古力扎努·阿合買提， 買爾旦·馬合木提

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院； 2附屬腫瘤醫(yī)院， 烏魯木齊　830011)

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HPLC法測定大鼠血漿及糞便中新疆紫草3種萘醌類色素的含量

古力扎努·阿合買提1， 買爾旦·馬合木提2

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院；2附屬腫瘤醫(yī)院， 烏魯木齊830011)

摘要:目的建立測定大鼠血漿及糞便中新疆紫草3種萘醌類成分含量的高效液相色譜法(HPLC法)。方法采用COSMOIL C18-AR-Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相A乙腈(A)-0.15%甲酸(B)(v/v)溶液，進(jìn)行洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm ，柱溫25℃，檢測時間35 min。結(jié)果血漿中左旋紫草素在0.40～6.40 μg、乙酰紫草素在25.0～600.0 μg、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素在25.0～600.0 μg 范圍內(nèi)均與峰面積呈線性關(guān)系，左旋紫草素回收率為97.78%～100.1%、乙酰紫草素為100.1%～100.2%、β-β′-二甲基丙烯酰紫草素為97.78%～100.1%，日間、日內(nèi)RSD均<1.5%。糞便中各組分在10～400 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，平均回收率分別為(78.2±2.5)%、(82.0±2.9)%和(79.5±3.5)%。0～12、12～24、24～48 h糞便中左旋紫草素絕對回收量分別為23.61、38.28、4.13 mg；乙酰紫草素分別為7.20、70.78、11.53 mg；β-β′二甲基丙烯酰紫草素分別為46.32、60.15、16.88 mg。結(jié)論HPLC法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，適用于測定血漿及糞便中新疆紫草萘醌類成分含量。

關(guān)鍵詞：新疆紫草； 左旋紫草素； 乙酰紫草素； β,β′-二甲基丙烯酰紫草素； HPLC； 大鼠血漿； 大鼠糞便

新疆紫草[Arnebia euchroma (Royle) Johnst]習(xí)稱軟紫草,又名假紫草、新疆軟紫草、新疆假紫草, 為紫草科多年生草本植物新疆紫草的根, 分布于我國新疆、甘肅及西藏西部地區(qū), 是藥材紫草的主要來源[1]。其具有涼血、活血、解毒透疹的功效，被臨床廣泛應(yīng)用[2]。新疆紫草中含有多種化學(xué)成分，包括萘醌類、苯醌類、生物堿類、苯酚、酚酸類、三萜酸、甾醇類、黃酮類以及多糖類等物質(zhì)。目前研究較多的是脂溶性很強(qiáng)的萘醌類化合物。萘醌類化合物主要有去氧紫草素(deoxyshikonin)、β,β-甲基丙烯酰紫草素(β,β-dimethylacrylshikonin,DS)、β-羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin,AS)、左旋紫草素(shikonin，SK)、去氫阿卡寧(dehydroalkanin)和β-羥基異戊酰阿卡寧(β- hydroxyisovalerylalkanin)等物質(zhì)[3]，其具有抗菌抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝、止血等作用[4-6]。本研究旨在建立HPLC法測定大鼠生物樣品血漿及糞便中新疆紫草3種萘醌類成分含量，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試藥

1.1實(shí)驗儀器LC-2010C高效液相色譜儀(日本島津)，CLASS-VP V6.14 SP1數(shù)據(jù)工作站(日本島津)，BP211D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)，SK3300H型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，DT-500A型電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司)，TDL-4型臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，EDTA k2抗凝真空采血管(奧地利VACUETTE)。

1.2試藥新疆紫草對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121430-201103)，左旋紫草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110769-200405)，乙酰紫草素對照品(德瑞試劑公司，批號：20130507-2)，β,β′-二甲基丙烯酰紫草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111689-200503)。新疆紫草藥材(購自新疆參茸中藥飲片公司批號：15072402)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)/生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為擬紫草屬植物新疆紫草(Arnebia euchroma (Royle) Johnst)的根。乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗動物SD大鼠由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，許可證號SCXK(新)2011-0004，SPF級，體質(zhì)量180～220 g。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備分別精密稱取左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素對照品適量，分別溶于甲醇中，制成100 mg/mL的對照品儲備液。再分別量取儲備液適量，用甲醇稀釋制成含左旋紫草素、乙酰紫草素和β.β′-二甲基丙烯酰紫草素分別為1.00、60.0 和60.0 mg/mL的混合對照品溶液,備用。取本品適量，按遞減法，分別用流動相稀釋制成含左旋紫草素0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg/mL，乙酰紫草素0.125、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/mL，β,β′-二甲基丙烯酰紫草素0.125、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、60.0 mg/mL的混合對照品系列溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2供試品溶液的制備分別稱取對照藥材和供試品藥材粉末各5.0 g，各加入12倍量(V/V)的95%乙醇溶液,置于150 mL具塞錐形瓶中，混勻，室溫放置，密封遮光，冷浸8 h后，過濾并收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約5.0 mL，用5.0 mL 95%乙醇潤洗，合并濃縮液和潤洗液，置于真空干燥箱40℃干燥12 h，得干浸膏。分別稱取干浸膏粉末0.1 g，加入1.0 mL甲醇，稱重，超聲使其完全溶解，冷卻至室溫，補(bǔ)足重量，過(0.45 μm)微孔濾膜，作為對照藥材和樣品的供試品溶液，備用。

2.3色譜條件COSMOILC18-AR-Ⅱ色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈(A)-0.15%甲酸(B)(v/v)溶液，洗脫流程0～10 min,A(%)=60%;10～15 min,A(%)=60%～70%;15～30 min,A(%)=70%;30～35 min,A(%)=70%～60%，流速1.0 mL/min；柱溫25℃，檢測波長275 nm ，檢測時間35 min，進(jìn)樣量20 μL。

2.4血漿樣品的處理取SD大鼠血漿48 μL于離心管中，加入對照品藥材溶液2.0 μL，渦旋混合1 min,加入等體積的稀鹽酸酸化，10 000 r/min離心2 min,取上清液50 μL于另一離心管中，加入乙腈50 μL渦旋混合1 min，10 000 r/min離心，取上清液，氮?dú)獯蹈?加入50 μL乙腈復(fù)溶，10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

2.4.1專屬性考察精密量取1 mg/mL的對照藥材儲備液0.2 mL于離心管中，揮干溶劑，加入空白血漿50 μL混勻。另取空白血漿、對照藥材和供試品溶液各50 μL與不同的離心管中，按“2.4”項下方法處理，按“2.3”項下色譜條件檢測，記錄色譜峰。在該色譜條件下，左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素分離效果好，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，結(jié)果見圖1～4。

1：左旋紫草素；2：乙酰紫草素；3：β,β-二甲基丙烯酰紫草素

1：左旋紫草素；2：乙酰紫草素；3：β,β-二甲基丙烯酰紫草素

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢測限取空白血漿 7份，每份50 μL，分別加入混合對照品系列溶液10 μL,使?jié)舛确謩e成為：左旋紫草素0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 mg/mL，乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素成為：1.25、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、600.0 μg/mL，按“2.4”項下方法處理，按“2.3”項下的色譜條件檢測，記錄色譜峰，以歸一化法計算處理。以各組分相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，各組分加入量為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸，左旋紫草素在0.40～6.40 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，線性方程為:Y=154.75X+896.75,R=0.997 0，最低檢測限為0.40 mg/mL；乙酰紫草素在25.0～600.0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，線性方程為：Y=378.09 X+9 611.3,R=0.994 3;最低檢測限為25 μg/mL；β,β′-二甲基丙烯酰紫草素在25.0～600.0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，線性方程為：Y=1 005.9X-1 832，R=0.992 1，最低檢測限為25 μg/mL。

2.4.3精密度試驗取空白血漿，按“2.4”項下方法分別制備左旋紫草素、乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素低、中、高3個濃度(含左旋紫草素0.10、0.80、6.40 μg/mL；含乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素均為1.25、100.00、600.00 μg/mL)溶液各6份，每個濃度的樣品分別每天測定1次，連續(xù)測定3 d，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測定樣品的濃度，分別計算日內(nèi)精密度與日間精密度，見表1。

2.4.4回收率試驗取“2.4.3”項下低、中、高3個濃度的樣品，以空白血漿加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液提取處理樣品與直接測定的對照品的峰面積比值計算提取回收率，左旋紫草素低、中、高3個樣品的回收率分別為(97.78±2.50)%、(99.20±2.50)%和(100.10±2.51)%；乙酰紫草素為(100.10±2.12)%、(100.00±3.12)%和(100.2±3.01)%；β,β′-二甲基丙烯酰紫草素為(97.78±2.50)%、(99.90±2.12)%和(100.10±3.20)%。

2.4.5穩(wěn)定性試驗取精“2.4.3”項下低、中、高3個濃度的血漿樣品，室溫放置6 h，反復(fù)凍融3次，-20℃冰凍保存20 d,按“2.3”項下方法處理后進(jìn)樣，結(jié)果，本實(shí)驗條件下，血漿樣品中左旋紫草素、乙酰紫草素和β,β′-二甲基丙烯酰紫草素反復(fù)凍融3次仍保持穩(wěn)定,見表2。

表1　精密度試驗

表2　穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5糞便樣品的處理

2.5.1糞便樣品的處理稱取空白大鼠糞便30 mg于離心管中，加入乙酸乙酯200 μL，渦旋混合1 min，10 000 r/min離心10 min，分離上清液，殘渣再次加入上述溶劑200 μL重復(fù)上述操作，萃取3次，合并上清液，用氮?dú)獯蹈?，?0 μL乙腈復(fù)溶，離心1 min，取上清液。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與回收率稱取空白大鼠糞便約40 mg于7個離心管中，分別加入混合對照品系列溶液適量，使各組分的濃度為10～400 μg/mL，混勻后，各加入1 200 μL水勻漿，吸取勻漿100 μL于另一離心管中，加入200 μL乙酸乙酯，渦旋混合5 min，10 000 r/min離心10 min，分離上清液，殘渣再次加入乙酸乙酯200 μL重復(fù)萃取3次，合并上清液，用氮?dú)獯蹈桑?0 μL乙腈復(fù)溶，取上清液，按“2.3”項下色譜條件檢測。結(jié)果，各組分在10～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，左旋紫草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=91.768X+759.666(R2=0.997 6)，乙酰紫草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=383.99X-1 488.3(R2=0.993 7)，β,β′-二甲基丙烯酰紫草素：Y=725.13X-1 536.4(R2=0.993 2)，最低檢測濃度為6 μg/mL。經(jīng)測定左旋紫草素、乙酰紫草素、β,β′-二甲基丙烯酰紫草素的平均提取回收率分別為(78.2±2.5)%、(82.0±2.9)%和(79.5±3.5)%。

2.6大鼠血漿及糞便中3種萘醌類成分的含量測定

2.6.1收集血漿及糞便取正常SD大鼠20只，隨機(jī)分為給藥組和空白對照組，每組10只，同一條件飼養(yǎng)，兩組動物均禁食不禁水12 h。給藥組按0.024 g/kg體質(zhì)量灌胃給予新疆紫草藥提取物0.5% CMC-Na溶液混懸，對照組給予0.5% CMC-Na溶液混懸，分別于給藥前及給藥后15、30 min及1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h 從眼底靜脈取血，分離血漿。同時收集給藥前及給藥后0～12、12～36、36～48、48～72 h的糞便，-20℃冰箱冷凍保存。

2.6.2血漿樣品中藥物含量的測定血漿樣品按“2.4”項下方法處理，按照“2.3”項下色譜條件檢測。結(jié)果大鼠灌胃后0～48 h內(nèi)，血漿樣品中均未檢測到紫草萘醌類成分的特有峰。

2.6.3糞便樣品中藥物含量的測定稱取收集的糞便樣品40 mg，各加入1 200 μL水勻漿，吸取勻漿100 μL于另一離心管中，加入200 μL乙酸乙酯，渦旋混合5 min，10 000 r/min離心10 min，分離上清液，殘渣再次加入乙酸乙酯200 μL重復(fù)萃取3次，合并上清液，用氮?dú)獯蹈桑?0 μL乙腈復(fù)溶，取上清液，按“2.3”項下色譜條件檢測，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組分的濃度。結(jié)果0～12、12～24、24～28 h糞便中左旋紫草素絕對回收量分別為23.61、38.28、4.13 mg；乙酰紫草素分別為7.20、70.78、11.53 mg；β-β′二甲基丙烯酰紫草素分別為46.32、60.15、16.88 mg。

3討論

關(guān)于紫草萘醌類成分的體內(nèi)藥物濃度測定，主要采用單一成分的測定方法。孫東曉等[7]采用衍生化高效液相色譜法研究了靜脈注射乙酰紫草素在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)；李慧義等[8]給予大鼠腹腔注射左旋紫草素，收集到的膽汁和血樣分別經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶水解后，采用RP-HPLC/DAD方法初步考察了紫草素的體內(nèi)分布，初步檢測到大鼠的膽汁和尿樣中分別有10種代謝物。Zhou等[9]采用氧化燃燒爐技術(shù)處理小鼠灌胃給予3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素后的組織、糞樣(尿樣直接加閃爍液測定)，用HPLC法分離后用液閃計數(shù)儀測定其放射性水平，研究了小鼠體內(nèi)的組織分布與排泄情況。結(jié)果顯示，3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素在胃腸道放射性濃度最高，肝臟、肺、腎臟、心臟等組織內(nèi)放射性濃度次之，骨骼肌、脊髓、腦中分布較少。小鼠灌服 3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素后36 h從糞中收集到給藥總放射劑量的72.87%，從尿液中回收到6.81%，糞、尿液中回收到(79.68±0.18)%，血漿中未檢測到原形藥物。說明3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素在小鼠體內(nèi)分布廣，排泄較完全，主要以原形藥物經(jīng)糞便排泄為主，經(jīng)腎排泄為輔。在本研究建立的色譜條件下，給予大鼠灌胃紫草提取物后0～48 h，大鼠血漿和尿液中未檢測到紫草萘醌類成分，而糞便檢測到了紫草萘醌類的3個主要成分，該結(jié)果與田慧芳等[10]報告的結(jié)果基本一致。說明紫草萘醌類成分在體內(nèi)分布廣，與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合呈結(jié)合狀態(tài)，以游離狀態(tài)分布在血液中的量相對較少,結(jié)合態(tài)的萘醌類很快被代謝后經(jīng)糞便排泄。

參考文獻(xiàn):

[1]李國英,買爾旦·馬合木提.紫草在新疆的分布及研究進(jìn)展[J].新疆醫(yī)科大學(xué)報,2009,32(4):386-388.

[2]謝冰芬,馮公侃,黃河,等.天然紫草萘醌類化合物及其衍生物的抗瘤作用研究[J].中國藥理學(xué)通報,2006,22(4):505-507.

[3]徐新剛,王寶珍,孫志蓉,等.新疆紫草的主要化學(xué)成分[J].吉林大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版 )2010,48(2)：319-322.

[4]朱夢媛,王汝冰,周文,等.紫草素及其衍生物抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報,2012,47(5)：588-593.

[5]買爾旦·馬合木提,劉燕,尼加提·熱合木.新疆紫草提取物對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志,2006,31(19)：1646-1649.

[6]米克熱帕·阿布都買買提,買爾旦·馬合木提,古麗仙·胡加,等.新疆紫草止血作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(11)：2889-2590．

[7] 孫東曉,田慧芳,孟志云,等.[3H]-乙酰紫草素在小鼠體內(nèi)的組織分布、排泄及血中分布研究 [J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2008,32 (8):348-352.

[8]李慧義,羅淑榮,周同惠,等.左旋紫草素體內(nèi)代謝研究[J].中國藥學(xué),1999,8(3):148-151.

[9]Zhou JY，Dou GF. Tissue distribution and excretion of radioactivity in mice after intragastric administration of 3H-beta, beta-dimethylacrylshikonin[J]. J Isotopes, 2006,32(3): 45-49.

[10]田慧芳,孫東曉,孟志云,等.小鼠灌胃3H-β,β-二甲基丙烯酰紫草素的組織分布與排泄研究[J].同位素,2008, 21(4):209-214.

(本文編輯施洋)

基金項目：天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗室(北京大學(xué))開放研究課題(20130215)

作者簡介：古力扎努·阿合買提(1989-) ,女(維吾爾族),在讀碩士，研究方向:中藥民族藥基礎(chǔ)研究。 通信作者：買爾旦·馬合木提,男(維吾爾族)，主任藥師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥民族藥開發(fā)；E-mail:maierdan60@sina.com。

中圖分類號：R914

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)08-1012-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.019

[收稿日期：2016-04-05]

Determination of three naphthaquinone concentration from Arnebia euchroma (Royle) Johnst in rats plasma and faeces by HPLC methods

Gulizhanu Ahemaiti1, Maierdan Mahemuti2

(1CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity;2AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a HPLC method for determine of three contents of naphthaquinone from Arnebia euchroma (Royle) Johnst in rats plasma and faeces. MethodsCOSMOIL C18-AR-Ⅱ (4.6 mm×250 mm, 5 μm)， column was used with acetonitrile (A) -0.15% formic acid (B)(v/v)as mobile phase by gradient eluting with the flow rate of 1.0 mL/min for 35 min，and the column temperature was maintained at 25℃, detecting wavelength at 274 nm. ResultsThe linear range in plasma of shikonin, acetylshikonin and β-β, -dimethylacrylshikonin were between 0.40 to 6.40 μg, 25.0 to 600.0 μg and 25.0 to 600.0 μg, respectively. The recoveries of these ingredients correspondingly were between 97.78 to 100.1%, 100.1 to100.2% and 97.78 to100.1%. The RSD of intra-day and inter-day were less than 1.5%. The linear range in faeces of shikonin, acetylshikonin and β-β, -dimethylacrylshikonin were between 10-400 μg/mL with the average recoveries of (78.2±2.5)%, (82.0±2.9)% and (79.5±3.5)%, respectively. Absolute recovery amount of Naphthoquinone in feces as: shikonin 0-12 h：23.61 mg，12-24 h：38.28 mg，24-48 h：4.13 mg； acetylshikonin 0-12 h：7.20 mg，12-24 h：70.78 mg， 24-48 h：11.53 mg and β-β, -dimethylacrylshikonin 0-12 h：46.32 mg， 12-24 h：60.15 mg， 24-48h：16.88 mg. ConclusionThe established method has a good selectivity and reproducibility for the determination of naphthaquinone from Arnebia euchroma (Royle) Johnst in plasma and faeces of rats.

Keywords:Arnebia euchroma (Royle) Johnst; shikonin; acetylshikonin; β-β, -dimethylacrylshikonin; HPLC； rat plasma; rat faece