廖　鳳，梁俊容，肖玉春，段　然，王　鑫，景懷琦，古文鵬

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紅嘴鷗中分離的非傷寒沙門菌分子特征分析

廖鳳1，梁俊容2，肖玉春2，段然2，王鑫2，景懷琦2，古文鵬3

1.云南省第一人民醫(yī)院，呼吸內(nèi)科，昆明650022；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所，北京102206；3.云南省疾病預(yù)防控制中心，急性傳染病防制所，昆明650022

摘要:目的非傷寒沙門菌是一類腸道病原體，能引起人的腹瀉性疾病。特從每年飛抵云南省昆明市的紅嘴鷗中分離的非傷寒沙門菌，作分子分型研究，以反映紅嘴鷗對(duì)于人群健康的潛在影響。方法從2013年11月-2014年1月間，分3次分別采集500份紅嘴鷗糞便樣本，進(jìn)行沙門菌的分離培養(yǎng)。得到菌株之后開展藥敏試驗(yàn)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析。結(jié)果500份糞便樣品分離到78株非傷寒沙門菌，其中鼠傷寒沙門菌75株(96.15%)，韋爾克斯沙門菌1株，印第安納沙門菌2株。藥敏試驗(yàn)顯示，所有非傷寒沙門菌對(duì)于利福平的耐藥率高達(dá)97.44%，其次為萘啶酸(28.21%)和復(fù)方新諾明(25.64%)；而對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星則完全敏感。PFGE結(jié)果顯示，75株鼠傷寒沙門菌形成了3個(gè)帶型，并且?guī)椭g的同源性關(guān)系均大于95%，66株表現(xiàn)為完全一致的帶型特征。與分離自病人的鼠傷寒沙門菌比較后發(fā)現(xiàn)，紅嘴鷗中分離的鼠傷寒沙門菌與病人分離的菌株的PFGE帶型被區(qū)分成了兩個(gè)聚類群。結(jié)論紅嘴鷗有很高的非傷寒沙門菌攜帶率，以鼠傷寒沙門菌為主；PFGE結(jié)果表明，紅嘴鷗攜帶的非傷寒沙門菌可能與其生活環(huán)境和食物構(gòu)成等因素密切相關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)這些菌株與人群患病的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞:紅嘴鷗；非傷寒沙門菌；脈沖場(chǎng)凝膠電泳

Molecular characteristics of non-typhoidSalmonellaisolated fromLarusridibundusin Kunming, China

Supported by the National Sci-Tech Key Project (No. 2012ZX10004-212)

非傷寒沙門菌是人類胃腸炎和腸道外感染的主要病原體，是引起細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌之一，而又以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為主要血清型[1]。非傷寒沙門菌廣泛存在于外環(huán)境和各類宿主動(dòng)物中，人類的感染常與消費(fèi)污染的食物有關(guān)，幾乎可以從所有的食物中分離到非傷寒沙門菌。同時(shí)，各種家養(yǎng)動(dòng)物和野生動(dòng)物中均有分離到非傷寒沙門菌的報(bào)道[2]。

紅嘴鷗是分布于歐亞大陸和北美洲東部沿海的一種候鳥，體型與毛色都與鴿子相似，嘴和腳都呈紅色，身體大部分的羽毛是白色[3]。中國(guó)的新疆、內(nèi)蒙、黑龍江等地是其繁殖地。每年冬季大量的紅嘴鷗從北方西伯利亞地區(qū)遷徙到中國(guó)南方越冬，其越冬地區(qū)分布廣泛，從中國(guó)的東北地區(qū)南部一直到東南部地區(qū)均有分布。自上世紀(jì)80年代以來，每年冬季的11月份至次年的3月份，數(shù)以萬(wàn)計(jì)的紅嘴鷗進(jìn)入昆明地區(qū)的大小湖泊進(jìn)行越冬。每年這個(gè)時(shí)刻，總有許多游客前往紅嘴鷗的棲息地對(duì)其進(jìn)行投食和觀看，人們總是能近距離的與紅嘴鷗進(jìn)行接觸[4-5]。因此，弄清紅嘴鷗攜帶的腸道病原菌及其分布規(guī)律，特別是沙門菌的分布特征有利于對(duì)于此類候鳥的管理，同時(shí)能夠弄清紅嘴鷗攜帶的致病菌分布規(guī)律與其生活環(huán)境之間的相關(guān)性。

1材料和方法

1.1樣本采集我們對(duì)冬季飛抵昆明過冬的海鷗糞便進(jìn)行了采集，共采集糞便樣本500份。采集時(shí)間為2013年的11月、12月與2014年的1月份，共分了3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行采集，每份采集的新鮮糞便標(biāo)本直接接種于SBG增菌液，并送回實(shí)驗(yàn)室，37 ℃培養(yǎng)24 h。1.2沙門菌的分離、鑒定將所有SBG增菌液增菌后的標(biāo)本接種于麥康凱、XLD和SS瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h。對(duì)所有平板中分離到的可疑沙門菌菌株采用Vitek Compact2(梅里埃)全自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行系統(tǒng)的生化鑒定。同時(shí)，采用沙門菌診斷血清(泰國(guó)S&A公司)對(duì)所有生化確認(rèn)后的菌株進(jìn)行血清型別的鑒定。

1.3藥敏試驗(yàn)采用K-B藥敏紙片法進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)制定的微生物敏感試驗(yàn)執(zhí)行。采用ATCC25922大腸埃希氏菌為質(zhì)控菌株，選取10種抗生素作為研究對(duì)象。分別為：氨芐西林(AMP)，阿莫西林/克拉維酸(AMC)，頭孢噻吩(CFT)，頭孢噻肟(CTX)，GEN(慶大霉素)，萘啶酸(NAL)，環(huán)丙沙星(CIP)，四環(huán)素(TET)，利福平(RFA)和磺胺甲基異惡唑/甲氧芐啶(SMZ)。

1.4PFGE具體操作過程見參考文獻(xiàn)[6]，并按照PulseNet的沙門菌標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和參數(shù)設(shè)置(Auto Algorithm: 30kb-low MW, 700 kb-high MW，電泳時(shí)間為19 h)，每塊膠的酶的用量為XbaⅠ 45U。37 ℃分別酶切2 h。電泳結(jié)束后用GelRed核酸染料染色30 min，純水脫色30 min，凝膠成像儀上讀取圖像。

聚類分析采用BioNumerics V6.6軟件進(jìn)行聚類分析，應(yīng)用非加權(quán)組平均法(UPGMA)，聚類相似性系數(shù)采用基于條帶比較的Dice。Dice=2×N/(N+M)，N表示能匹配的條帶個(gè)數(shù)，M表示所有的條帶個(gè)數(shù)(2株菌帶型上的條帶數(shù)總和再減去匹配的條帶數(shù))。

2結(jié)果

2.1菌株分離、鑒定結(jié)果500份紅嘴鷗糞便中共分離出非傷寒沙門菌78株，其中以鼠傷寒沙門菌為主，共75株，占96.15%。其次分離到2株印第安納沙門菌和1株韋爾克斯沙門菌。

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果所有非傷寒沙門菌對(duì)于利福平的耐藥率最高，為97.44%，其次為萘啶酸(28.21%)和復(fù)方新諾明(25.64%)；而對(duì)慶大霉素和環(huán)丙沙星則完全敏感。其中出現(xiàn)的兩株對(duì)氨芐西林等β-內(nèi)酰胺內(nèi)抗生素耐藥的菌株為1株印第安納和韋爾克斯沙門菌，見表1。

表1紅嘴鷗中分離的非傷寒沙門菌抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Tab.1Antibiotics resistant results of non-typhoid Salmonella isolated from Larus ridibundus

抗生素AntibioticsS(敏感)/數(shù)Sensitive/Number率(%)Percent(%)I(中介)/數(shù)Medium/Number率(%)Percent(%)R(耐藥)/數(shù)Resistant/Number率(%)Percent(%)AMP7697.4400.0022.56AMC7697.4400.0022.56CFT7798.7200.0011.28

表1(續(xù))

抗生素AntibioticsS(敏感)/數(shù)Sensitive/Number率(%)Percent(%)I(中介)/數(shù)Medium/Number率(%)Percent(%)R(耐藥)/數(shù)Resistant/Number率(%)Percent(%)CTX7798.7200.0011.28GEN7810000.0000.00NAL5671.7900.002228.21CIP7810000.0000.00TBT7798.7211.2800.00RFA22.5600.007697.44SMZ5874.3600.002025.64

2.3PFGE結(jié)果PFGE結(jié)果顯示，75株鼠傷寒沙門菌形成了3個(gè)帶型，并且?guī)椭g的同源性關(guān)系均大于95%，66株則表現(xiàn)為完全一致的帶型特征。與分離自昆明地區(qū)鼠傷寒沙門菌的病人PFGE帶型比較后發(fā)現(xiàn)，紅嘴鷗中分離的鼠傷寒沙門菌與病人分離的菌株的PFGE帶型被區(qū)分成了2個(gè)聚類群，尚未發(fā)現(xiàn)紅嘴鷗分離菌株與病人分離菌株具有同源性關(guān)系，見圖1。而2株印第安納沙門菌和1株韋爾克斯沙門菌則形成了不同的聚類群。

3討論

每年冬季紅嘴鷗總會(huì)從西伯利亞地區(qū)飛到云南省昆明市越冬，紅嘴鷗主要棲息在城市內(nèi)的一些河流和湖泊，而這些地區(qū)往往是旅游者和人群較為集中的區(qū)域。因此，人群具有密切接觸該類野生動(dòng)物的可能性，而紅嘴鷗本身攜帶的病原菌可能會(huì)給人群帶來一定的潛在的健康危險(xiǎn)[4]。既往對(duì)于紅嘴鷗的病原分析主要集中于禽流感病毒等病毒性疾病的攜帶情況，而忽略了細(xì)菌性病原體的研究和分析，對(duì)于人群健康來說，細(xì)菌性病原體的研究同樣重要，到目前為此，還沒有一項(xiàng)研究涉及到紅嘴鷗攜帶沙門菌的分析。從本研究結(jié)果可以看出，紅嘴鷗中分離出的非傷寒沙門菌以鼠傷寒沙門菌為主，這是引起細(xì)菌性食物中毒最主要的病原菌之一，應(yīng)該引起人們足夠的重視。雖然在我們的結(jié)果中尚未發(fā)現(xiàn)紅嘴鷗分離的鼠傷寒沙門菌與當(dāng)?shù)夭∪朔蛛x菌株之間的同源性關(guān)系，但其潛在的致病性還是存在的，同時(shí)存在著大量人群的密切接觸情況[7-8]。因此，對(duì)于密切接觸此類野生動(dòng)物的人群開展健康宣傳，做好預(yù)防、保健工作具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

注：ho-241,408為印第安那沙門菌；ho-287為韋爾克斯沙門菌，其余均為鼠傷寒沙門菌。Note: ho-241 and 408 were Salmonella Indiana; ho-287 was Salmonella waycross, others were Salmonella typhimurium.圖1　紅嘴鷗分離非傷寒沙門菌PFGE聚類圖Fig.1　PFGE results of the non-typhoid Salmonella isolated from Larus ridibundus

從另一個(gè)方面來看，分離出的鼠傷寒沙門菌與感染鼠傷寒沙門菌的患者的菌株無(wú)同源性關(guān)系，而紅嘴鷗分離出的這些菌株之間的同源性關(guān)系非常接近，大部分菌株為同一個(gè)克隆群的菌株，表明紅嘴鷗攜帶的非傷寒沙門菌主要反映了其生存環(huán)境或是其飲食習(xí)性。這些菌株可能反映了紅嘴鷗生活的水體環(huán)境，以及水體環(huán)境中的藻類、小魚、小蝦等食物中普遍存在著這類非傷寒沙門菌；而以紅嘴鷗為代表的這一類野生動(dòng)物與人類或是家養(yǎng)動(dòng)物之間生活在不同生態(tài)位中，因此未發(fā)現(xiàn)他們之間的同源性關(guān)系[9]。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.010

通訊作者：古文鵬，Email: gu_02788@163.com

中圖分類號(hào)：378.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)04-0367-04

Corresponding author:Gu Wen-peng, Email: gu_02788@163.com

收稿日期：2015-09-02修回日期：2015-12-02

LIAO Feng1, LIANG Jun-rong2, XIAO Yu-chun2, DUAN Ran2,WANG Xin2, JING Huai-qi2, GU Wen-peng3

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstPeople’sHospital

ofYunnanProvince,Kunming650022,China;2.ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;3.YunnanProvincialCentersforDiseasesControlandPrevention,Kunming650022,China)

Abstract:We isolated non-typhoid Salmonella from L.ridibundus in Kunming every year, and performed the molecular typing methods, for refecting the potential influence for human health. Three times of feces collections were performed from Nov 2013 to Feb 2014, and totally 500 feces were acquired from L.ridibundus. We isolated the non-typhoid Salmonella and performed the antibiotics resistant test and pulsed-eld gel electrophoresis (PFGE). Results showed that 78 non-typhoid Salmonella strains were isolated from all the feces, and 75 strains (96.15%) were S.typhimurium, one was S.waycross, and two S.indiana were also found. The antibiotics resistant tests showed that 97.44% of all the strains were resistant to rifampin, 28.21% to nalidixic acid, and 25.64% to sulfamethoxazole/trimethoprim. However, all the strains were sensitive to gentamicin and ciprofloxacin. The PFGE results showed 75 S.typhimurium were divided into three patterns, and the similarity of three patterns was greater than 95%. Of 66 strains showed the same PFGE pattern in the study. Comparing the PFGE patterns with patients in our database, we found that S.typhimurium isolated from L.ridibundus were different from patients, separating into two groups. The carrier rate of non-typhoid Salmonella were very high in L.ridibundus, mainly for S.typhimurium. The PFGE results reflected the strains isolated from L.ridibundus maybe had the relations with their living environment or eating habits. No correlations were found between L.ridibundus and patients in our study.

Keywords:Larus ridibundus; non-typhoid Salmonella; pulsed-field gel electrophoresis

國(guó)家“十二五”科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX10004-212)資助