趙玉嬌+徐文慧+沈小麗+田俊生+秦雪梅

[摘要]建立白術(shù)的薄層鑒別與其中3種內(nèi)酯類成分含量同時測定方法。使用硅膠GF₂₅₄薄層板對白術(shù)進(jìn)行定性鑒別；利用UPLC-PDA梯度洗脫法同時測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，選用Waters BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為乙腈-水，檢測波長235 nm。薄層鑒別特征明顯，專屬性強(qiáng)；含量測定的方法學(xué)考察結(jié)果符合規(guī)定，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ， Ⅱ，Ⅲ線性關(guān)系良好（r>0.999 9），平均回收率分別為93.48%（RSD 1.4%）， 94.97%（RSD 1.6%）， 92.71%（RSD 1.2%）。所建立的白術(shù)薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，3種內(nèi)酯類成分同時測定方法操作簡單、靈敏度高，兩者結(jié)合可以更好的用于白術(shù)的質(zhì)量評價(jià)。

[關(guān)鍵詞]白術(shù)； 白術(shù)內(nèi)酯； 薄層鑒別； 超高效液相色譜； 質(zhì)量評價(jià)

[Abstract]This research is to establish TLC and UPLC methods for simultaneous determination of 3 atractylenolides in Atractylodes macrocephala. Silica gel GF₂₅₄ plate was used for identification of A. macrocephala， and UPLC-PDA gradient elution method was used to simultaneously determine atractylenolide Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ. The Waters BEH C₁₈ column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with acetonitrile-water as mobile phase and the wavelength of UV detector of 235 nm were performed. The quality control study showed that the characteristic for identification by TLC was distinct and highly specific. The method of content determination was in accordance with the regulations. The quantitative evaluation of atractylenolide Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ was in good linear range（r>0.999 9）， and the average recovery was 93.48%（RSD 1.4%），94.97%（RSD 1.6%），92.71%（RSD 1.2%），respectively. TLC identification was in good specificity and repeatability， and the UPLC-PDA method for the simultaneous determination of 3 atractylenolides was simple and reliable for the quality control of A.macrocephala.

[Key words]Atractylodes macrocephala； atractylenolide； TLC； UPLC； quality control

白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的根莖，具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功，用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲、眩悸、水腫、自汗、胎動不安等癥^[1]。主要化學(xué)成分為揮發(fā)油，如

蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇等；內(nèi)酯類成分，如白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、雙白術(shù)內(nèi)酯等^[2-4]。2015年版《中國藥典》（一部）白術(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)^[5]中，TLC鑒別僅以蒼術(shù)酮為指標(biāo)成分，尚無含量測定項(xiàng)。而蒼術(shù)酮是我國傳統(tǒng)中藥白術(shù)及蒼術(shù)（Rhizoma Atractylodis）等蒼術(shù)屬藥用植物揮發(fā)油的主要活性成分^[6]，僅用蒼術(shù)酮作為白術(shù)的鑒別指標(biāo)不具有專屬性。此外，白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ也為白術(shù)的主要活性成分^[7]，但相對蒼術(shù)酮來說含量較低，藥典中只用含量較高的蒼術(shù)酮作為質(zhì)量控制指標(biāo)，不能全面反映白術(shù)的質(zhì)量，因此增加除蒼術(shù)酮以外的白術(shù)內(nèi)酯類成分的TLC鑒別及建立相應(yīng)的含量測定方法，對于提升白術(shù)及含白術(shù)的成方制劑的質(zhì)量控制具有重要意義和價(jià)值。

關(guān)于白術(shù)的薄層鑒別，除蒼術(shù)酮之外未見有其他成分的研究，本實(shí)驗(yàn)參考其他有關(guān)內(nèi)酯類成分的鑒別研究^[8-9]，根據(jù)該類成分的理化性質(zhì)，增加了以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ為指標(biāo)成分并結(jié)合蒼術(shù)酮的薄層鑒別方法，該方法專屬性強(qiáng)，效果較好。關(guān)于白術(shù)的含量測定方面，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ以及蒼術(shù)酮多見，研究多采用GC測定蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇等揮發(fā)性成分的含量^[10-11]，以HPLC測定白術(shù)中內(nèi)酯類成分^[12]，未見有用UPLC在同波長下同時測定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的分析方法^[13-14]。本文基于UPLC-PDA建立了同時測定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ含量的分析方法，相對于HPLC具有檢測靈敏度較好，分析周期短、進(jìn)樣量少和成本節(jié)約等特點(diǎn)，為建立全面可控的白術(shù)質(zhì)量評價(jià)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司，配備Acquity UPLC QSM、Acquity UPLC Sample Manager FTN、Acquity UPLC PDA Detector以及Empower工作站）；CPA 225D型1/10萬電子天平（德國Sartorius公司）；BSA 124S型1/1萬電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q純水機(jī)（Direct 8/16 系統(tǒng)，美國Millipore公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品（純度98%，批號YJ-A3-1160519 ），白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌罚兌?8%，批號YJ-A3-1160519 ），白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品（純度98.5%，批號YJ-C1-WG1160520 ），蒼術(shù)酮對照品（純度99%，批號YJ-C1-WG1160520），均購自上海永恒生物科技有限公司，硅膠GF₂₅₄薄層板購自青島海洋化工廠。甲醇、磷酸、甲酸、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

白術(shù)樣本隨機(jī)購自10家不同的藥房，包括10批生白術(shù)和10批炒白術(shù)（樣本來源見表1），經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為正品，留樣于本中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1.1 對照品溶液的制備

分別取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品約10 mg，精密稱定，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為1.186，1.270，1.161 g·L^-1的對照品溶液，作為母液；分別精密吸取各母液0.5，0.5，1 mL各定容至10 mL，得59.3，63.5，116.1 mg·L^-1的對照品溶液，備用。取蒼術(shù)酮對照品約5 mg，精密稱定，加甲醇溶解，配制成0.577 g·L^-1的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取過3號篩（80目）的白術(shù)粉末0.5 g，加甲醇定容至5 mL量瓶中，稱重，超聲提取50 min，冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足失重，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 薄層鑒別

照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部，通則0502）試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮對照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF₂₅₄薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸香草醛硫酸溶液，于100 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰，在254 nm紫外燈下檢視，供試品色譜中，在與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，在與蒼術(shù)酮對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同暗紅色斑點(diǎn)。

按照以上鑒別方法，對10批生白術(shù)和10批炒白術(shù)樣品進(jìn)行了薄層鑒別試驗(yàn)，其結(jié)果見圖1。

2.2 含量測定實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下各對照品母液0.5，0.5，1 mL定容至10 mL，得59.3，63.5，116.1 mg·L^-1的混合儲備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取過3號篩（80目）的白術(shù)（BZ6）粉末約0.5 g，置10 mL量瓶中，精密稱定，加入甲醇定容，稱重，超聲50 min，冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足失重，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：Waters BEH C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫，0～3 min，10%～20% A，3～7 min，20%～45% A，7～10 min，45%～46% A，10～14 min，46%～48% A，14～17 min，48%～48% A，17～18 min，48%～50% A，18～20 min，50%～53% A，20～22 min，53%～53% A，22～27 min，53%～80%A，27～30 min，80%～88% A，30～33 min，88%～10% A；檢測波長：235 nm；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.2 mL·min^-1；柱溫：30 ℃。對照品及樣品色譜圖，見圖2，各成分均達(dá)到基線分析，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的理論塔板數(shù)均大于1萬，分離度均大于1.5。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系 將2.2.1項(xiàng)下混合儲備液逐級稀釋成系列濃度 （分別為原濃度的1，1/2，1/4，1/6，1/8），分別進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表2。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下白術(shù)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 峰面積的 RSD 分別為 0.60%， 0.40%， 1.4%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下白術(shù)供試品溶液，在 0～24 h內(nèi)，分別在0， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 24 h進(jìn)樣1次，計(jì)算得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ 峰面積的RSD分別為 1.6%， 1.8%， 1.6%，表明供試品溶液中3種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批白術(shù)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，進(jìn)樣測定。計(jì)算得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 峰面積的RSD分別為0.90%， 1.2%， 1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的同批白術(shù)樣品0.5 g，平行9份，各置10 mL量瓶中，平均分為3組，每組分別按白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的50%， 100%， 150% 精密加入質(zhì)量濃度為1.186， 1.270， 1.161 g·L^-1白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的母液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。計(jì)算得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的加樣回收率分別在90.48%～94.88%， 93.18%～96.79%， 90.96%～95.30%，平均回收率分別為 93.48%， 94.97%， 92.71%，RSD 分別為 1.4%， 1.6%， 1.2%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.4.6 含量測定 取購置的10批生白術(shù)和10批炒白術(shù)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察

薄層鑒別實(shí)驗(yàn)中考察了不同提取溶劑，包括正己烷和甲醇，發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果最佳。含量測定考察了甲醇、乙醇2種提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取3種白術(shù)內(nèi)酯的含量最高，故選定甲醇為提取溶劑。同時考察了超聲提取時間，最終確定提取方法為超聲提取50 min效果較好。因此薄層鑒別實(shí)驗(yàn)和含量測定采用相同備樣方法，即甲醇超聲提取50 min。

3.2 薄層鑒別條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對比了石油醚（60～90 ℃）、環(huán)己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯等多種展開劑，分別考察了二相、三相和四相展開系統(tǒng)以及不同展開比例對白術(shù)中指標(biāo)成分的分離效果，結(jié)果以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開劑進(jìn)行薄層鑒別，各指標(biāo)成分斑點(diǎn)清晰、分離效果最佳。分別考察了薄層板展開過程中溫度和相對濕度對結(jié)果的影響，結(jié)果表明：溫度為4，15，25，30 ℃時，各指標(biāo)成分斑點(diǎn)的Rf在較小范圍內(nèi)波動，但對分離效果幾無影響；相對濕度為32%，52%，75%，83%時，各指標(biāo)成分斑點(diǎn)的Rf變化極小，不影響分離效果。

3.3 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中嘗試采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、乙腈-磷酸-水等流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用酸時白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品均發(fā)生分解，而采用乙腈-水系統(tǒng)時無分解現(xiàn)象，且白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的分離度及對稱性均良好，保留時間適中。本實(shí)驗(yàn)中檢測波長的選擇是通過紫外200～400 nm 全掃描，在235 nm 處白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 3種物質(zhì)吸收較好，峰型適中，基線平穩(wěn)，故確定檢測波長為235 nm。

3.4 小結(jié)

文獻(xiàn)報(bào)道白術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)酮不穩(wěn)定，影響其不穩(wěn)定的主要條件為光照和溫度^[15-16]。蒼術(shù)酮在空氣中會氧化產(chǎn)生白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、表白術(shù)內(nèi)酯I 和雙白術(shù)內(nèi)酯等幾種物質(zhì)^[17-18]。本實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，蒼術(shù)酮對照品溶液在放置一段時間后發(fā)生分解，在薄層色譜圖中可看到蒼術(shù)酮對照品分解為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ這2種物質(zhì)見圖1，而關(guān)于其轉(zhuǎn)化的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)在國家藥典的基礎(chǔ)上增加了白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的薄層鑒別方法，使鑒別內(nèi)容更加全面也更有專屬性；所建立的3種內(nèi)酯類成分同時測定的UPLC-PDA 方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證和20批樣品的測定，證明該法操作簡便、靈敏準(zhǔn)確，更能客觀、準(zhǔn)確的反映白術(shù)的質(zhì)量，有了較為明顯的改進(jìn)。但本文所用樣本量相對較少，且所選2種不同炮制方法的白術(shù)不是同一批次，本實(shí)驗(yàn)只是說明了所建方法的可行性，如果要對比不同炮制品之間的質(zhì)量差異，還應(yīng)增加樣本量并使用同批生白術(shù)樣本，經(jīng)過炮制后再比較。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]