唐瑜蓉，羅定強(qiáng)，劉　越，劉海靜*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽　712046；2.陜西省食品藥品檢驗所，西安　710065)

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太白蓼中酚酸類成分的UPLC/Q-TOF-MS研究

唐瑜蓉1，羅定強(qiáng)2，劉越2，劉海靜2*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽712046；2.陜西省食品藥品檢驗所，西安710065)

摘要：目的建立太白蓼(Polygonum taipaishanense Kung)酚酸類化學(xué)成分的超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)的分析方法。方法采用UPLC-Q-TOF-MS法分析，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相為1 mL·L-1冰醋酸(A)-乙腈(B)梯度洗脫；進(jìn)樣量為2 μL；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃。飛行時間質(zhì)譜采用負(fù)離子模式，掃描范圍為100～1 100；Fragmentor 130 V ；Drying Gas 10 L· min-1；Nebuilzer 45 psi；Gas Temp 350 ℃；Skimmer 45 V。結(jié)果鑒定了太白蓼中13個成分，其中4個成分通過對照品比對確認(rèn)。結(jié)論建立了UPLC/Q-TOF-MS方法對太白蓼中化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，為太白蓼的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)建立奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：酚酸類成分；太白蓼；超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜

太白蓼為蓼科植物太白蓼PolygonumtaipaishanenseKung的干燥根莖，又名大紅粉[1]，《中華本草》將太白蓼作為蝎子七的多基源品種之一收錄其中。太白蓼產(chǎn)于陜西眉縣和太白縣及青海、四川、云南等地[2-3]。梁波等[4]在對太白蓼中13種揮發(fā)油成分進(jìn)行鑒定的同時，測定了其抗菌活性，并在太白蓼中分離得到8個單體化合物，分別為β-谷甾醇、5-粘霉烯-3-酮、大黃素、3′4′，5，7-四甲氧基黃酮、表兒茶素、兒茶素、沒食子表兒茶素和綠原酸。對太白蓼的化學(xué)成分研究報道較少，作者采用UPLC-Q-TOF-MS快速鑒定分析了太白蓼中的酚酸類化合物，為進(jìn)一步研究太白蓼的化學(xué)成分提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器超高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1290 Lnfinity)；超高效分辨率的精確質(zhì)量四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀(Agilent 6540 Q-TOF)；Mass Hunter及Qualitative Analysis工作站。Mass Hunter PCDL Manager數(shù)據(jù)庫軟件。

1.2試藥太白蓼藥材采自陜西秦嶺山，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗所羅定強(qiáng)副主任藥師鑒定為蓼科植物太白蓼(PolygonumtaipaishanenseKung)的根莖。對照品：綠原酸(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-201314，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.6%)；檸檬酸(中國藥品生物制品檢定所，批號111679-200401)；沒食子酸(中國藥品生物制品檢定所，批號110831-201204)；表兒茶素(中國藥品生物制品檢定所，批號878-200102)；甲醇、乙腈為色譜純;水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備取太白蓼粗粉0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，冷卻，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，濾過，棄去初濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2對照品溶液的制備取綠原酸、沒食子酸、表兒茶素和檸檬酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。

2.3色譜條件Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)。流動相：1 mL·L-1冰醋酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～2 min，5% B；2～10 min，30% B；10～20 min，95% B；20～22 min，95% B；22～22.1 min，5% B；22.1～30 min，5% B。流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.4質(zhì)譜條件采用負(fù)離子模式；電子噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式，F(xiàn)ragmentor 130 V；Drying gas 10 L·min-1；Nebuilzer 45 psi；Gas temp erature 350 ℃；Skimmer 45 V；OCT IRE VPP 750 V；scan range 100～1 100；Acquisition rate/time 2 s-1。

2.5成分的鑒定太白蓼樣品在2.3及2.4色譜條件及質(zhì)譜條件下分析得太白蓼的UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖，見圖1。化合物的鑒定方法：首先，根據(jù)飛行時間質(zhì)譜測得的總離子流色譜峰上所得到的精確相對分子質(zhì)量，應(yīng)用Qualitative Analysis分析軟件計算可能的分子組成(誤差<5 ppm)，并結(jié)合Mass Hunter PCDL Manager數(shù)據(jù)庫比對，對各化合物進(jìn)行初步鑒定。其次，選擇合適的分子離子峰通過二級質(zhì)譜的裂解，獲得各個成分峰的二級質(zhì)譜碎片信息，根據(jù)離子的裂解情況并結(jié)合對照品比對和太白蓼的化學(xué)成分的文獻(xiàn)報道進(jìn)一步確認(rèn)推測，共鑒定了太白蓼中的13個成分，見表1。

圖1太白蓼的總離子流圖

Fig.1 UPLC/Q-TOF-MS chromatogram ofPolygonumtaipaishanenseKung

峰2和峰3 TOF-MS均給出分子離子峰191.020 2，Qualitative Analysis工作站計算其分子式為C15H14O7，與Mass Hunter PCDL Manager中藥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，初步推測為檸檬酸。再根據(jù)TOF-MS二級碎片離子信息m/z111.008 6，經(jīng)與對照品比對，確定為檸檬酸。

峰9分子離子峰m/z值為 289.072 1，由質(zhì)譜軟件計算精確分子式為C15H14O6，與中藥數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，與表兒茶素相對分子質(zhì)量一致，故初步鑒定為表兒茶素[5-6]。經(jīng)過TOF-MS二級碎片離子信息m/z125.045 1，245.082 4和203.071 2，與對照品比對一致，確定為表兒茶素。

峰11的鑒定方法為：根據(jù)總離子流圖色譜峰中所得的精確化合物的相對分子質(zhì)量353.087 6，通過Qualitative Analysis工作站計算其精確分子式為C16H18O9，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)比對，初步鑒定了該化合物[7-11]。進(jìn)而選擇該母離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，通過二級質(zhì)譜裂解，獲得化合物相應(yīng)的離子碎片191.056 2、161.024 5，并且其色譜保留時間、分子離子峰和二級質(zhì)譜碎片與綠原酸對照品完全一致，根據(jù)離子的裂解情況并結(jié)合文獻(xiàn)推測，故鑒定該化合物為綠原酸[11-14]。

表1太白蓼UPLC-Q-TOF-MS化學(xué)成分的鑒定分析結(jié)果

Tab.1 Results of qualitative analysis of chemical constituents inPolygonumtaipaishanenseKung

峰號tR/min實測值m/z理論值m/z分子式離子碎片鑒定化合物名稱11.192195.0510195.0510C6H12O7113.0238gluconicacid(葡萄糖酸)a21.308191.0202191.0197C6H8O7111.0086citricacid(檸檬酸/枸櫞酸)ab31.640191.0202191.0197C6H8O7111.0086citricacid(檸檬酸/枸櫞酸)ab42.579169.0147169.0142C7H6O5125.0242gallicacid(沒食子酸)ab52.720331.0671391.0671C13H16O10271.0463,211.0249,169.0143galloyl-glucose(1-單寧酸苷)a66.142577.1341577.1351C30H26O12125.0242,289.0715,407.0765apigenin-7-O-(6"-(E)-p-coumaroyl)-beta-D-galactopyranosidea76.375483.0770438.0780C20H20O14169.0139,211.0240,271.0448,313.0583,241.03581,6-Di-O-galloyl-glucosea86.491191.0566191.0561C6H10O4686.7723methylglutarate(戊二酸氫甲酯)a96.815289.0721289.0718C15H14O6125.0451、245.0824、203.0712(-)-epicatechin(表兒茶素)ab106.906465.1028465.1038C21H22O12191.0557,353.0857,112.9859,429.0028plantagoside(車前子苷)a117.438353.0876353.0878C16H18O9191.0559,161.0245chlorogenicacid(綠原酸)ab127.762729.1452729.1461C37H30O16125.0239,169.0157,289.0714,407.0754,577.1330procyanidinB5,3'-O-gallate(原花青素)a1310.644435.1291435.1297C21H24O10licoagrosideF(次果甘草苷F)a

注：a. Identificated from mass data；b. Confirmed by comparison with reference standards.

3討論

太白蓼根莖呈扁圓柱形，稍彎曲，長3～5 cm，直徑0.5～3.0 cm，外表粗糙，呈灰褐色至黑褐色，環(huán)節(jié)較明顯，有橫皺紋，常殘留褐色細(xì)小須根；質(zhì)地堅硬，脆而易折斷；味澀、微苦，性平。秦巴山區(qū)民間用太白蓼治療痢疾、腹瀉、腸風(fēng)下血、崩漏、白帶、吐血、外傷出血等病癥[12-14]。

采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)法進(jìn)行定性分析，通過分析質(zhì)譜碎片、相對分子質(zhì)量、參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及與對照品比對，推測并鑒定了太白蓼中的13種化學(xué)成分，其中4個二級質(zhì)譜與對照品比對，結(jié)果顯示，其二級質(zhì)譜碎片信息完全一致。秦嶺七藥資源豐富，約122種，其基源植物分屬46科92屬，以蓼科、毛茛科、菊科、百合科等來源的植物較多[15-16]。隨著研究的不斷深入，秦嶺七藥的一藥多源等現(xiàn)象較為普遍，本研究為太白蓼成分定性提供了快速高效的方法，為快捷準(zhǔn)確地鑒別及評價太白蓼的藥材質(zhì)量提供參考。

實驗考察了超聲提取和加熱回流提取方法對化合物提取效率的影響，結(jié)果表明，超聲提取法操作簡便，提取效率高，對遇熱易分解的化合物影響較小?？疾炝瞬煌崛∪軇?水、甲醇、乙醇和體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇)對提取效率的影響，最終確定樣品的制備方法。

通過色譜條件的優(yōu)化，考察了1 mL·L-1的冰醋酸-乙腈、1 mL·L-1的甲酸-乙腈、1 mL·L-1的冰醋酸-甲醇和1 mL·L-1的甲酸4種不同種類的流動相系統(tǒng)對太白蓼的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 mL·L-1冰醋酸-乙腈峰分離度及質(zhì)譜響應(yīng)較好，最終選擇1 mL·L-1冰醋酸-乙腈為流動相系統(tǒng)。

本實驗比較了正離子模式和負(fù)離子模式下的峰響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下峰響應(yīng)優(yōu)于正離子模式，同時文獻(xiàn)報道負(fù)離子模式下酚酸類化合物的質(zhì)譜解析，方便二級質(zhì)譜的文獻(xiàn)比對。實驗考察了Fragmentor、Nebuilzer、Gas temp、Skimmer、OCT IRE VPP等參數(shù)，進(jìn)行了優(yōu)化。最終建立了太白蓼HPLC-Q-TOF-MS方法，為太白蓼藥材及制劑的質(zhì)量控制和進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

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基金項目：陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(編號:2013KTCQ03-14)

作者簡介：唐瑜蓉，女，在讀碩士研究生

*通信作者：劉海靜，女，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.006

中圖分類號：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)04-0347-04

(收稿日期：2015-09-07)

Study on phenolic compounds in Polygonum taipaishanense Kung by UPLC-Q-TOF-MS

TANG Yurong1，LUO Dingqiang2，LIU Yue2，LIU Haijing2*

(1.Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine，Xianyang 712046，China；2.Shaanxi Institute for Food and Drug Control，Xi′an 710061，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the analysis of phenolic compounds in Polygonum taipaishanense Kung by UPLC-Q-TOF-MS. MethodsThe method was performed on an Agilent Eclipse Plus C18column (150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，and the mobile phase consisted of 1 mL·L-1acetic acid aqueous solution and acetonitrile with gradient elution program.The injection volume was 2 μL at a flow rate of 0.3 mL·min-1.The column tempetature was 30 ℃.Compound identification was performed by UPLC-Q-TOF-MS in a negative ionization mode.The identitication conditions were as follows:sheath gas flow was 10 L·min-1；Gas temp erature was 350 ℃； Fragmentor was 130 V； Nebuilzer was 45 psi； Skimmer was 45 V；Scan range was 100-1 100；Acquisition rate time was 2 s-1. Results The main peaks were separated clearly and respectively in 30 min，and 13 compounds were identified.ConclusionThe established method for the determination of the chemical constituents in Polygonum taipaishanense Kung is simple，rapid，and reliable，and paves a way for the quality control and further study.

Key words:phenolic compounds;Polygonum taipaishanense Kung；UPLC-Q-TOF-MS