規(guī)范（Good Manufacturing Practice，GMP）實驗室中進行，而現(xiàn)今很多醫(yī)院不能滿足細胞即提即用的條件，又或者細胞在提取后出現(xiàn)臨時狀況而不能及時的應用，所以如何保證細胞的最佳活力，妥善保存細胞顯得尤為重要。

以往的研究中，許多學者已提出多種保存方法，主要的保存技術有：4℃非冷凍保存、程控降溫液氮（-196℃）保存、-80℃直接冷凍保存。細胞凍存已經是國內外認可的一種相對成熟的細胞保存方法，2009年Baust JG等人將細胞的冷凍保存定義為：細胞、組織或者器官冷凍在-80℃尤其是-140℃以下能保證其存活能力的過程稱為細胞的冷凍保存。有研究表明凍存1年的人臍帶血管內皮細胞生物學特性無明顯改變，也已有研究提出細胞在-196℃液氮環(huán)境下生化反應與活力代謝基本處于靜止狀態(tài)。Guangpengliu等人曾將人源性ADSCs儲存于液氮中2周后復蘇，證實冷凍保存對ADSCs的增殖能力及成骨分化能力無明顯影響，是可以應用于骨組織工程中的一種細胞保存方式。在國內，也有低溫凍存對人脂肪間充質干細胞生物學特性的影響的研究，實驗結果表明ADSCs凍存于液氮中1、3和6個月，復蘇后仍具較高的存活率，并且其生物學特性保持穩(wěn)定，仍具有多向分化潛能。在過去關于ADSCs的保存方法研究的報道相對較少，而對于其他干細胞的保存較多，例如Laure Calvet等人報道了109例-80℃簡易凍存法凍存外周造血干細胞，粒系植入的中位時間是13d，血小板植入的中位時間是12d，細胞活性回收率極高。

雖然如此，細胞凍存還是存在很多問題，其中最主要的是細胞膜的不可逆性破壞，以至于細胞復活率低、復蘇后的細胞活性差。導致這種結局的原因包括：①細胞毒性損傷；②在凍融的過程中冷凍保護劑的滲透性損傷：DMSO是目前最長采用的細胞凍存保護劑，但DMSO的臨床應用還存在著很大的安全隱患；③細胞內冰晶形成的機械損傷；④解凍過程中細胞內再結晶的機械損傷。當降溫速率過快，細胞內外同時形成冰晶，導致細胞損傷和死亡，如果復溫速率過快慢，也同樣如此。所以相對于臨床要求來說，細胞凍存程序操作繁瑣，且環(huán)境、設備要求高，不太適合臨床即用細胞的應用。

2間充質干細胞短期保存的相關研究

現(xiàn)今大多數的研究主要聚焦于問充質干細胞的長期保存，對于細胞的短期保存和運輸過程中的保存問題甚少有報道。Lane等提出滿足臨床應用要求的保存，復蘇后細胞活性至少應達到80%。Daisuke Matsumoto MD.等人將抽吸后的脂肪分別存放于室溫下1、2、4和24h，4℃下1、2、3d，及-80V下1個月，分別觀察脂肪電鏡下的形態(tài)變化及所含ADSCs的存活情況及活力的變化，結果顯示，脂肪在室溫下可以存放4h，在4℃下可以存放24h，所獲得的ADSCs沒有生物學改變。

時炳正等人比較了4℃條件下不同保存時間對小鼠骨髓間充質干細胞的細胞活性和生物學特性的影響，證實4℃條件下保存24h的小鼠骨髓間充質干細胞，活細胞的比例接近80%，細胞增殖和分化能力與0h相比無明顯差異，是一種簡潔有效的短期保存方法。陳京等人對臨床治療用人骨髓間充質干細胞保存條件進行研究，提出在4℃條件下，將間充質干細胞保存在5%人血清清蛋白氯化鈉注射液中0.5h內回輸對細胞活力影響最小。汪大琨等學者提出臍帶間充質干細胞在長途運輸時，選擇16℃條件下加入1%白蛋白可以有效保證細胞存活量，但當運輸時間大于8h時，細胞的存活率明顯下降。也有學者提出不同意見，周楠等人認為無論4℃還是室溫條件下，細胞在保存介質中的活性均在短期內呈時間依賴性下降，細胞死亡率呈時間依賴性增加。

3相關細胞保存介質的研究及選擇

在細胞應用于人體之前，細胞質量與細胞的保存環(huán)境密切相關，這也直接關系到細胞移殖后的成效。除了溫度和保存時間以外，細胞保存液的選擇同樣重要。在整形美容外科，ADSCs可單獨或混合脂肪后移殖到人體需要的部位，什么樣的細胞生存環(huán)境更有利于細胞的存活，使細胞具有更強的增殖分化能力呢？Yunsong Liu等人將ADSCs混合人富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）后的組織工程骨（ITB）注射到裸鼠的腹股溝區(qū)，通過觀察細胞的增殖、分化能力來評估骨形成情況，結果表明，ADSCs與10%～12.5%的PRP混合后骨形成最佳。Sang Jin Cheon等人在研究ADSCs的培養(yǎng)條件時發(fā)現(xiàn)，VEGF對ADSCs的增殖有明顯促進作用，其能夠促進血管生成，其中又以成纖維細胞生長因子（FGF）最好，并且在實驗中，學者有將培養(yǎng)細胞用的胎牛血清換為人血清，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)效果更好。

PRP含有超過生理濃度數倍的血小板，PRP激活后，血小板釋放出大量的活性因子，這些生長因子和細胞因子可以通過激活細胞表面受體來調控基因的表達，介導細胞增殖、分化，以及參與細胞外基質的降解和組織重建過程。生長因子能刺激新生血管生成，增加受損組織的血供和營養(yǎng)，同時PRP獲取過程創(chuàng)傷小、制備簡便，其對組織再生、創(chuàng)面修復、細胞輔助運用有很重要的意義。劉景蘭等人對兔ADSCs聯(lián)合PRP對自體脂肪顆粒植入裸鼠皮下后血運重建進行研究，發(fā)現(xiàn)混入PRP后血管生成明顯在增多，他們認為ADSCs與PRP聯(lián)合可促進移植脂肪顆粒中血管生成。

干細胞體外擴增培養(yǎng)一般使用胎牛血清作為細胞營養(yǎng)的來源，但胎牛血清屬于異源性物質，因其抗原性、致病性等原因不能應用于臨床。有學者提出自體或異基因供者的血液成分，例如人血清、血漿、血小板等可作為替代性培養(yǎng)基補充物供臨床使用。Su Jin Kim等人的研究中，證明了ADSC和BMSC在人血清中培養(yǎng)，可以保持干細胞的增殖和分化能力，是細胞和基因療法應用于臨床的理想選擇。2011年，H Shafaei等人用人胎盤血清代替胎牛血清作作為ADSCs培養(yǎng)基的成分，證實人胎盤提供的細胞微環(huán)境比胎牛血清更佳。在Ana Cla、udiaChagas de Paula等人報道，在成骨培養(yǎng)媒介中加入同種異體的人血清，有利于體外細胞的體外擴增。由此可見，人血清和PRP對ADSCs的增殖及分化均有促進作用，同時取材容易，操作簡單，成本低成效高，臨床應用容易實現(xiàn)。

4小結

目前對于間充質干細胞保存，采用的保存方法主要為長期深低溫凍存和短期4℃保存。長期低溫凍存設備要求高、花費大，冷凍程序繁瑣，需專人管理，難以推廣，并且還存在著“針狀冰晶胞內形成”、“凍存保護劑”對細胞的毒性及溫度差致細胞凋亡的種種問題，所以并不適用于臨床。4℃常規(guī)低溫保存后細胞相對較安全，并且操作簡單，容易實現(xiàn)，但長時保存同樣存在著細胞的滲透性損傷問題，所以根據符合臨床使用規(guī)范及設備條件，探討保存溫度、保存時間及保存介質對于ADSCs生物學特性的影響，選擇適合的保存方法，才能使細胞治療的臨床應用得意實現(xiàn)。

綜上所述，ADSCs在整形美容外科領域擁有很大的發(fā)展前景，并對修復組織或器官損傷、組織再生、容量流失及組織缺損的填充具有重要的臨床意義。

編輯/張惠娟