高智玲，紀(jì)　雪，陳　萍，郭學(xué)軍，劉　軍，祝令偉，周　偉，馮書章，孫　洋

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致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析

高智玲1,2，紀(jì)雪2,3，陳萍1，郭學(xué)軍2,3，劉軍2,3，祝令偉2,3，周偉2,3，馮書章2,3，孫洋2,3

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,長春130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,長春130122；3.吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室,長春130122

摘要：目的了解長春地區(qū)水產(chǎn)品中致病性嗜水氣單胞菌流行菌株的分布及其耐藥情況。方法采用國標(biāo)方法初步分離嗜水氣單胞菌，結(jié)合生化及分子生物學(xué)方法進(jìn)行種屬鑒定并檢測毒力基因，測定致病株毒力及耐藥譜。結(jié)果319份樣品中共分離到279株嗜水氣單胞菌，分離率87.46%。毒力基因陽性株為24株，陽性率為8.60%，毒力基因陽性株全部為β-溶血并具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。致病性分離株至少耐受4類抗生素，均為多重耐藥株。結(jié)論研究獲得了長春地區(qū)嗜水氣單胞菌的基本流行病學(xué)數(shù)據(jù)，探討了其毒力譜和多重耐藥模式，為嗜水氣單胞菌病防控措施提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌；毒力；耐藥性

Supported by the National 863 Project of China (No.2012AA022006), the National Science and Technology Major Project of China (No.2013ZX10004-217-002) and the Scientific and Technological Development Project of Jilin Province (Nos. 20140101032JC & 20150101110 JC)

Corresponding: Sun Yang, Email: sunyang10@hotmail.com

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬于弧菌科、氣單胞菌屬，屬嗜溫、有動力的氣單胞菌群[1]，是氣單胞菌的模式種[2]。在自然界中廣泛分布，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，根據(jù)其毒力差異，可分為致病性菌株和非致病性菌株。致病性菌株可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動物。臨床上，人類感染主要以急性出血性敗血癥為主要特征，慢性感染則主要表現(xiàn)為皮膚潰瘍或腸炎[3]，是一種典型人—獸—魚共患病病原[4]。該病原菌可對淡水養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時給人類的健康帶來嚴(yán)重的威脅，其公共衛(wèi)生學(xué)意義已引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注和高度重視。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗生素的濫用，該菌的耐藥性也在不斷增強(qiáng)并呈現(xiàn)較嚴(yán)重的多重耐藥性，其耐藥問題已成為影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和威脅人類健康的重要因素[5-7]。本研究針對長春地區(qū)淡水養(yǎng)殖魚類及市售淡水魚類采樣、分離嗜水氣單胞菌，并對其毒力及耐藥性進(jìn)行研究，以期掌握致病性嗜水氣單胞菌的流行情況及耐藥譜變化，為淡水養(yǎng)殖業(yè)嗜水氣單胞菌病的防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源2014年采集長春市水產(chǎn)市場、超市、周邊養(yǎng)殖場及水庫魚的鰓拭子、腸道內(nèi)容物、肝臟及魚養(yǎng)殖區(qū)水樣，共計319份。其中水產(chǎn)市場樣品188份，超市樣品65份，周邊養(yǎng)殖場樣品40份，水庫樣品26份。

1.1.2參考菌株及細(xì)胞株 嗜水氣單胞菌質(zhì)控菌株ATCC 7966及Vero (CCL-81)細(xì)胞株由本室保存。

1.1.3培養(yǎng)基及試劑 RS培養(yǎng)基、RYAN培養(yǎng)基及生化反應(yīng)管購自青島海博生物技術(shù)有限公司；MHA鑒定培養(yǎng)基購自法國梅里埃公司；DMEM培養(yǎng)液購自美國Thermo公司；藥敏紙片購自O(shè)xoid公司；PCR Master Mix 緩沖液、DNA Maker為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；引物和測序由invitrogen公司完成；新生胎牛血清購自四季青公司；胰酶為Gibco公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1樣品處理無菌操作剪取魚的肝、腸等樣品于試管中，加入2 mL無菌生理鹽水；水樣品取2 mL于試管中；鰓拭子于拭子管中加入2 mL無菌生理鹽水。以上樣品室溫振蕩10 min，使細(xì)菌充分洗脫，震蕩后靜置2～3 min。

1.2.2菌株分離培養(yǎng)參考GB/T 18652-2002方法[3]，吸取上清10 μL，20 μL生理鹽水稀釋后在RS瓊脂平板上半涂布，半劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況，若菌落光滑、微凸、圓整、黃色或淡黃色，并有特殊芳香氣味，則為疑似菌落。挑取單菌落劃線于RYAN氣單胞菌選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行二次純化，將菌落形態(tài)光滑、中間凸起有核、圓形、顏色綠色或深綠色的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。每樣品僅分離一株(所有分離株為非克隆株)。

1.2.3分離株P(guān)CR鑒定疑似菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；吸取200 μL菌液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入200 μL ddH2O，混勻后100 ℃水浴10 min。冷卻后，12 000 r/min離心1 min，上清作為模板待檢。參考文獻(xiàn)[8-9]，針對氣單胞菌屬16S rDNA基因特異性片段，嗜水氣單胞菌16S rDNA基因特異性片段、溶血素基因、氣溶素基因合成了4對引物(表1)。PCR 反應(yīng)體系：PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，ddH2O補至25 μL。氣單胞菌屬、氣溶素及溶血素檢測PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；嗜水氣單胞菌的特異性16S rDNA檢測PCR反應(yīng)

表1PCR鑒定引物

Tab.1Primers used in this study

引物名稱Name引物序列(5'-3')Sequence(5'-3')基因位置Locationwithingene產(chǎn)物大小/bpSizeofproducts/bp參考文獻(xiàn)或登入號Referenceandno.ofGenBankAHH1FGCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT961-983130[9]AHH1RGAGCGGCTGGATGCGGTTGT1090-1071AH-aerAFCAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA1323-1344309M16495AH-aerARACGAAGGTGTGGTTCCAGT1631-1613A16SFGGGAGTGCCTTCGGGAATCAGA1020-1041356X74677A16SRTCACCGCAACATTCTGATTTG1375-1355AH-16SFGAAAGGTTGATGCCTAATACGTA445-467685KP091884AH-16SRCGTGCTGGCAACAAAGGACAG1130-1110

注：AHH1，溶血素引物；AH-aerA，氣溶素引物；A16S，氣單胞菌16S rDNA屬特異性引物；AH-16S，嗜水氣單胞菌16S rDNA特異性引物。

Note: AHH1, Primers for gene of hemolysin; AH-aerA, Primers for gene of aerolysin; A16S, Primers forAeromonasspp.; AH-16S, Primers forAeromonashydrophila.

條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s ，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1.5%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析。

1.2.4生化鑒定及溶血試驗以細(xì)菌鑒定儀(BD PhoenixTM-100)對24株毒力基因陽性的氣單胞菌分離株進(jìn)行鑒定。以微量發(fā)酵管進(jìn)行生化鑒定，包括葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷，同時進(jìn)行氧化酶試驗、AHM鑒定培養(yǎng)、運動性、吲哚試驗、蛋白酶試驗。并將分離株接種于含5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上，以質(zhì)控菌株為陽性對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～28 h，觀察有無溶血現(xiàn)象。

1.2.5細(xì)胞毒性試驗24株攜帶毒力基因的分離株及10株毒力基因陰性分離株分別接種于5 mL腦心浸液肉湯，28 ℃培養(yǎng)箱中孵育16 h。將菌液于4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，上清過濾除菌。以細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)菌培養(yǎng)上清做2倍梯度稀釋，備用。將處于對數(shù)生長期的Vero細(xì)胞消化并計數(shù)，調(diào)細(xì)胞密度為104m/L，吸取細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，5% CO2，37 ℃，恒溫孵育24～48 h，待細(xì)胞長至80%后，向每孔中添加100 μL不同稀釋度培養(yǎng)上清。每株菌毒素上清設(shè)7個梯度，每個梯度設(shè)3個重復(fù)，于5% CO2，37 ℃恒溫孵育24～72 h，倒置顯微鏡(×40)觀察細(xì)胞病變狀況。同時設(shè)置空白對照、陰性對照(腦心浸液肉湯)及陽性對照(ATCC 7966培養(yǎng)上清)。

1.2.6藥物敏感性試驗以細(xì)菌鑒定儀(BD PhoenixTM-100)測定分離株耐藥譜。儀器不能測定的抗生素采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法，依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)[10]判定耐藥水平。

2結(jié)果

2.1初步分離鑒定經(jīng)RS培養(yǎng)基初步分離、RYAN培養(yǎng)基二次純化后得到279株疑似嗜水氣單胞菌分離株。均為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌。氣單胞菌屬特異性16S rDNA引物PCR鑒定均為陽性。嗜水氣單胞菌特異性16S rDNA引物PCR鑒定205株為陽性，74株為陰性。

2.2毒力基因檢測結(jié)果實驗獲得的擴(kuò)增片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。297株分離菌毒力基因PCR檢測有24株攜帶溶血素和/或氣溶素基因(大多數(shù)分離株同時攜帶氣溶素與溶血素2種基因，3株菌只攜帶一種毒素基因)。其中22株嗜水氣單胞菌特異性16S rDNA檢測陽性(表2)。

表2　毒力基因陽性株鑒定結(jié)果

注：“+”陽性；“-”陰性；“—”無鑒定結(jié)果。

Note: “+” Positive; “-” Negative; “—” No result.

2.3毒力基因陽性菌株鑒定結(jié)果 細(xì)菌鑒定儀對這24株菌鑒定結(jié)果顯示，13株為嗜水氣單胞菌，10株為溫和氣單胞菌，1株為豚鼠氣單胞菌。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》對24株菌進(jìn)行鑒定，氧化酶試驗、葡萄糖發(fā)酵均陽性，4株水楊苷陰性，AHM鑒定培養(yǎng)及阿拉伯糖發(fā)酵試驗中分別有2株為陰性，蔗糖和七葉苷發(fā)酵試驗中分別有1株為陰性，據(jù)此結(jié)果判定，24株毒力基因陽性分離株中15株為嗜水氣單胞菌。此外，蛋白酶試驗、運動性及溶血試驗均為陽性，且均為β-溶血(表2)。

2.4細(xì)胞毒性試驗結(jié)果24株攜帶毒力基因的氣單胞菌培養(yǎng)上清作用于Vero細(xì)胞，均觀察到細(xì)胞皺縮、脫落及形態(tài)變圓等細(xì)胞毒性反應(yīng)。最短在培養(yǎng)上清液作用6 h后，細(xì)胞發(fā)生空泡效應(yīng)；72 h后細(xì)胞脫落、破碎，死亡；對照組細(xì)胞正常。24株毒力基因陽性分離株培養(yǎng)上清致細(xì)胞病變的最大稀釋倍數(shù)在29～218之間，10株毒力基因陰性分離株培養(yǎng)上清致細(xì)胞病變的稀釋倍數(shù)均為2倍，陽性質(zhì)控菌株細(xì)胞毒性反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為218。有6株菌的細(xì)胞毒性較高，在215倍稀釋度及以上，菌株AH-10毒力最強(qiáng)，細(xì)胞毒性反應(yīng)的稀釋倍數(shù)為218。只攜帶1種毒力基因的分離株AH-8、 AH-11及 AH-22的細(xì)胞毒性反應(yīng)的稀釋倍數(shù)分別為217、216和213。不同分離菌株的上清液對細(xì)胞毒性存在差異，結(jié)果統(tǒng)計如圖1。

注：稀釋梯度值為X，log2X-1為橫坐標(biāo)，即9代表1∶29；稀釋梯度10代表1∶210；稀釋梯度11代表1∶211；以此類推。X as the value of dilution gradient, log2X-1 as the absciss, 9 representatives dilutions of 1∶29; 10 representatives dilutions of 1∶210; 11 representatives dilutions of 1∶211; and so on.圖1　細(xì)胞毒性試驗結(jié)果Fig.1　Result of cytotoxic assay

2.5藥物敏感性試驗結(jié)果測試的26種抗生素包括β-內(nèi)酰胺類與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、林可霉素類和四環(huán)素類抗生素。24株攜帶毒力基因的氣單胞菌對其中8種抗生素全部敏感，對7種抗生素完全耐藥(表3)。對青霉素類的氨芐西林、青霉素完全耐藥，對哌啦西林耐藥1株；對頭孢菌素類的頭孢噻吩、頭孢唑林全部耐藥，對頭孢西丁耐藥率達(dá)到41.70%(10株)，對頭孢曲松、頭孢噻肟及頭孢噻肟克拉維酸敏感；對于氨基糖苷類藥物中的鏈霉素耐藥，對慶大霉素、阿米卡星敏感；對喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星耐藥性較左氧氟沙星嚴(yán)重，耐藥率為16.67%(4株)；對大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素耐藥性達(dá)到了87.50%(21株)，對阿奇霉素的耐藥率為37.50%(9株)；對克林霉素完全耐藥；對四環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥率分別為20.83%(5株)和25.00%(6株)；對氨曲南、氯霉素的較為敏感；對碳青霉烯類抗生素全部敏感?？傮w分析，受試菌株對4類及以上抗生素具有耐藥性，均為多重耐藥菌，其中耐5類抗生素的菌株數(shù)最多，耐藥譜最廣的菌株能夠耐受8類抗生素(圖2)。

圖2　不同耐藥類型的菌株統(tǒng)計結(jié)果Fig.2　Statistical results of different resistant strains

3討論

嗜水氣單胞菌對魚等冷血動物和溫血動物均有致病性，是典型的人和水生動物的共患病原菌。該菌本身及其產(chǎn)生的毒素對食品安全提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。很多國外學(xué)者利用PCR方法以16S rDNA為目的基因?qū)κ人畾鈫伟M(jìn)行鑒定，但該方法亦有其局限性[11]。本研究根據(jù)Wang[8]等人的方法分離出的24株攜帶毒力基因的氣單胞菌中，利用Dorsch[9]等的方法嗜水氣單胞菌的檢出率為91.67%(22株)，微生物鑒定系統(tǒng)陽性結(jié)果為54.17%(13株)，傳統(tǒng)生化鑒定16株(66.7%)為嗜水氣單胞菌。因此，若要更準(zhǔn)確地檢出嗜水氣單胞菌，還應(yīng)結(jié)合嗜水氣單胞菌的生長特性及生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定。

嗜水氣單胞菌的致病性與其毒力因子密切相關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)的嗜水氣單胞菌毒力因子很多，但多數(shù)報道認(rèn)為外毒素為嗜水氣單胞菌的主要致病因子[12]。PCR方法作為敏感特異的檢測手段得到廣泛應(yīng)用[13]。本研究以嗜水氣單胞菌的溶血素和氣溶素作為毒力標(biāo)志物進(jìn)行了PCR檢測，并以細(xì)胞試驗測定其毒力。試驗結(jié)果全部毒力基因陽性株培養(yǎng)上清均具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，而隨機(jī)抽取的10株毒力基因陰性株培養(yǎng)上清對vero細(xì)胞毒性較弱，證明可以利用氣溶素和溶血素為毒力標(biāo)志物判定分離株毒力，或用于建立致病性嗜水氣單胞菌的檢測方法。本研究對長春地區(qū)淡水養(yǎng)殖魚類嗜水氣單胞菌的攜帶情況進(jìn)行了初步調(diào)查，結(jié)果顯示該菌廣泛存在于市售淡水魚及水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，且致病性嗜水氣單胞菌占有比例較高，提示人類有通過接觸或食用受污染的生鮮水產(chǎn)品而感染致病性嗜水氣單胞菌的風(fēng)險，應(yīng)引起重視。

表3　致病性嗜水氣單胞菌對26種抗菌藥物的敏感性

注：[a]為KB紙片擴(kuò)散法測得結(jié)果。

Note:[a]Results from Kirby-Bauer Test.

本研究分離的致病性嗜水氣單胞菌對一代頭孢的耐藥率較高，對三代頭孢比較敏感，這與蔡麗娟[6]和Ko[14]等報道一致，頭孢唑林耐藥水平較曲芬[15]等報道的48%的耐藥率差距較大；對青霉素，氨芐西林完全耐藥，耐藥水平與朱秀芝[16]等其他學(xué)者報道的研究結(jié)果相近[17-20]，其耐藥情況甚為嚴(yán)重(96%～100%)，本研究中克林霉素耐藥率為100% ，這可能與嗜水氣單胞菌固有耐藥性有關(guān)[21]。相較于王靜波[22]報道的北京地區(qū)嗜水氣單胞菌的耐藥情況，本研究結(jié)果對磺胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類抗生素耐藥率偏低，而與王友娟[23]報道的遼寧地區(qū)耐藥水平相比，各種抗生素耐藥水平均呈上升趨勢，特別是鏈霉素、紅霉素等抗生素，耐藥率分別從8.4%及42.7%上升到了100%與87.5%。且分離到的毒力基因攜帶株至少耐受4類抗生素，58.3%(14株)的菌株耐受5類抗生素。這與淡水養(yǎng)殖場普遍、高頻度使用這幾種抗菌素有關(guān)，不同養(yǎng)殖區(qū)域、養(yǎng)殖品種、用藥方法及用量也導(dǎo)致了耐藥性的差異。

總之，無論是水產(chǎn)養(yǎng)殖，還是臨床治療，合理使用抗生素已成為當(dāng)務(wù)之急。臨床上應(yīng)盡量根據(jù)藥敏試驗結(jié)果確定使用抗生素的種類和劑量，同時應(yīng)加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的合理使用，控制多重耐藥菌株的產(chǎn)生和流行。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.016

通訊作者：孫洋，Email: sunyang10@hotmail.com

中圖分類號：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1002-2694(2016)04-0400-06

收稿日期：2015-07-09修回日期：2015-12-10

Identification and antimicrobial resistance of pathogenic Aeromonas hydrophila

GAO Zhi-ling1,2, JI Xue2,3,CHEN Ping1,GUO Xue-jun2,3,LIU Jun2,3,ZHU Ling-wei2,3,ZHOU Wei2,3,FENG Shu-zhang2,3,SUN Yang2,3

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.InstituteofMilitaryVeterinary,AMMS,Changchun130122,China;3.KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun130122,China)

Abstract:The occurrence of antimicrobial resistance and prevalent distribution of pathogenic Aeromonas hydrophila from aquatic products was investigated in this study. A total of 279 strains were isolated from 319 samples from commercially available freshwater fish and aquaculture farms in Changchun area, in which virulence genes were detected by PCR assays. Among them, 24 strains were positive (8.06%). Most of them carry both genes of hemolysin (hly) and genes of aerolysin (aerA). Biological characteristics and drug resistance spectrum of the pathogenic Aeromonas hydrophila isolates were characterized and identified. The 24 strains could cause β-hemolytic with positive protease test. To evaluate cytotoxicity by vero cell lines, the culture supernatant of the 24 strains resulted in severe cytopathogenic effect. All of pathogenic Aeromonas hydrophila isolates were resistant to at least 4 kinds of antibiotics. The results showed that all of the pathogenic strains had multiple resistance patterns. The investigation provided basic data for preventing and controlling the transmission of Aeromonas hydrophila with the multi-drug resistant.

Keywords:Aeromonas hydrophila; virulence; drug resisitance

863項目(No.2012AA022006)；國家科技部傳染病重大專項(No.2013ZX10004-217-002)和吉林省科技計劃項目(No.20140101032JC，20150101110JC)聯(lián)合資助