康阿龍，王衛(wèi)峰，湯迎爽

(1.解放軍第四五一醫(yī)院，西安　710054；2.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，西安　710003；3.解放軍第三二三醫(yī)院，西安　710054)

Study on the quality control method for Jingzhuikang Plaster based on hot-melt pressure sensitive adhesives

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頸椎康熱融壓敏膠貼質(zhì)量控制研究

康阿龍1，王衛(wèi)峰2，湯迎爽3*

(1.解放軍第四五一醫(yī)院，西安710054；2.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，西安710003；3.解放軍第三二三醫(yī)院，西安710054)

摘要：目的 建立頸椎康熱融壓敏膠貼的質(zhì)量檢測(cè)方法。方法 采用專屬性薄層色譜法鑒定方中4味主藥；高效液相色譜法檢測(cè)該藥中的主要指標(biāo)成分葛根素含量。色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(25∶75)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：室溫。結(jié)果 薄層鑒別斑點(diǎn)清晰，分離效果良好，空白無干擾；葛根素含量在0.101 6～1.101 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系符合要求(r=0.999 7)，方法加樣回收率為100.4%，RSD為2.17%(n=6)。結(jié)論 經(jīng)研究建立的方法，可作為該藥的質(zhì)量檢測(cè)手段。

關(guān)鍵詞：葛根素；頸椎康熱融壓敏膠貼；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； HPLC；TLC

Study on the quality control method for Jingzhuikang Plaster based on hot-melt pressure sensitive adhesives

頸椎病是以頸椎退行性改變?yōu)榛A(chǔ)的一種臨床常見病、多發(fā)病[1]，近年來，有逐年增多和年輕化的趨勢(shì)[2]，頸椎康貼作為傳統(tǒng)膏藥在民間習(xí)用多年，我們應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)[3-4]，將其研制成一種以SIS為骨架材料的熱熔壓敏膠貼。該方由葛根、肉桂、杜仲、當(dāng)歸、山茱萸、花椒等11味中藥組成，具有溫里散寒、散風(fēng)止痛的功效，用于治療風(fēng)濕瘀阻所致頸椎疼痛、頸項(xiàng)僵硬、肩背酸痛、頭暈等癥狀，療效確切。為控制其質(zhì)量，按照藥品注冊(cè)要求，本文建立了4味主藥的薄層鑒別方法，色譜斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾；建立的HPLC法檢測(cè)指標(biāo)成分葛根素含量，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(2690型泵，996型PDA紫外可見檢測(cè)器，VP化學(xué)工作站，Waters 公司)。電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司，型號(hào)：BT25S，d=0.01 mg；BS210S,d=0.1 mg)。

1.2試藥葛根素對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)100752-200912)，杜仲對(duì)照藥材(TLC用，批號(hào)121202-201103)，當(dāng)歸對(duì)照藥材(TLC用，批號(hào)120927-201315)，熊果酸對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)110742-201421)，山茱萸對(duì)照藥材(TLC用，批號(hào)121495-201303)，葛根對(duì)照藥材(TLC用，批號(hào)121551-201103)，均購自中國食品藥品檢定研究院；頸椎康貼(規(guī)格：每貼2 g，陜西安和醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130308，20131201，20131209)。HPLC測(cè)定試劑為色譜純；其他提取處理試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別2.1.1杜仲的薄層鑒別 取本品2貼，揭去背襯，剪碎，置于具塞錐形瓶中，加無水乙醇50 mL，放置30 min，超聲提取30 min，濾過并濃縮至約2 mL，即為供試品溶液。另取杜仲對(duì)照樣品1 g，采用與供試品相同的方法處理，得對(duì)照藥材溶液，再按照處方比例稱取所有藥材(除去杜仲)，按照樣品制備方法制得空白樣品，按照供試品溶液制備過程處理得到空白對(duì)照溶液。依照現(xiàn)行版《中國藥典》TLC實(shí)驗(yàn)法，分別吸取供試品溶液、空白對(duì)照溶液各10 μL和對(duì)照藥材溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一含CMCNa的硅膠G板上，展開劑：正己烷-乙酸乙酯(9∶2)，取出晾干后，在紫外光燈(365 nm)下觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材相應(yīng)位置，顯一致的熒光斑點(diǎn)，空白對(duì)照溶液未顯相同斑點(diǎn)，說明空白不存在干擾。見圖1。

圖1 杜仲TLC圖

1.杜仲藥材；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照

Fig.1 TLC ofEucommiaecortex

1.Eucommiaecortex；2-4.test sample；5.negative control

2.1.2當(dāng)歸的薄層鑒別 取本品2貼，揭去背襯，剪碎，置于錐形瓶中，加乙醚40 mL，靜置30 min，超聲處理10 min，離心，上清液自然揮干，殘留物用1 mL乙醇溶解，即為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材樣品1 g，采用與供試品相同的方法處理，得對(duì)照藥材液，再按處方比例稱取所有藥材(除當(dāng)歸)，按照樣品制備方法制得空白樣品，繼續(xù)按照供試品溶液制備過程處理得空白對(duì)照溶液。依照現(xiàn)行版《中國藥典》TLC實(shí)驗(yàn)法，分別吸取供試品溶液、空白對(duì)照溶液各10 μL和對(duì)照藥材溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一含CMCNa的硅膠G板上，展開劑-正己烷-乙酸乙酯(4∶1)，取出晾干后，在紫外光燈(365 nm)下觀察。供試品色譜在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置，顯一致的熒光斑點(diǎn)，空白對(duì)照溶液未顯相同斑點(diǎn)，說明空白不存在干擾。見圖2。

圖2 當(dāng)歸TLC圖

1.當(dāng)歸藥材；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照

Fig.2 TLC ofAngelicaesinensisradix1.Angelicaesinensisradix；2-4.test sample；5.negative control

2.1.3山茱萸的薄層鑒別 取本品2貼，揭去背襯，剪碎，置于錐形瓶中，加乙酸乙酯20 mL，靜置30 min，超聲提取15 min，濾過并蒸干，殘留物用1 mL無水乙醇溶解，即得供試液。將熊果酸對(duì)照品用無水乙醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液；取山茱萸對(duì)照藥材1 g，采用與供試品相同方法處理，得對(duì)照藥材溶液；再取除山茱萸外處方其余所有藥材，按照樣品制備方法制得陰性樣品，再按照供試品處理方法制得空白對(duì)照溶液。依照現(xiàn)行版《中國藥典》TLC實(shí)驗(yàn)法，吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 μL和供試品溶液及空白對(duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一含CMCNa的硅膠G板上，展開劑：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶2.5∶0.5)，取出晾干后，噴適量體積分?jǐn)?shù)為10%的硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色。供試品色譜圖中，與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)位置，顯示一致的斑點(diǎn)，空白對(duì)照液未顯相同斑點(diǎn)，說明空白不存在干擾。見圖3。

圖3 山茱萸TLC圖

1.熊果酸對(duì)照液；2.山茱萸對(duì)照藥材液；3～5.供試液；6.空白對(duì)照液

Fig.3 TLC ofCornifructus1.malol control；2.Cornifructus；3-5.test sample；6.negative control

2.1.4葛根的薄層鑒別 取本品2貼，揭去背襯，剪碎，置于三角瓶中，加入30 mL乙酸乙酯，放置30 min，超聲提取20 min，濾過并蒸干，殘留物用1 mL甲醇溶解，即得供試品溶液。采用與供試品相同的方法處理制得對(duì)照藥材溶液，將適量葛根素用適量甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，再按處方比例稱取所有藥材(除去葛根)，按樣品制備方法制得空白樣品，再按供試液制備過程制成空白對(duì)照溶液。依照現(xiàn)行版《中國藥典》TLC實(shí)驗(yàn)法，分別吸取對(duì)照品溶液2 μL、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液及空白對(duì)照溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一含CMCNa的硅膠G板上，展開劑：氯仿-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)，取出晾干后，用氨蒸汽熏蒸30 min，揮去氨氣，在紫外光燈(365 nm)下觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相同位置，顯示一致的熒光斑點(diǎn)，而空白對(duì)照溶液未顯相同斑點(diǎn)，說明空白不存在干擾。見圖4。

圖4 葛根TLC圖

1.葛根素對(duì)照品液；2.葛根對(duì)照藥材液；3～5.供試液；6.空白對(duì)照液

Fig.4 TLC ofPuerariaeradix1.puerarin control；2.Puerariaeradix；3-5.test sample；6.negative control

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(25∶75)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。 以葛根素色譜峰計(jì)算，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于4 000。

2.2.2實(shí)驗(yàn)用溶液的制備(1)對(duì)照品溶液：精密稱取葛根素對(duì)照品12.7 mg，置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。(2)供試品溶液：取本品，揭去背襯，剪碎，取4 g，精密稱定，放入具塞錐形瓶中，精密吸取體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液50 mL加入，密塞，精密稱定，回流提取30 min，冷卻后，再次精密稱定，減失質(zhì)量用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇補(bǔ)足，混勻，量取適量提取液，以4 000 r·min-1離心處理5 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。(3)陰性對(duì)照溶液：取除葛根外處方中其余所有藥材，按照樣品制備方法制得葛根空白試樣，再以供試品溶液制備過程制成葛根陰性對(duì)照液。

2.2.3系統(tǒng)適用性及干擾性實(shí)驗(yàn) 精密抽取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，按照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，頸椎康熱融壓敏貼供試液色譜與葛根素對(duì)照液色譜峰在相同位置有相應(yīng)的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)位置無吸收峰，表明陰性無干擾，葛根素保留時(shí)間約為28 min，分離度大于1.5，結(jié)果見圖5。

圖5 頸椎貼HPLC圖

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；1.葛根素

Fig.5 HPLC chromatograms of Jingzhuikang Plaster

A.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.puerarin

2.2.4線性關(guān)系考察 精密稱取葛根素對(duì)照品12.7 mg，置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇至刻度，搖勻，再精密量取1.0 mL上述溶液，置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液至刻度，混勻，制得含葛根素0.050 8 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液；分別精密吸取2，4，8，12，16和20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，并以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=6 511 614.25X-71 358.54，r=0.999 7，線性范圍為0.101 6～1.101 6 μg。

2.2.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密抽取葛根素對(duì)照品溶液10 μL，依次進(jìn)樣6次，分別測(cè)得葛根素的峰面積。結(jié)果RSD為0.97%，儀器精密度符合規(guī)定。

2.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將同一批號(hào)(20130308)供試品溶液，放置0，2，4，6，8和10 h，在不同時(shí)間各抽取10 μL，進(jìn)樣，注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，結(jié)果RSD為0.79%，在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)(20130308)樣品6份，揭去背襯，剪碎，每份樣品4.0 g，精密稱定質(zhì)量，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液50 mL，密塞，精密稱定，回流提取30 min，放冷，再精密稱定，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量，混勻，抽取適量提取液，以4 000 r·min-1離心5 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定葛根素含量，結(jié)果平均含量為0.462 0 mg·g-1，RSD為0.95%(n=6)，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取葛根素對(duì)照品10.16 mg，置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液至刻度，搖勻，配制成1 mL含葛根素0.406 4 mg 的對(duì)照品溶液。另精密稱取已知含量(0.462 mg·g-1)的樣品共6份，每份約2 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.406 4 mg·mL-1的葛根素對(duì)照品溶液2.5 mL，以供試品溶液制備過程制得加樣回收供試品溶液，分別精密抽取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，葛根素平均回收率為100.4%，RSD為2.17%。

表1葛根素回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of phenol recovery tests

(n=6)

2.2.9樣品測(cè)定 分別精密稱取3批中試樣品4 g，按照2.2.6項(xiàng)下制備過程制備供試品液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果批號(hào)20130308，20131201和20131209的3批貼劑中葛根素含量分別為：0.460，0.475和0.468 mg·g-1。2.2.10含量限度 根據(jù)3批中試樣品中葛根素含量，結(jié)合藥材的含量限度[5]，制備過程的轉(zhuǎn)移率，確定其限度為含葛根以葛根素(C21H20O9)計(jì)不得少于0.3 mg·g-1。

3討論

該制劑屬外用貼膏劑，賦型劑為壓敏膠，參考文獻(xiàn)[6]選用硅藻土分散除膠，但效果不理想，后采用不加硅藻土，直接剪碎，用有機(jī)溶劑浸泡，再經(jīng)超聲或加熱回流即可提取出指標(biāo)成分，且膠質(zhì)未被提出，對(duì)樣品鑒別或測(cè)定沒有影響。

杜仲主要含木脂素類、萜類、黃酮類、酚酸類成分[7]，現(xiàn)行藥典中沒有收載杜仲的TLC法，文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]的鑒別方法主要以京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷等木脂素成分為對(duì)照，操作復(fù)雜，色譜效果不佳，本文建立的鑒別方法，以杜仲對(duì)照藥材為對(duì)照，主要提取其萜類等脂溶性成分，操作簡(jiǎn)便，色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好，可為其他含杜仲制劑的鑒別提供參考。

葛根素含量及限度標(biāo)準(zhǔn)存在一定差異[10-13]，現(xiàn)行版藥典中葛根藥材含量限度規(guī)定為不少于2.4%，葛根芩連丸中葛根素含量限度為4.5 mg·g-1，經(jīng)計(jì)算，其限度僅為理論值(1 000÷300×2.4%=79.92 mg·g-1)的5.6%，無法發(fā)揮控制其質(zhì)量的作用，有必要對(duì)其提取轉(zhuǎn)移率進(jìn)行研究。而梗心舒膠囊中葛根素限度卻定得太高[14]，實(shí)際值為61.4 mg·粒-1，限度定為不少于60 mg·粒-1，實(shí)際生產(chǎn)樣品很難合格。合理的含量限度的確定，需參考藥材提取或粉碎過程中的實(shí)際轉(zhuǎn)移率[15]，還需考慮實(shí)際樣品所測(cè)成分的穩(wěn)定性，本文綜合考慮了兩方面因素，一是3批樣品實(shí)測(cè)平均值0.468 mg·g-1，二是工藝研究中葛根素在粉碎提取等加工過程中的轉(zhuǎn)移率(84%)。計(jì)算：0.015 g×1 000×0.024×0.83=0.302 4 mg·g-1，暫定限度為不少于0.30 mg·g-1。是實(shí)測(cè)結(jié)果的64.1%(0.30 mg·g-1÷0.468 mg·g-1×100%=64.1%)，與實(shí)測(cè)結(jié)果相符，可有效控制其質(zhì)量。

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作者簡(jiǎn)介：康阿龍，男，主任藥師

*通信作者：湯迎爽，女，副主任藥師

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.010

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)04-0360-04

(收稿日期：2015-09-15)

KANG Along1，WANG Weifeng2，TANG Yingshuang3*

(1.The Hospital 451 of PLA， Xi′an 710054，China；2.Institute of Chinese Medicine，Shaanxi Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine，Xi′an 710003，China；3.The Hospital 323 of PLA，Xi′an 710054，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a quality standard for Jingzhuikang Plasterbased on hot-melt pressure sensitive adhesives. MethodsEucommiae cortex，Angelicae sinensis radix，Corni fructus and puerariae radix were identified by TLC. The content of puerarin in Jingzhuikang Plaster was determined by HPLC.Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column was used.The mobile phase consisted of methanol-water(25∶75) at normal flow rate.The detection wavelength was set at 250 nm. ResultsThe spots in TLC were clear.Puerarin showed a good linear relationship within the range of 0.101 6-1.101 6 μg(r=0.999 7).The average recovery was 100.4%，and the RSD was 2.17%(n=6). ConclusionThe established methods can be used for Jingzhuikang Plaster quality control.

Key words:puerarin；Jingzhuikang Plaster based on hot-melt pressure sensitive adhesives；quality control； HPLC；TLC