劉偉華，羅紅兵，b*，邱博

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.農(nóng)學(xué)院；b.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

玉米CMS–C型雄性不育系C543恢復(fù)基因的初定位

劉偉華a，羅紅兵a，b*，邱博a

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.農(nóng)學(xué)院；b.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

摘 要：以玉米恢復(fù)系614、B137分別與CMS-C型雄性不育系C543組配的F2代（614群體和B317群體）為試材，進(jìn)行花粉育性鑒定和遺傳分析?；ǚ塾早R檢發(fā)現(xiàn)，C543花藥內(nèi)沒有花粉，屬于無花粉型雄性不育；遺傳分析表明，C543的不育性狀由1對隱性核基因控制，恢復(fù)系614和B137各有1對核恢復(fù)基因；SSR標(biāo)記連鎖分析結(jié)果將恢復(fù)基因定位在玉米8號染色體短臂上，位于標(biāo)記umc1483附近，兩者距離約16.9 cM。

關(guān) 鍵 詞：玉米；雄性不育系；質(zhì)核互作；連鎖分析；基因定位

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雄性不育是玉米雜種優(yōu)勢利用的重要途徑，尤其是細(xì)胞質(zhì)雄性不育對實現(xiàn)玉米“三系”配套雜交種的生產(chǎn)具有重要意義。根據(jù)育性恢復(fù)專效理論，玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育可分為C型、T型和S 型［1］。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，對玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育的遺傳基礎(chǔ)和恢復(fù)基因定位進(jìn)行了大量研究。Khey-pour等［2］認(rèn)為玉米CMS-C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育是由1對顯性恢復(fù)基因控制；陳偉程等［3］研究認(rèn)為CMS-C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育由2對重疊基因控制，而陳紹江等［4］認(rèn)為玉米 CMS-C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)基因由3對甚至更多的顯性互補基因控制。Wise等［5］運用RFLP分子標(biāo)記將Rf1定位在玉米3號染色體的標(biāo)記umc97與umc92之間，將Rf2定位在9號染色體的標(biāo)記umc153與sus1之間。王澤立等［6］運用分子標(biāo)記將玉米 CMS-S型恢復(fù)基因 Rf3定位在2號染色體上，與標(biāo)記RR6距離約為2.0 cM。李鵬等［7］利用BC1F1群體進(jìn)行連鎖分析，將Rf3精細(xì)定位在2號染色體長臂的標(biāo)記A81和A134之間，兩者相距Rf3分別為1.3和1.1 cM?；謴?fù)基因Rf4 和Rf5分別被定位在8號染色體的短臂上和5號染色體的長臂上，且兩者具有疊加效應(yīng)［8］。湯繼華等［9］利用不育系Cms237和恢復(fù)系A(chǔ)6l9構(gòu)建定位群體，

1 材料與方法

2013年春季，以CMS-C型雄性不育系C543為母本、自交系614為父本進(jìn)行雜交，得到F1。夏季種植F1，套袋自交得到F2（614群體）。2013年夏季種植親本C543和B137，于開花散粉期進(jìn)行雜交，得到 F1；2014年春季種植 F1，并套袋自交得到F2（B137群體）。本研究所用材料為614群體和B137群體。

1.2 方法

1.2.1 花粉育性鑒定

在玉米F2群體開花散粉期，取群體單株未開放的小穗于冰盒中，帶回實驗室。采用花粉碘染法，于顯微鏡下觀察花粉育性情況。

1.2.2 遺傳分析

在F2群體開花散粉期，對其進(jìn)行育性考察并統(tǒng)計，進(jìn)行χ2檢驗，并取B137群體的不育單株的葉片提取DNA用于連鎖分析。

1.3 葉片DNA的提取

目前中國旅游業(yè)已步入大眾旅游階段，但大眾旅游者的旅游活動仍以觀光旅游為主，休閑旅游與度假旅游尚處于快速增長之中。因而，遺產(chǎn)型旅游景區(qū)仍是旅游者出游的最佳旅游目的地。但受諸多因素影響，近年來國內(nèi)各遺產(chǎn)型旅游景區(qū)門票漲聲一片，其中依托高品質(zhì)、世界級的自然、文化遺產(chǎn)旅游地漲幅更大。如世界自然遺產(chǎn)地九寨溝的門票由最初的108元調(diào)整至如今的220元，世界文化遺產(chǎn)地布達(dá)拉宮的門票也由最初的100元調(diào)整至300元等等。全面、快速的景區(qū)門票上漲，降低了景區(qū)的社會可進(jìn)入性，致使低收入群體望景興嘆，其旅游需求難以滿足。

采用改進(jìn)的SDS法提取葉片DNA：取適當(dāng)新鮮幼嫩玉米葉片于2 mL離心管中，加液氮，迅速用電鉆磨碎，再加入750 μL Buffer A，顛倒混勻，65 ℃水浴45 min，其間輕搖幾次，取出離心管，放置幾分鐘，依次加入氯仿和異戊醇各350 μL，上下顛倒，輕搖3 min，12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入2 mL滅菌離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒搖勻，得DNA白色絮狀沉淀，用玻璃棒挑出DNA于1.5 mL滅菌離心管中，用70%乙醇洗3次，無水乙醇沖洗1次，于超凈工作臺上風(fēng)干，加適量TE溶解，并置于－20 ℃下保存，備用。

1.4 PCR反應(yīng)體系及程序

PCR擴增采用10 μL反應(yīng)體系，包括1 μL模板DNA，0.6 μL引物（F/R），3.4 μL Mix（內(nèi)含dNTP、Taq酶、Buffer等，北京康為世紀(jì)公司提供），5 μL ddH2O。

擴增程序為94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。之后于4 ℃保存，備用。PCR擴增產(chǎn)物用 6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行銀染，顯影觀察統(tǒng)計并拍照。

1.5 多態(tài)性標(biāo)記的篩選

首先利用271對Indel標(biāo)記（由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)金危危老師提供），篩選出52對在親本間具有多態(tài)性的標(biāo)記。但該類型的多態(tài)性標(biāo)記分布不均，未完全覆蓋所有染色體兩條臂，因此，利用已有的SSR標(biāo)記進(jìn)行適當(dāng)補充，共篩選出 43對在親本間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記。

1.6 電泳條帶統(tǒng)計與重組率計算

根據(jù)顯影觀察結(jié)果，將不育突變體基因型標(biāo)記為1，恢復(fù)系基因型標(biāo)記為2，雜合基因型標(biāo)記為3。

重組率=重組數(shù)/（個體總數(shù)×2）。將1%的重組率換算成1 cM，計算標(biāo)記與目的基因的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄性不育系C543的花粉育性鑒定結(jié)果

在F2群體開花散粉期，對C543不育株和可育株雄穗中部未開放小穗的花藥進(jìn)行碘-碘化鉀染色，鏡檢結(jié)果見圖1。從圖1可知，可育株的花粉碘染后呈現(xiàn)出藍(lán)黑色（圖1-A），且花粉粒形狀規(guī)則，這表明該類型植株的花粉育性正常，能夠正常受精結(jié)實，而不育株的花藥內(nèi)沒有觀察到花粉粒，無法進(jìn)行碘-碘化鉀染色（圖 1-B），這說明不育株的花藥在發(fā)育過程中出現(xiàn)了異常，無法形成正?？捎幕ǚ哿＃罱K導(dǎo)致敗育。

圖1 C543可育株和不育株的花粉碘染鏡檢結(jié)果Fig. 1 Result of I2–KI solution-stained pollen for fertile and sterile individuals

2.2 雄性不育系C543的遺傳分析

對614群體和B137群體進(jìn)行田間育性觀察和統(tǒng)計分析結(jié)果（表1）表明，2個群體中不育單株數(shù)與可育單株數(shù)的比例分別為3.489∶1和3.222∶1，經(jīng)χ2檢驗，符合3∶1的理論分離比，說明C543的不育性狀是由1對隱性核基因控制的，在恢復(fù)系中有對應(yīng)的顯性育性恢復(fù)基因。

表1 F2群體中可育株與不育株的分離比例Table 1 The segregation ratio of plants for wild type and mutant type in F2populations

2.3 雄性不育系C543育性恢復(fù)基因的連鎖分析

利用篩選出的43對SSR標(biāo)記對C543的34個不育單株進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)8號染色體短臂上的標(biāo)記umc1483擴增產(chǎn)物條帶出現(xiàn)偏分離現(xiàn)象，且有少數(shù)交換帶型，而其他SSR多態(tài)性標(biāo)記的擴增結(jié)果也是不育帶型、可育帶型和雜合帶型隨機分離，因此，可以初步確定標(biāo)記umc1483與目的基因連鎖（圖2）。利用umc1483對B137群體中的65個不育單株進(jìn)行基因分型，經(jīng)統(tǒng)計，有 42條帶為不育親本帶型，有18條帶為雜合帶型，只有4條帶為可育親本帶型，這說明F1在形成配子時，同源染色體非姐妹染色單體片段間發(fā)生交換，且單交換多于雙交換。65個單株中得到 22株重組單株，重組率為16.9%，目的基因與umc1483的相對遺傳距離約為16.9 cM。

圖2 標(biāo)記umc1483在親本間與部分F2群體不育單株中的擴增結(jié)果Fig. 2 Result of DNA amplified by marker umc1483 between parents and some F2individuals

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，雄性不育系C543花藥內(nèi)無花粉存在，敗育徹底；614群體和B137群體中不育株和可育株的分離比及卡方檢驗的結(jié)果證實 C543的不育性是由1對隱性基因控制的，相應(yīng)的恢復(fù)系中有顯性恢復(fù)基因存在，使育性得以恢復(fù)。

親本間多態(tài)性標(biāo)記的多少，標(biāo)記的分布均勻度及標(biāo)記質(zhì)量的高低都會對后期的連鎖分析產(chǎn)生一定影響。本試驗利用 Indel標(biāo)記在親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選時，一共篩選到 52對多態(tài)性標(biāo)記，但標(biāo)記分布不均勻且部分標(biāo)記多態(tài)性不好，在連鎖分析中也并未發(fā)現(xiàn)有偏分離的標(biāo)記，可能是由于標(biāo)記距離目的區(qū)域較遠(yuǎn)。利用SSR多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析時，發(fā)現(xiàn)8號染色體短臂上的標(biāo)記umc1483在群體不育株擴增時出現(xiàn)偏分離現(xiàn)象，初步判斷其與目的基因存在連鎖。湯繼華等［9］也將一個玉米C型胞質(zhì)不育的恢復(fù)基因Rf4初步定位在8號染色體的短臂上，但不知道其連鎖標(biāo)記 bnlg2307位置是否與umc1483接近，兩者是否為同一位點。而段柳靜［10］在8號染色體8.00-8.01 Bin區(qū)對恢復(fù)基因Rf4進(jìn)行定位的位置與本研究中定位的連鎖標(biāo)記 umc1483比較接近。通過對恢復(fù)基因進(jìn)行SSR標(biāo)記的定位分析，經(jīng)重組率換算可知目的基因與umc1483的遺傳距離較大，約為16.9 cM，這可能是由于群體數(shù)量少的原因造成的，也可能是由于連鎖標(biāo)記距離目的基因的實際物理距離還較遠(yuǎn)。本研究只找到與目的基因連鎖的單側(cè)標(biāo)記，且遺傳距離較大，未來的工作要加大群體數(shù)量，繼續(xù)對umc1483附近進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)或使用新型標(biāo)記。

本試驗的分子生物學(xué)實驗部分在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)金危危老師幫助下完成，對金危危老師的指導(dǎo)與幫助表示真心感謝！

參考文獻(xiàn)：

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［10］ 段柳靜．玉米C型胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)主基因Rf4的精細(xì)定位［D］．鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

中圖分類號：S513；Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-1032（2016）01-0016-04

收稿日期：2015-09-08 修回日期：2015-12-18

基金項目：“十二·五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目（2011BAD35B01）；湖南省科技計劃項目（2013TP4096）；長沙市科技計劃項目（K1406002-61）

作者簡介：劉偉華（1990—），男，福建南平人，碩士研究生，lwillhall@163.com；*通信作者，羅紅兵，教授，主要從事玉米種質(zhì)創(chuàng)新的新技術(shù)及應(yīng)用研究，hbluo48@sohu.com將Rf4定位在8號染色體短臂上，位于標(biāo)記bnlg2307附近。利用分子標(biāo)記定位育性恢復(fù)基因，對深入研究細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)機理具有重要意義。筆者對不育系C543的不育特征和遺傳特征進(jìn)行分析，并利用分子標(biāo)記對育性恢復(fù)基因進(jìn)行初步定位研究，以期為將來的基因克隆、功能機理研究和雄性不育的利用提供參考依據(jù)。

Primary mapping of restoring gene for CMS-C cytoplasmic male sterility line C543 in maize

Liu Weihuaa，Luo Hongbinga，b*，Qiu Boa
（a. College of Agronomy； b. Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract：Two F2generations， which from the hybridizations of C543×614 and C543×B137， were used as experiment materials to analyze the pollen fertility and inheritance. The results showed that C543 was pollen-free male sterility，which was controlled by a pair of recessive nuclear genes， and there was a restoring gene in restorer 614 and B137，respectively. With the analyzing of SSR， the restoring gene of B137 was mapped on short arm of chromosome 8 and 16.9 cM from the marker umc1483.

Keywords：maize； male sterility line； cytoplasm-nuclear interaction； linkage analysis； gene mapping