劉祥

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中723001）

重組銅綠假單胞菌外毒素A的原核表達(dá)和多克隆抗體制備及免疫保護(hù)功能分析

劉祥

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中723001）

摘 要：為探索銅綠假單胞菌ETA蛋白的免疫保護(hù)功能，采用分子克隆方法獲得銅綠假單胞菌ETA表達(dá)菌株；利用切膠純化獲得ETA蛋白并免疫小鼠，制備ETA蛋白多克隆抗體；用ELISA方法，檢測(cè)出ETA抗血清滴度達(dá)1∶8 000；蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果表明，抗血清具有很好的特異性；小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，ETA對(duì)銅綠假單胞菌感染的保護(hù)率達(dá)50%，顯著高于對(duì)照組的免疫保護(hù)率。用DNAman軟件對(duì)ETA序列同源性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌的同源性高于革蘭氏陽(yáng)性菌，銅綠假單胞菌種間的同源性高于其他種類(lèi)細(xì)菌的同源性；用MEGA軟件對(duì)ETA的進(jìn)化分析結(jié)果表明，不同血清型銅綠假單胞菌的親緣關(guān)系高于其他細(xì)菌，據(jù)此可推測(cè)ETA免疫動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗體可能為不同種類(lèi)銅綠假單胞菌的感染提供交叉免疫保護(hù)。

關(guān) 鍵 詞：銅綠假單胞菌；外毒素A；原核表達(dá)；多克隆抗體；酶聯(lián)免疫法；免疫保護(hù)

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銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又名綠膿桿菌，為一種人獸共患病原菌，也是醫(yī)院感染的常見(jiàn)致病菌［1］，當(dāng)身體燒傷、重大疾病創(chuàng)傷以及免疫缺陷時(shí)易誘發(fā)該菌的感染［2-3］。目前，抗生素濫用使銅綠假單胞菌的耐藥性不斷提高，給臨床治療帶來(lái)較大難度［4-5］，所以，有必要開(kāi)發(fā)新型的蛋白疫苗。該菌感染的毒力因子主要有 ETA蛋白、菌毛、內(nèi)毒素、莢膜、胞外酶S等。ETA蛋白與該

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

P. aeruginosa PAO1菌株和pET-28a質(zhì)粒由陜西理工學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；昆明鼠由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨、酵母粉、IPTG、膠回收試劑盒和基因組提取試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III、Taq酶、T4-DNA連接酶、蛋白 marker，以及核酸 marker均為寶生物工程（大連）有限公司出品；山羊抗小鼠IgG二抗與瓊脂糖購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于博日公司。

1.2 方法

1.2.1 ETA重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布的銅綠假單胞菌基因序列，設(shè)計(jì)ETA蛋白基因引物 Primer 1（5'-ACGGAATTC ATG CACCTGACACCCCA-3'）和Primer 2（5'-GCTAAGC TTTTACTTCAGGTCCTCGC-3'），下劃線分別為限制性內(nèi)酶位點(diǎn)EcoR I和Hind Ⅲ。下同。PCR反應(yīng)體系與條件以及載體構(gòu)建方法見(jiàn)文獻(xiàn)［11］。將獲得的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后提取質(zhì)粒，雙酶切檢測(cè)構(gòu)建的準(zhǔn)確性，并由北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司測(cè)序，鑒定ETA重組基因序列，最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)菌株［12］。

1.2.2 ETA重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)與蛋白純化

將ETA重組菌株過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接入新的LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)約2.5 h后，加入終濃度0.5 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)5 h，通過(guò)SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)ETA蛋白表達(dá)情況。待檢測(cè)到ETA正確表達(dá)后，大量培養(yǎng)菌株，采用文獻(xiàn)［13］中的方法對(duì)ETA蛋白進(jìn)行切膠純化與蛋白復(fù)性。

1.2.3 ETA重組蛋白多克隆抗體的制備

選取4周齡的雄性昆明鼠5只，按照文獻(xiàn)［14］中的方法對(duì)小鼠進(jìn)行OprH蛋白免疫［14］。每只小鼠免疫ETA蛋白3次，每次免疫50 μg蛋白，最后，從小鼠眼部取血獲得ETA抗血清。

1.2.4 ETA抗體效價(jià)與特異性檢測(cè)

通過(guò)ELISA酶聯(lián)法檢測(cè)抗血清效價(jià)［15］，其主要步驟為：將純化的ETA蛋白加入到96孔板中，用封閉液200 μL于37 ℃孵育2 h，然后加入不同稀釋度的ETA小鼠抗血清，再加入二抗溶液，用顯色液顯色，加入終止液后于酶標(biāo)儀450 nm處讀數(shù)。

通過(guò)蛋白印跡法檢測(cè)小鼠ETA抗血清特異性［16］。收集銅綠假單胞菌進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)NC膜后，與不同稀釋度的ETA小鼠抗血清作用，再加入二抗，DAB顯色后檢測(cè)ETA抗血清的特異性。

1.2.5 ETA免疫保護(hù)作用驗(yàn)證

試驗(yàn)組和對(duì)照組各選用20只昆明鼠，按照文獻(xiàn)［17］中的方法進(jìn)行免疫。第3次ETA蛋白免疫后，用銅綠假單胞菌進(jìn)行小鼠腹腔攻毒試驗(yàn)，記錄小鼠的死亡情況，并計(jì)算ETA蛋白的免疫保護(hù)率［18］。采用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，驗(yàn)證ETA的免疫保護(hù)性。

1.2.6 ETA蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)生分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集已經(jīng)公布的細(xì)菌ETA蛋白氨基酸序列信息，采用DNAman 和 MEGA5.02軟件，分別進(jìn)行ETA氨基酸序列的同源性與系統(tǒng)發(fā)生分析［11-13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 ETA重組菌株構(gòu)建結(jié)果

采用 PCR方法從銅綠假單胞菌基因組中擴(kuò)增基因，獲得約1 917 bp的片段（圖1-A）。該片段大小與目的基因大小一致。將PCR獲得的ETA蛋白基因連接入pET-28a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株；提取質(zhì)粒，用EcoR I和Hind III雙酶切重組質(zhì)粒，獲得1 917 bp片段（圖1-B）。該片段大小與ETA蛋白基因大小一致。測(cè)序結(jié)果顯示，重組基因的基因序列與NCBI公布的基因序列相同。

圖1 銅綠假單胞菌ETA蛋白重組質(zhì)粒載體構(gòu)建檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Recombinant plasmid construction test chart for ETA protein gene of P. aeruginosa

2.2 ETA重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)與蛋白純化

從圖2可看出，重組表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，獲得相對(duì)分子質(zhì)量69 000的條帶，ETA蛋白的表達(dá)與預(yù)期相同；采用蛋白電泳切膠純化、尿素梯度復(fù)性獲得ETA重組蛋白，表明銅綠假單胞菌ETA蛋白被成功表達(dá)和純化。

圖2 銅綠假單胞菌ETA蛋白的表達(dá)與純化電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Expression and purification electrophoresis for ETA protein of P. aeruginosa

2.3 ETA的小鼠抗血清效價(jià)與特異性檢測(cè)結(jié)果

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，ETA抗血清效價(jià)為1∶8 000（圖3）。利用蛋白質(zhì)印跡法，發(fā)現(xiàn)不同稀釋度ETA抗血清有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，而對(duì)照無(wú)條帶顯現(xiàn)，表明重組蛋白抗血清與ETA蛋白特異性的結(jié)合，獲得了ETA多克隆抗血清。

圖3 銅綠假單胞菌ETA多克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Detection for ETA polyclonal antibody titer of the P. aeruginosa

2.4 ETA蛋白的免疫保護(hù)作用

小鼠免疫ETA蛋白，攻毒銅綠假單胞菌，發(fā)現(xiàn)攻毒致病菌5 d后，小鼠死亡率得到控制。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組死亡率為80%，試驗(yàn)組死亡率為40%；ETA免疫小鼠激活的特異性免疫對(duì)小鼠銅綠假單胞菌感染的保護(hù)率達(dá)50%，相對(duì)于對(duì)照組具有顯著性差異（表1）。

表1 小鼠免疫ETA及攻毒銅綠假單胞菌試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of immunity of ETA and challenging P. aeruginosa

2.5 ETA蛋白序列系統(tǒng)發(fā)生分析

采用DNAman軟件對(duì)NCBI公布的12種細(xì)菌的 ETA氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示：不同細(xì)菌間 ETA蛋白Ⅲ區(qū)的同源性比Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)的高，這可能與Ⅲ區(qū)發(fā)揮細(xì)胞毒性作用有關(guān)；不同種類(lèi)銅綠假單胞菌的同源性接近100%（圖4）。采用MEGA軟件構(gòu)建ETA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌的親緣關(guān)系高于革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌），不同種類(lèi)銅綠假單胞菌的親緣關(guān)系更近（圖5）。據(jù)此可推測(cè)，ETA蛋白可能為不同種類(lèi)銅綠假單胞菌的感染提供交叉免疫保護(hù)作用。

圖4 ETA蛋白氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig.4 Multiple alignment of amino acid sequences of ETA protein

圖5 MEGA軟件構(gòu)建的ETA氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree from ETA amino acid sequences using MEGA

3 結(jié)論與討論

ETA蛋白是銅綠假單胞菌感染最主要的毒力因子，可激活機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，具有很強(qiáng)的免疫原性［19］。由血管內(nèi)皮F3肽與ETA制備的融合蛋白可抑制人癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［8］；將病毒M2蛋白、分泌蛋白PcrV與ETA制備成聯(lián)合疫苗，可提高小鼠抵御病菌感染的能力［9-10］。ETA在蛋白疫苗和聯(lián)合佐劑制備方面具有廣泛的應(yīng)用前景［20］。有人利用分子克隆獲得了高表達(dá)ETA的菌株［21］，純化獲得了大量的ETA蛋白，并對(duì)ETA的功能進(jìn)行了初步研究［22］。本研究中發(fā)現(xiàn)ETA激活的小鼠特異性免疫反應(yīng)對(duì)銅綠假單胞菌感染的保護(hù)率達(dá)50%，顯著高于對(duì)照組。

獲得 ETA蛋白抗血清是免疫學(xué)功能研究的基礎(chǔ)。Soldatenkova等［23］通過(guò)免疫方法成功制備了ETA小鼠單克隆抗體，研究了ETA的細(xì)胞毒性。單克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜，而多克隆抗體成本低，周期短，效果好，是免疫學(xué)研究常使用的抗體［24］。本試驗(yàn)中將ETA蛋白免疫小鼠，成功制備并鑒定了ETA多克隆抗體。獲得的ETA抗血清的效價(jià)較低可能是由鼠抗［13-14］導(dǎo)致。本試驗(yàn)中通過(guò)增加小鼠免疫數(shù)獲得更多的抗血清，以彌補(bǔ)低鼠抗效價(jià)的不足。

ETA蛋白具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，在遺傳進(jìn)化上具有保守性［6， 25］。本研究結(jié)果表明：不同細(xì)菌的 ETA氨基酸序列具有很高的同源性，且革蘭氏陰性菌的同源性高于革蘭氏陽(yáng)性菌；不同種類(lèi)銅綠假單胞菌的親緣關(guān)系更近。這些發(fā)現(xiàn)可為 ETA蛋白的交叉免疫保護(hù)研究提供參考依據(jù)。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫(kù)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-1032（2016）01-0033-06

收稿日期：2015-01-22 修回日期：2015-11-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510720556）；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（1949）；陜西理工學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（UIRP15006）

作者簡(jiǎn)介：劉祥（1983—），男，安徽合肥人，博士，講師，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)研究，liuxiang888525@163.com菌的感染密切相關(guān)，由toxA基因編碼，具有3個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，I區(qū)與靶細(xì)胞表面受體蛋白的結(jié)合有關(guān)，Ⅱ區(qū)實(shí)現(xiàn)毒素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，Ⅲ區(qū)發(fā)揮細(xì)胞毒性作用［6-7］。ETA具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性，常被用作分子佐劑與其他抗原融合表達(dá)，以提高小分子抗原的免疫應(yīng)答能力［8-9］，在聯(lián)合蛋白佐劑疫苗上具有應(yīng)用價(jià)值［10］。本試驗(yàn)中原核表達(dá)、純化銅綠假單胞菌ETA蛋白，制備和鑒定ETA蛋白多克隆抗體，檢測(cè)ETA的免疫保護(hù)功能，并對(duì)ETA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

Prokaryotic expression, polyclonal antibody preparation and immunoprotection potential of exotoxin A from recombinant Pseudomonas aeruginosa

Liu Xiang
（College of Biological Sciences and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723001， China）

Abstract：To explore the immunoprotection function of Pseudomonas aeruginosa （P. aeruginosa） exotoxin A （ETA）protein， its strain was obtained by approach of molecular clone； ETA was purified by the way of gel slices， and immunized mice was employed to prepare the polyclonal antibody. Antibody titer was 1∶8 000 detected by enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）， and results of western blotting proved that the antiserum had a good specificity； mice specific immune was activated by ETA， and immune protection ratio for mice against P. aeruginosa infection was significant higher than the control group， reached to 50%. Results from ETA homology analysis showed that the homology of gram-negative bacteria was higher than gram-positive bacteria， and P. aeruginosa homology was higher than that of other species analyzed from software of DNAman. Results of phylogenetic analysis showed that the genetic relationship among various P. aeruginosa were higher than that of other bacteria. The specific antibodies produced by ETA immune animals might provide cross protection from the infection of different kinds of P. aeruginosa. Keywords： Pseudomonas aeruginosa； exotoxin A； prokaryotic expression； polyclonal antibody； enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）； immunoprotection