傳娟娟，張寶陽(yáng)

(陜西省延安市藥品檢驗(yàn)所，延安　716000)

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HPLC法同時(shí)測(cè)定貫葉金絲桃中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量

傳娟娟，張寶陽(yáng)

(陜西省延安市藥品檢驗(yàn)所，延安716000)

摘要：目的建立貫葉金絲桃原藥中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量測(cè)定方法。方法樣品經(jīng)丙酮超聲波輔助提取，采用Diamonsil?C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)分離測(cè)定；以A相乙腈-甲醇-甲酸(89.8∶10∶0.2)，B相水-甲醇-甲酸(79.8∶20∶0.2)為流動(dòng)相梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；流速為1.0 mL·min-1。結(jié)果蘆丁的進(jìn)樣量在0.454～4.540 μg范圍內(nèi)(r=0.999 7)，金絲桃苷的進(jìn)樣量在0.480～4.800 μg范圍內(nèi)(r=0.999 2)，槲皮素的進(jìn)樣量在0.794～7.940 μg范圍內(nèi)(r=0.999 5)，都與峰面積線性關(guān)系良好。加樣回收率分別為99.01%，96.04%和95.97%(n=6)。結(jié)論該方法快捷、簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為貫葉金絲桃原藥中有效成分的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：貫葉金絲桃；蘆丁；金絲桃苷；槲皮素；高效液相色譜法

貫葉金絲桃是藤黃科金絲桃屬多年生草本植物HypreicumperforatumL.，其藥用部位為干燥地上部分[1]；主要產(chǎn)地有四川、貴州、陜西、甘肅和湖南[2]。貫葉金絲桃有清熱解毒、抗菌消炎、消腫止血和利濕止痛等功效[3]。目前，用貫葉金絲桃提取物制成的制劑已在歐美大量上市，廣泛用于治療輕、中度抑郁，未發(fā)現(xiàn)有明顯的不良反應(yīng)，被譽(yù)為天然氟西汀[4]。其開(kāi)發(fā)應(yīng)用在國(guó)際上引起了廣泛的關(guān)注，成為近年來(lái)世界暢銷的草藥之一。

我國(guó)對(duì)于貫葉金絲桃的研究利用目前僅限于獸藥和提取物(金絲桃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.3%)出口。貫葉金絲桃中金絲桃素含量較低，不易測(cè)定。為了更加有效地開(kāi)發(fā)貫葉金絲桃，更好地反映貫葉金絲桃藥材質(zhì)量，本文用HPLC法對(duì)貫葉金絲桃中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素進(jìn)行含量測(cè)定，建立了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters高效液相色譜儀(1525檢測(cè)泵，2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，Empower 色譜工作站)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52 AAA，溫州奧利生物醫(yī)學(xué)儀器廠)；電子天平(BS224S，北京賽多利斯儀器有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，TEDIA)；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.2試藥金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)111521-200303，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)；蘆丁、槲皮素對(duì)照品(由陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院李楠老師提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98%和95.38%)；植物樣品為市購(gòu)，產(chǎn)地為甘肅武都，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳彥生研究員鑒定為貫葉金絲桃。

2方法

2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil?C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。A相為乙腈-甲醇-甲酸(89.8∶10∶0.2)，B相為水-甲醇-甲酸(79.8∶20∶0.2)。梯度洗脫，0～5 min時(shí)A相10%，5～15 min時(shí)A相10%→40%；15～40 min時(shí)A相40%→90%；40～50 min時(shí)A相90%→100%；50～65 min時(shí)A相100%；65～66 min時(shí)A相100%→10%。檢測(cè)時(shí)間：66 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。理論塔板數(shù)按照金絲桃苷峰計(jì)算不低于3 000，金絲桃苷和蘆丁峰分離度大于1.5。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品蘆丁6.0 mg，金絲桃苷5.8 mg和槲皮素10.4 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇適量超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，用針孔濾膜(0.45 μm) 濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。2.3供試品溶液的制備

2.3.1原藥材供試品溶液的制備取貫葉金絲桃藥材，粉碎，過(guò)60目篩，精密稱取2.0 g，加80 mL丙酮超聲提取，超聲功率為200 W，超聲3次，每次40 min，將所得溶液過(guò)濾，濾液濃縮至干，殘?jiān)眠m量色譜甲醇溶解，定容至10 mL的棕色量瓶，用針孔濾膜(0.45 μm) 濾過(guò)，取續(xù)濾液，即為原藥材供試品溶液[5]。2.3.2原藥材不同部位供試品溶液的制備將貫葉金絲桃藥材的莖、葉和花分別粉碎，過(guò)60目篩，各精密稱取2.0 g，操作同2.3.1項(xiàng)下方法，即得莖、葉和花的供試品溶液[6]。

2.4線性關(guān)系考察分別精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2，4，6，10和20 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件對(duì)蘆丁、金絲桃苷和槲皮素進(jìn)行測(cè)定，分別以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X，峰面積值(A)為縱坐標(biāo)Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出回歸方程：Y蘆丁=1 618 251.587X+421 577.874，r=0.999 7，線性范圍：0.454～4.540 μg；Y金絲桃苷=3 253 070.587X+881 160.496，r=0.999 2，線性范圍：0.480～4.800 μg；Y槲皮素=2 317 307.235X+260 005.032，r=0.999 5，線性范圍：0.794～7.940 μg。其對(duì)照品的色譜圖見(jiàn)圖1。2.5精密度實(shí)驗(yàn)取2.3.1項(xiàng)下供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定蘆丁、金絲桃苷及槲皮素的峰面積，分別計(jì)算其RSD值為1.26%，1.31%和1.17%(n=6)，表明符合要求。2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取甘肅武都貫葉金絲桃藥材粉末，按照2.3.1項(xiàng)下方法平行制備原藥材供試品溶液5份，每份進(jìn)樣20 μL，測(cè)定蘆丁、金絲桃苷及槲皮素的峰面積，分別計(jì)算其RSD值為1.59%，1.94%和1.46%(n=5)，表明該方法重復(fù)性良好。

圖1對(duì)照品的色譜圖

1.蘆丁；2.金絲桃苷；3.槲皮素

Fig.1 The chromatogram of reference substance

1.rutin；2.hyperoside；3.quercetin

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取甘肅武都貫葉金絲桃藥材粉末，按照2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，置于棕色量瓶中，室溫放置，在0，2，4，8，12和24 h分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定蘆丁、金絲桃苷及槲皮素的峰面積，分別計(jì)算其RSD值為2.04%，2.36%和2.15%，結(jié)果表明供試品溶液中蘆丁、金絲桃苷及槲皮素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取6份甘肅武都貫葉金絲桃粉末各1.0 g，加入質(zhì)量濃度分別為0.203,0.232和0.416 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品、金絲桃苷對(duì)照品和槲皮素對(duì)照品適量，依照供試品溶液的方法制備并依法測(cè)定，計(jì)算回收率，所得蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的平均回收率分別為99.01%，96.04%和95.97%，RSD值分別為1.07%，1.24%和1.59%(n=6)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1回收率結(jié)果

Tab.1 Results of recovery tests

(n=6)

2.9含量測(cè)定按照2.1項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定2.2和2.3項(xiàng)下的待測(cè)溶液，所得樣品色譜圖見(jiàn)圖2。根據(jù)色譜圖的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

從含量測(cè)定結(jié)果可知，蘆丁在葉中的含量最高，金絲桃苷在花和葉中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莖中的含量，槲皮素在花中含量最高，葉次之，故應(yīng)在花期采收地上部分；藥材質(zhì)量以花、葉多者為優(yōu)。

表2樣品測(cè)定結(jié)果

Tab.2 The determination results of samples

樣品蘆丁含量/mg·g-1金絲桃苷含量/mg·g-1槲皮素含量/mg·g-1全草0.3520.6450.503莖0.3840.5610.267葉0.8561.1751.105花0.2911.1831.628

圖2HPLC圖

A.全草； B.莖； C.葉； D.花； 1.蘆丁； 2.金絲桃苷； 3.槲皮素

Fig.2 HPLC chromatograms

A.herb；B.stem；C.leaf；D.flower；1.rutin； 2.hyperoside； 3.quercetin

3討論

色譜條件的研究：參考張俊松等[7]所用的甲醇-0.006 mol·L-1磷酸氫二鈉緩沖鹽(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為6.5)梯度洗脫和鄭清明等[8]所用的流動(dòng)相：A相為水-乙腈-磷酸(80∶19∶1)，B相為甲醇-乙腈-磷酸(40∶59∶1)梯度洗脫，效果均不理想。參考Wenkui Li等[9]所用的流動(dòng)相:A相乙腈-甲醇-三氟乙酸(89.5∶10∶0.5)，B相水-甲醇-三氟乙酸(79.5∶20∶0.5)，并將其中的三氟乙酸分別換成不同比例的甲酸和冰醋酸，結(jié)果表明，A相乙腈-甲醇-甲酸(89.8∶10∶0.2)和B相水-甲醇-甲酸(79.8∶20∶0.2)進(jìn)行梯度洗脫時(shí)分離效果最好。對(duì)流動(dòng)相比例和洗脫時(shí)間進(jìn)行了大量研究，優(yōu)選出洗脫程序。對(duì)不同檢測(cè)波長(zhǎng)(254，270，360和590 nm)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，在270 nm處分離效果較好，故將270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)?？疾炝瞬煌魉?0.6和1.0 mL·min-1)對(duì)峰的分離效果的影響，選用流速為1.0 mL·min-1。

實(shí)驗(yàn)中用HPLC法對(duì)貫葉金絲桃從原藥材到不同的用藥部位中3種有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定，比較系統(tǒng)全面地反映了貫葉金絲桃藥材的內(nèi)在質(zhì)量。為今后貫葉金絲桃的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.009

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)04-0356-05

(收稿日期：2015-11-23)

Simultaneous determination of rutin，hyperoside and quercetin in Hypericum perforatum by HPLC

CHUAN Juanjuan，ZHANG Baoyang

(Institute of Drug Inspection of Yan′an Shaanxi，Yan′an 716000，China)

Abstract:Objective To establish the assay of rutin，hyperoside and quercetin in raw herb of Hypericum perforatum by HPLC.Methods Samples were extracted with acetone with the assist of ultrasonic wave，separated and determined by HPLC using Diamonsil?C18column (250 mm × 4.6 mm，5 μm).Phase A acetonitrile-methanol-formic acid (89.8∶10∶0.2) and phase B water-methanol-formic acid (79.8∶20∶0.2) were used as the mobile phase at 1.0 mL·min-1and gradient elution；and detected at a wavelength of 270 nm.Results The injection amount of rutin from 0.454 to 4.540 μg(r=0.999 7)，hyperoside from 0.480 to 4.800 μg (r=0.999 2)，quercetin from 0.794 to 7.940 μg (r=0.999 5) showed good linearity with the peak area.The adding recoveries were 99.01%，96.04% and 95.97%(n=6)，respectively.Conclusion It′s a fast，simple，accurate，and reliable analysis method，which can be used to control the quality of the active components of Hypericum perforatum in the raw herb.

Key words：Hypericum perforatum；rutin；hyperoside；quercetin；HPLC