寧　超， 榮小靈， 杜　靖

(新疆醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院生理學教研室， 烏魯木齊　830011； 2第二附屬醫(yī)院檢驗科， 烏魯木齊　830064；3高職學院機能教研室， 烏魯木齊　830011)

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·民族腫瘤學·

PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在宮頸癌細胞株中的表達及意義

寧超1， 榮小靈2， 杜靖3

(新疆醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院生理學教研室， 烏魯木齊830011；2第二附屬醫(yī)院檢驗科， 烏魯木齊830064；3高職學院機能教研室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的研究體外特定細胞株(C33a、HaCaT及SiHa)中磷酸肌醇3激酶(PI3K)、細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)和雌激素受體(ER)蛋白的表達量，分析各蛋白的表達與HPV16感染致癌的關系。 方法培養(yǎng)C33a、HaCaT及SiHa 3種細胞，采用蛋白免疫印跡(Western blot)技術檢測IGF-1R、PI3K、ERK和ER蛋白在3種細胞株中的表達水平。結果IGF-1R、PI3K和ERK蛋白在SiHa細胞株中的表達高于在C33a、HaCaT細胞株中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在SiHa細胞株中ER的表達低于在C33a細胞株中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在宮頸癌細胞株中呈現(xiàn)不同程度的表達,可能與HPV16感染后宮頸癌變存在一定的關系。

關鍵詞：宮頸癌細胞； PI3K； ERK； IGF-1R； ER

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，且發(fā)病年齡日益年輕化。新疆地區(qū)宮頸癌的發(fā)病率和病死率一直居全國首位，南疆維吾爾族婦女宮頸癌患病率在全國少數(shù)民族中居第1位，被列為新疆特高發(fā)腫瘤之一[1-2]。目前認為人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是導致宮頸癌發(fā)生的主要原因之一。腫瘤的發(fā)生需多因素協(xié)同作用，胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、雌激素受體(ER)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)和細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)可促進細胞增殖、分化、存活、黏附和遷移，參與抗腫瘤細胞凋亡[3-5]，并相互影響。然而PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達與HPV16感染與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展是否存在關聯(lián)少有報道。本研究分別檢測HPV16陰性的子宮頸癌C33a細胞株、永生性人類角質(zhì)細胞HaCaT細胞株中和HPV16陽性的子宮頸癌SiHa細胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達水平，探討4種蛋白的關系，從分子水平為宮頸癌發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器HPV16陰性的子宮頸癌C33a細胞株、永生性人類角質(zhì)細胞HaCaT細胞株和HPV16陽性的子宮頸癌 SiHa細胞株均購自上海細胞庫，兔源ERK(ERK1)抗體(1∶1 000)、兔源IGF-1R抗體(1∶500)、兔源ER(ER-α)抗體(1∶1 000)均購自美國abcam公司，兔源PI3K(PI3Kp85)抗體(1∶600)、β-actin多克隆兔抗(1∶1 000)均購自美國SANTA公司。DMEM培養(yǎng)基、胰酶(Biosharp，中國)，雙抗/青鏈霉素合劑(Gibco，美國)，TBST(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)，5%CO2孵育箱(HeraCell-150，Thermo Fishers公司)，生物安全柜(ThermoKS-18，Thermo Fishers公司)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2方法

1.2.1C33a、HaCaT及SiHa細胞培養(yǎng)配制含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，DMEM全培養(yǎng)基，將細胞置于含5% CO2、37℃條件下進行培養(yǎng)，每隔1～2天更換培養(yǎng)基，當培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞整合度達80%時，采用胰蛋白酶(0.25%)消化方法，按1∶2或1∶3比例傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.2Western blot檢測PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達將C33a、HaCaT及SiHa細胞分別收集到相應的EP管中，提取蛋白并分裝置-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩２捎肂CA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取50 μg蛋白經(jīng)8%SDS-PAGE凝膠分離，4℃電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，TBST洗膜，加入PI3K、ER、ERK和IGF-1R抗體，室溫孵育1 h，轉(zhuǎn)至4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后，加入二抗，室溫避光孵育2 h，顯色液顯色，將PVDF膜上的條帶利用凝膠成像處理系統(tǒng)進行灰度掃描，結果采用Quantity one 凝膠分析軟件進行分析，計算目的蛋白和β-actin的光密度比值，實驗重復3次。

2結果

2.1PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達Western Blot結果PI3K、ERK和IGF-1R蛋白在SiHa細胞株中的表達量高于在C33a及HaCaT細胞株中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與SiHa和HaCaT細胞株比較，ER在C33a細胞株中表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

1：HaCaT細胞株；2：SiHa細胞株；3：C33a細胞株

2.2C33a、HaCaT及SiHa細胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達方差齊性檢驗顯示，F(xiàn)PI3K=3.179，P=0.113；FERK=0.230，P=0.801；FIGF-1R=3.886，P=0.083；FER=0.046，P=0.955，表明方差齊，可用單因素方差分析和LSD-t進行組間比較。PI3K、ERK和IGF-1R蛋白在SiHa細胞株中表達量高于在C33a及HaCaT細胞株中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與SiHa細胞株比較，ER在C33a細胞株中表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1、圖2)。

表1　C33a、HaCaT及SiHa細胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達

注：與C33a細胞株比較，*P<0.05； 與HaCaT細胞株比較，△P<0.05。

注：與C33a細胞株比較，*P<0.05; 與HaCaT細胞株比較，△P<0.05。

圖2C33a、HaCaT及SiHa細胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達

3討論

HPV感染是導致宮頸癌的主要原因之一，機體內(nèi)一系列細胞生長增殖信號表達異常，都有可能引起細胞正常的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控發(fā)生異常改變。本研究通過測定體外特定細胞株中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白的表達量，分析各蛋白與HPV16感染致癌的關系，結果發(fā)現(xiàn)PI3K、ERK和IGF-1R在SiHa細胞株中高表達，與C33a、HaCaT細胞株中表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示4種蛋白不同程度的表達可能與HPV感染后致癌作用有關。PI3K是細胞內(nèi)重要的信號傳導分子，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡與分化等生理過程，多種腫瘤及癌前病變發(fā)現(xiàn)PI3K基因突變是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要特征。ERK和其信號途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起中介和信號放大作用[6]，研究表明ERK信號轉(zhuǎn)導通路參與了Ras基因突變引發(fā)的宮頸癌細胞增殖[7]。IGF-1R已被證實其具有促進細胞有絲分裂、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡的作用，是重要的促腫瘤生長因子，其表達上調(diào)可以促進癌細胞的生長，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[8-9]。人體中最主要的雌激素17β-雌二醇(Estrogen，E2)不僅可以通過調(diào)節(jié)細胞周期和細胞內(nèi)Ca2+離子濃度水平而調(diào)節(jié)宮頸癌Hela細胞的增殖活動[10]，還參與上調(diào)HPVE6、E7基因的表達，在HPV感染的宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化過程中起促進作用，增加宮頸癌發(fā)生風險[11]。

Harris等[12]利用PIK3CA作為探針，通過熒光原位雜交的方法檢測到宮頸癌細胞株C-4I、CaSki和ME-180中PI3K拷貝數(shù)顯著增加，結合本研究結果，提示PI3K通過信號轉(zhuǎn)導途徑能夠協(xié)助HPV16誘發(fā)宮頸腫瘤。ERK信號通路可通過調(diào)節(jié)相關蛋白合成調(diào)控宮頸癌SiHa細胞的行為[13]。當宮頸感染HPV16后，HPV16編碼的蛋白介導ERK信號轉(zhuǎn)導通路，增強正常宮頸上皮的癌變率。近年來，有關IGF家族是否增加HPV病毒的易患性及其在HPV病毒持續(xù)感染中的作用的研究不斷增加。發(fā)現(xiàn)IGF-1基因的調(diào)控可影響正常上皮組織增生、增加HPV感染后致癌的可能性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，癌基因能夠通過提高IGF-1R基因的活性而發(fā)揮致癌作用， IGF-1R基因的高表達成為某些癌基因發(fā)揮致癌作用的先決和必備條件[15]。因此，IGF-1R高表達促進了HPV16感染后子宮頸癌變的概率。由此可以推測，PI3K、ERK和IGF-1R蛋白表達量升高與HPV16感染過程可能存在協(xié)同關系。

張曉波等[16]研究顯示高危型人乳頭瘤病毒(High-Risk HPV、HR-HPV)感染是誘發(fā)宮頸癌的首要啟動因素，ER在HPV感染引起的宮頸癌早期起促進作用。王立群等[17]研究結果顯示，在子宮肌瘤細胞中ER和IGF-1R的表達明顯高于子宮肌層細胞的表達。說明子宮肌瘤的生長與子宮肌瘤組織ER和IGF-1R的表達增強有關。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1R和ER在SiHa細胞株中的表達高于在HaCaT細胞株中的表達(P<0.05)，提示IGF-1R和ER在HPV16感染宮頸癌發(fā)生機制中可能具有協(xié)同作用。IGR-1R活化后通過Ras/MEK/ERK信號通路啟動級聯(lián)系統(tǒng)，不僅刺激細胞增生、分化以及存活，還可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路刺激細胞運動、抗凋亡、促細胞增殖[18]。本實驗結果顯示PI3K、ERK、IGF-1R在SiHa細胞株中高表達，在HaCaT細胞株中低表達(P<0.05)，與上述文獻結果一致，提示PI3K、ERK和IGF-1R蛋白高表達可能促進了HPV16感染后的宮頸細胞癌變。同時本研究觀察到C33a細胞株中ER高表達，而PI3K、ERK、IGF-1R 3種蛋白表達量并不高，提示ER并非是在感染HPV的前提下導致宮頸癌發(fā)生的單一因素，可能是PI3K、ERK、IGF-1R和ER 4種蛋白與HPV的共同作用促使宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

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(本文編輯楊晨晨)

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計劃項目(XJEDU2012I24)

作者簡介：寧超(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：婦科腫瘤。 通信作者：杜靖，女，碩士，副教授，碩士生導師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:598733481@qq.com。

中圖分類號：R737.33

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2016)08-1044-04

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.08.027

[收稿日期：2016-05-16]

The expression of PI3K, ERK, IGF-1R and ER protein in cervical carcinoma cell lines

NING Chao1, RONG Xiaoling2, DU Jing3

(1DepartmentofPreclinicalMedicineCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830064,China;3DepartmentofMedicalPhysiology&Biochemistry,HigherVocationalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of PhosPhoinositide 3 kinase (PI3K), extracellular regulated protein coyness(ERK), Insulin-like Growth Factor 1 Receptor (IGF-1R) and Estrogen receptor (ER) in the specific cervical carcinoma cell lines, and to clarify the relationship between the expression of four proteins and HPV16 in the development of cervical carcinoma. MethodsThe Western blotting was used to detect the substances expression level of IGF-1R, PI3K, ERK and ER proteins in C33a, HaCaT and SiHa. ResultsThe exprssion of IGF-1R, PI3K and ERK in SiHa cell were significantly higher than that in C33a, HaCaT (P<0.05), and the exprssion of ER in the SiHa cell was significantly down-regulated compared with C33a (P<0.05). ConclusionThe differences of protein expression levels in PI3K, ERK , IGF-1R and ER suggested that those maybe associate with the infection of HPV16 in the occurrence of cervical cancer.

Keywords：cervical cancer cells; PI3K; ERK; IGF-1R; ER