肖新云，劉又嘉，鄧艷玲，譚周進（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

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漢遜德巴利酵母菌在胃酸、腸膽鹽環(huán)境的耐受性研究

肖新云，劉又嘉，鄧艷玲，譚周進
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

摘 要：為探究漢遜德巴利酵母菌在酸性、膽鹽環(huán)境及人工胃腸液下的存活情況，采用活菌計數(shù)法，分別在pH值1.0、1.5、2.0、2.5，膽鹽濃度0.2%、0.3%、0.4%的PDA液體培養(yǎng)基，人工胃液作用0、2、4 h，以及人工腸液作用0、2、4、6、8、10 h環(huán)境下，測定漢遜德巴利酵母菌的活菌數(shù)。結(jié)果表明：耐酸試驗中，該菌株在pH值1.0沒有存活，pH值1.5、2.0、2.5活菌數(shù)與對照組比較下降明顯（P＜0.01）；耐膽鹽試驗中，該菌株在0.4%的高膽鹽濃度下仍然存活，活菌數(shù)隨膽鹽濃度增加而降低；人工胃液試驗中，與0 h比較，2 h、4 h活菌數(shù)顯著增加（P＜0.01）；人工腸液試驗中，隨著處理時間的延長，該菌株活菌數(shù)先升后降，但都比0 h活菌數(shù)增加?？梢?，漢遜德巴利酵母菌能夠耐受較高的酸性環(huán)境和較高的膽鹽環(huán)境，并在人工胃腸液環(huán)境下具有較高的存活能力，符合研制新型微生態(tài)制劑的條件。

關(guān)鍵詞：漢遜德巴利酵母菌；耐酸；耐膽鹽；人工胃液；人工腸液

當(dāng)前，微生態(tài)制劑作為一種無毒副作用、可調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡、發(fā)揮腸道益生功能的制劑正逐漸被研究和開發(fā)，雙歧桿菌類、乳桿菌屬、芽孢桿菌類和酵母菌屬的多個菌株已作為微生態(tài)制劑應(yīng)用于臨床，治療各種腸道疾?。?］。酵母菌是使用時間較長、效果明顯的益生菌，具有促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、增強機體免疫力和抵抗力、改善腸道內(nèi)菌群的分布等功效［2］。

胃腸道環(huán)境含有大量的胃酸、膽汁、微生物和一些酶類物質(zhì)，它們共同構(gòu)成一道天然的屏障，抵御外來微生物的定值和存活。益生菌是一類能維持腸道內(nèi)菌群平衡、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的活體微生物［3］，其發(fā)揮有益作用的關(guān)鍵在于能否抵御消化道內(nèi)的不良環(huán)境以及是否具有附著于胃腸道的粘附能力［4］。課題組從實驗動物腸道中分離鑒定出一株與治療菌群失調(diào)腹瀉療效相關(guān)的漢遜德巴利酵母菌，為研究它的益生特性，通過人工模擬胃液、腸液環(huán)境，以菌株存活數(shù)為指標(biāo)，設(shè)計了該菌株耐酸耐膽鹽試驗方案，以期為研制新型微生態(tài)制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 漢遜德巴利酵母菌由課題組從實驗動物小鼠腸道內(nèi)容物中分離提取。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA液體和固體培養(yǎng)基［5］。

1.1.3 試劑與儀器 豬膽鹽，胃蛋白酶（酶活力1∶10 000）、胰蛋白酶（酶活力1∶250），手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）、SHZ-82氣浴恒溫振蕩器（太原儀誠實驗室設(shè)備有限公司）和HH Bll·500-S電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博泰實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 從4℃冰箱中取出斜面培養(yǎng)基保存的漢遜德巴利酵母菌，室溫解凍后，接種于PDA斜面培養(yǎng)基進行活化，再將活化好的菌種接種到PDA液體培養(yǎng)基進行擴培。

1.2.2 耐酸試驗 將活化增殖的菌株按10%量接種于不同pH值（1.0、1.5、2.0、2.5）的PDA液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)48 h，以自然pH值做對照，做活菌培養(yǎng)計數(shù)［6-7］。

1.2.3 耐膽鹽試驗 將活化的菌株按10%量接種于添加不同的濃度膽鹽（0.2%、0.3%、0.4%）的PDA液體培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)48 h，以未添加膽鹽PDA培養(yǎng)基做對照，做活菌培養(yǎng)計數(shù)［6-7］。

1.2.4 人工胃液配制 準確量取20 mL 1 mol/L鹽酸，加蒸餾水和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值分別至1.5、2.5 和3.5。然后按1 g/100 mL加入胃蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，制得人工胃液備用［8］。

1.2.5 人工腸液配制 稱取KH2PO43.4 g，加蒸餾水250 mL溶解，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至6.8，加水稀釋至500 mL，再按0.1 g/L加入胰蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，制得人工腸液備用［9］。

1.2.6 模擬胃腸液試驗 將活化好的菌種按10%接種量分別接種于人工胃液和人工腸液中，混勻，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)，人工胃液處理后分別于0、2、4 h取樣，人工腸液分別于0、2、4、6、8、10 h取樣。處理后菌液用無菌水做10倍梯度稀釋，采用PDA固體培養(yǎng)基進行活菌計數(shù)［10-11］。

1.2.7 活菌培養(yǎng)計數(shù) 用無菌水做10倍稀釋，耐酸組稀釋至10-1、10-2，耐膽鹽實驗組稀釋至10-3，對照組稀釋至10-3，模擬胃液組稀釋至10-4、10-5，模擬腸液組稀釋至10-5、10-6。每支試管3次重復(fù)，每個稀釋度2個重復(fù)，采用涂抹平板計數(shù)法，每個平板滴取0.1 mL進行無菌涂布，靜置20 min后37℃倒置恒溫培養(yǎng)48 h，計數(shù)最適菌數(shù)（菌落數(shù)在30～300個為宜），將結(jié)果換算成cfu/mL。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)公式（1）求出菌落數(shù)［5］。實驗所得計量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

每mL樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù) （1）

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸性試驗

由表1可知，菌株在pH值1.0時沒有存活，在pH值1.5時，菌株開始能夠存活，而且隨著酸度值的增加，活菌數(shù)也增加。pH值1.5、2.0、2.5與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明酸性環(huán)境確實對漢遜德巴利酵母菌的生長有抑制作用。漢遜德巴利酵母菌在pH值1.5的酸性環(huán)境下能存活，也說明了該菌株能夠耐受較高的酸性環(huán)境。

表1 漢遜德巴利酵母菌在酸性環(huán)境中的活菌數(shù)量

2.2 耐膽鹽試驗

由圖1可知，隨著膽鹽濃度的提高，活菌含量減少，并與對照組0%比較都具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明膽鹽環(huán)境不利于該菌株的生長。0.3%、0.4%膽鹽濃度與0.2%膽鹽濃度比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明膽鹽濃度越高對該菌株的生長越不利。該菌株在0.4%的高膽鹽環(huán)境下能存活，提示該菌株能耐受較高的膽鹽環(huán)境。

圖1 膽鹽濃度對漢遜德巴利酵母菌生長的影響

2.3 人工胃液處理漢遜德巴利酵母菌活菌數(shù)

由表2可知，經(jīng)過2 h甚至4 h培養(yǎng)后，pH值1.5、2.5、3.5處理活菌數(shù)都較0 h增加，且具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），與2 h比較，pH值1.5、2.5、3.5在培養(yǎng)4 h后取樣活菌數(shù)仍然在上升，其中pH值3.5人工胃液培養(yǎng)4 h較培養(yǎng)2h后活菌數(shù)顯著增加，這說明漢遜德巴利酵母菌在人工胃液環(huán)境下活菌數(shù)不但沒有減少，反而能適應(yīng)性繁殖。

2.4 人工腸液處理漢遜德巴利酵母菌活菌數(shù)

由表3可知，隨著人工腸液處理的時間不同，漢遜德巴利酵母菌的活菌含量也不相同（P＜0.01）。其中與0 h比較，2、4、6、8、10 h都分別與之有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與2 h比較，4 h和6 h活菌數(shù)增加顯著；與4 h、6 h比較，8 h和10 h活菌數(shù)下降明顯?？傮w上來看，活菌含量是先升后降，但都比初始活菌量要高，這充分說明該菌株能夠存活并定值于腸道環(huán)境。

表2 不同pH值人工胃液處理對漢遜德巴利酵母菌生長的影

表3 人工腸液處理對漢遜德巴利酵母菌生長的影響

3 結(jié)論與討論

胃腸道的殺菌作用，主要是低pH值和高膽汁鹽酸。胃液的酸性環(huán)境可以激活胃蛋白酶原，從而殺死隨食物進入胃內(nèi)的細菌［12］。肝臟分泌到十二指腸中的高濃度的膽汁鹽酸具有抗菌活性，它對細胞膜具有較強的破壞能力，同時膽鹽能在小腸形成高滲透壓環(huán)境，使微生物質(zhì)壁分離，失水收縮。漢遜德巴利酵母菌是一種高耐鹽酵母菌，具有很強的蛋白質(zhì)和脂肪分解能力。目前對于其研究主要在于微生物發(fā)酵劑，如酒醅發(fā)酵、干酪發(fā)酵、臘肉脂肪水解等，用于提高產(chǎn)品的風(fēng)味［13-15］。對于漢遜德巴利酵母菌在腸道的研究也有報道，發(fā)現(xiàn)該菌株是凡納濱對蝦、虹鱒、刺參等腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌種［16］。Kumura 等［17］在體外模仿腸環(huán)境對8種乳制品來源酵母菌的益生菌潛力進行評估，發(fā)現(xiàn)漢遜德巴利酵母具有一定的腸壁粘附能力和耐酸耐膽鹽的能力，具有一定的益生菌開發(fā)價值，這也為該菌株開發(fā)功能性食品和微生態(tài)制劑提供了依據(jù)。

漢遜德巴利酵母菌要在腸道發(fā)揮益生功能，必須先能通過胃酸環(huán)境。一般胃液酸性環(huán)境約為3.0，空腹或食用酸性食品pH值可達1.5，食用堿性食品可達pH值4～5［8］。食物通過胃液的時間一般為1～2 h。從口腔到腸道這一過程中，益生菌首先要以活菌狀態(tài)通過胃才有機會進入腸道［18］。人體和動物小腸中膽汁濃度大約在0.03%～0.30%范圍內(nèi)波動，漢遜德巴利酵母菌要在腸道內(nèi)生存，必須能夠耐受一定濃度的膽汁［19］。試驗為了探究小鼠療效相關(guān)腸道中分離出來的漢遜德巴利酵母菌能否在胃腸道環(huán)境中存活，據(jù)此設(shè)計了pH值1.0、1.5、2.0、2.5等4個酸性梯度和0.2%、0.3%、0.4%等3個膽鹽濃度以及人工模擬了胃腸環(huán)境。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境、膽鹽濃度對該菌株的生長具有抑制作用，但該菌株仍能在pH值1.5高酸性環(huán)境和0.4%的高膽鹽環(huán)境下存活，說明該菌株能夠耐受較高酸性和較高膽鹽的環(huán)境。人工胃腸液環(huán)境下，該菌株不但沒有出現(xiàn)抑制性生長的情況，反而能在人工胃腸液環(huán)境中適應(yīng)性繁殖。由試驗結(jié)果可知，漢遜德巴利酵母菌具有被開發(fā)功能食品和微生態(tài)制劑的可能。此外，為了更全面的研究其益生菌特性，可考慮開展溫度對該菌株生長繁殖的影響以及該菌株的降膽固醇研究等，以更全面的評估該菌株的益生菌特性。

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

中圖分類號：R117

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-060X（2016）06-0006-03

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.06.003

收稿日期：2016-03-29

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81573951）；長沙市科技局項目（K1508025-21）

作者簡介：肖新云（1990-），男，江西吉安縣人，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥微生態(tài)學(xué)研究。

通訊作者：鄧艷玲

Tolerance Experiment of Debaryomyces hansenii in the Environment of Gastric Acid or Intestinal Bile Salts

XIAO Xin-yun，LIU You-jia，DENG Yan-Lin，TAN Zhou-jin
（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， PRC）

Abstract:To investigate the survival condition of Debaryomyces hansenii in the environment of acid， bile salt and artificial gastric intestinal juice， and provide the basis for development of new type of probiotics， using the method of surviving bacteria count， the number of Debaryomyces hansenii was detected under the condition of PDA liquid medium with pH value of 1.0， 1.5， 2.0 and 2.5， bile salt concentration of 0.2%， 0.3% and 0.4%， respectively， and also dealed with by the artifcial gastric juice of 0， 2， 4 h， artifcial intestinal juice of 0， 2， 4， 6， 8， 10 h. The results showed that in the acid test， the strain in pH 1.0 didn't survive， and the counts in pH 1.5， 2.0， 2.5 decreased signifcantly compared with control group （P＜ 0.01）； in the bile salts resistance test， the strain under the high bile salt concentration of 0.4% stilled alive， viable count decreased with increasing salt concentration； in the artifcial gastric juice experiment， the living bacterium number of 2， 4 h increased compared with 0 h （P＜ 0.01）； In the artifcial intestinal juice experiment， the strain increased at frst and lowered later but all the variable counts were more than 0 h. Therefore， Debaryomyces hansenii could tolerate high acidity and high bile salts environment， and high survivability in the artifcial gastric intestinal juice environment. It should be suitble for prodution of new type of probiotics.

Key words:Debaryomyces hansenii； acid-resisting； cholate tolerance； artifcial gastric juice； artifcial intestinal juice