李桂萍，周麗娟，蔡士兵，巴青松

（1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；2.安徽濉溪農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，安徽 濉溪 235100）

超黑糯玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中色素積累的動(dòng)態(tài)變化

李桂萍1，周麗娟1，蔡士兵2，巴青松1

（1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；2.安徽濉溪農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，安徽 濉溪 235100）

摘 要：為探明超黑糯玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中黑色素的積累規(guī)律，以超黑糯玉米自交系I46和白糯玉米自交系BN13雜交F2群體中性狀為黑糯（黑糯27）和白糯（白糯66）為材料，通過(guò)顯微觀察、類胡蘿卜素含量以及花色甙含量的測(cè)定，研究超黑糯玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中黑色素的積累及類胡蘿卜素和花色苷的變化規(guī)律。結(jié)果表明：超黑糯玉米籽粒黑色素主要分布于果種皮中，而糊粉層沒有黑色素分布，隨著籽粒的發(fā)育，黑色素從籽粒遠(yuǎn)胚端開始沉積直至分布到整個(gè)籽粒；在黑糯 27玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中，類胡蘿卜素的含量隨著發(fā)育時(shí)間的推進(jìn)呈總體下降的趨勢(shì)，花色苷含量則隨著籽粒發(fā)育的推進(jìn)先上升，直到30 d時(shí)達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)；在白糯66籽粒發(fā)育過(guò)程中，籽粒沒有黑色素的沉積，類胡蘿卜素含量呈先上升后下降趨勢(shì)，在整個(gè)籽粒發(fā)育過(guò)程中沒有檢測(cè)到花色苷的含量。

關(guān) 鍵 詞：超黑糯玉米；黑色素；類胡蘿卜素；花色苷

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糯玉米在中國(guó)有著悠久的種植歷史，籽粒顏色有黑、白、紅、紫、黃之分［1-2］。黑糯玉米含有豐富的天然黑色素，其黑色素具有很好的抗氧化，清除自由基，抗突變，抗腫瘤等功能。近年來(lái)，隨著人們生活水平和對(duì)健康要求的不斷提高，黑糯玉米倍受消費(fèi)者青睞［3-4］。

“超黑糯玉米”是由安徽省濉溪縣農(nóng)科所特種玉米課題組蔡士兵等首次提出，并于 1999年成功地將秘魯和美國(guó)普通黑玉米的特殊黑色遺傳性狀導(dǎo)入到其自育的、具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀和優(yōu)良品質(zhì)的普通黑糯玉米自交系中，經(jīng)過(guò)多年的雜交育種，培育了濉黑糯1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)系列等多個(gè)超黑糯玉米

目前，關(guān)于籽粒色素積累規(guī)律的研究主要圍繞小麥和普通黑糯玉米展開。崔麗娜等［11］以4種顏色的玉米為材料研究了不同基因型玉米籽粒色素的積累規(guī)律；崇學(xué)鳳等［12］研究了紫色小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中色素含量的動(dòng)態(tài)變化；宋偉等［13］研究了導(dǎo)入外源DNA后產(chǎn)生的有色小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中籽粒色素動(dòng)態(tài)變化，而關(guān)于超黑糯玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中籽粒色素存在的部位以及積累變化的規(guī)律報(bào)道較少。目前，有關(guān)超黑糯玉米的研究主要集中在色素的提取方法、理化性質(zhì)研究［14-16］、色素的醫(yī)療保健價(jià)值等方面［17-19］。

本研究以超黑糯玉米自交系I46和白糯玉米自交系BN13雜交F2群體中性狀為黑糯和白糯的個(gè)體為材料，通過(guò)顯微觀察、有機(jī)溶劑提取和分光光度法研究了超黑糯玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中黑色素的積累部位及類胡蘿卜素和花色苷的變化規(guī)律，旨在揭示超黑糯玉米色素的形成機(jī)制，為超黑糯玉米的開發(fā)利用以及品種選育等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以超黑糯玉米自交系 I46與白糯玉米自交系BN13雜交，得到F1代；F1代種子種植于大田，套袋自交，獲得F2代；在F2群體中，選取性狀為黑糯和白糯的個(gè)體分別套袋自交。本研究中使用的F2代黑糯和白糯個(gè)體分別為黑糯27和白糯66。

1.2 方法

黑糯27和白糯66分別套袋自交。授粉后第10天開始取樣，取果穗中上部大小均勻的籽粒，按縱向排列的方向，從果穗上1列籽粒中取15粒，每隔4 d取樣1次，連續(xù)取6次。取好的籽粒，一部分放在固定液中保存；另一部分放在－80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 測(cè)試項(xiàng)目與方法

1） 玉米籽粒顏色的形成。選取色澤均勻的不同發(fā)育時(shí)期的籽粒2粒，觀察籽粒顏色的變化并拍照。

2） 玉米籽粒色素存在部位觀察。 取固定液中保存的色澤均勻的玉米籽粒，縱切成0.1～0.2 mm的薄片，在奧林巴斯BX51顯微鏡下觀察并拍照。

3） 色素組成及含量測(cè)定。選取色澤均勻的籽粒，參照孫群等［14］的方法提取色素并進(jìn)行一些改良，具體如下：稱0.5 g籽粒于研缽中，冰浴研磨，用無(wú)水乙醇和丙酮混合溶液（體積比1∶1）進(jìn)行色素提取，料液比1∶5，45 ℃下暗處浸提，浸提液經(jīng)PTFE 0.22 μm的濾膜過(guò)濾，用乙醇-丙酮溶液定容至50 mL。以浸提液作為空白對(duì)照，用美國(guó)瓦里安Cary50紫外分光光度計(jì)在663、645、470 nm處測(cè)定吸光值，重復(fù)3次。類胡蘿卜素含量（Car）按下列公式計(jì)算：Car = 8.73D470＋2.11D663－9.06D645。殘?jiān)名}酸-甲醇溶液（體積比為1∶99）于暗處浸提花色苷，浸提3次，定容至50 mL，用紫外分光光度計(jì)在400 ～700 nm范圍內(nèi)掃描其最大吸收峰，并記錄吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中顏色的形成

通過(guò)對(duì)授粉后不同發(fā)育時(shí)期玉米籽粒的觀察，發(fā)現(xiàn)黑糯 27籽粒黑色素是隨籽粒發(fā)育而逐漸沉積的。具體表現(xiàn)為在授粉后14 d，籽粒的遠(yuǎn)胚端開始沉積少量的黑色素，到授粉后34 d，黑色素已經(jīng)充滿了籽粒所有部位（圖1-a）。與普通黑糯玉米不同的是，超黑糯玉米籽粒的胚端從發(fā)育初期就已經(jīng)有黑色素沉積了，而普通黑糯玉米的籽粒胚端沒有色素分布［11］，白糯 66的籽粒在整個(gè)發(fā)育階段都沒有黑色素沉積（圖1-b）。

圖1 玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中顏色的動(dòng)態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes of color during development progress of maize seeds

2.2 超黑糯玉米黑色素沉積部位的確定

對(duì)2種材料的籽粒切片進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)黑糯 27黑色素存在于籽粒果種皮中，而緊貼著種皮內(nèi)側(cè)排列整齊的糊粉層無(wú)色透明（圖2-a），這與已有研究報(bào)道中普通黑糯玉米黑色素分布在糊粉層有所不同。而白糯 66從種皮到糊粉層部位都沒有黑色素沉積（圖2-b）。

圖2 黑糯玉米籽粒色素分布(×20，授粉后28 d)Fig. 2 Distribution of pigment in the seeds of black waxy corn （×20，the 28th day after pollinatiopn ）

2.3 類胡蘿卜素的積累規(guī)律

不同發(fā)育時(shí)期玉米籽粒類胡蘿卜素的含量列于表1。從表1可以看出，白糯66號(hào)與黑糯27號(hào)籽粒發(fā)育過(guò)程中的類胡蘿卜素含量變化趨勢(shì)有所不同。在籽粒發(fā)育的同一時(shí)期，白糯 66號(hào)玉米籽粒中類胡蘿卜素的含量明顯低于黑糯 27籽粒中類胡蘿卜素的含量。在白糯 66號(hào)籽粒發(fā)育的前期，類胡蘿卜素含量呈上升的趨勢(shì)，22 d時(shí)達(dá)到峰值（0.049 6 mg/L），之后類胡蘿卜素含量逐漸下降至0.017 3 mg/L。在黑糯27籽粒發(fā)育過(guò)程中，類胡蘿卜素含量呈下降的趨勢(shì)，在籽粒發(fā)育初期類胡蘿卜素含量最高，為0.115 8 mg/L，籽粒發(fā)育末期，類胡蘿卜素含量最低，為0.037 2 mg/L。

表1 不同發(fā)育時(shí)期玉米籽粒類胡蘿卜素的含量Table 1 Content of seed carotenoid in maize at different stages

2.4 花色苷的積累規(guī)律

不同發(fā)育時(shí)期玉米籽?；ㄉ盏墓饷芏群臀辗宀ㄩL(zhǎng)分別列于表2、表3。從表2可以看出，在白糯 66號(hào)籽粒發(fā)育過(guò)程中沒有檢測(cè)到花色苷的存在，黑糯 27籽粒發(fā)育過(guò)程中花色苷的變化趨勢(shì)與類胡蘿卜素的不同，在籽粒發(fā)育的前期和中后期，隨著籽粒的發(fā)育花色苷呈明顯上升的趨勢(shì)，并于第30天花色苷吸光值達(dá)到峰值（0.519），在籽粒發(fā)育末期30～34 d內(nèi)花色苷含量明顯下降。從表3可以看出，黑糯 27玉米籽?；ㄉ瘴辗咫S時(shí)間而變化，說(shuō)明花色苷的組成在發(fā)生變化。

表2 不同發(fā)育時(shí)期玉米籽粒花色苷的光密度Table 2 Absorption value of anthocyanin in maize at different stages

表3 黑糯27籽粒不同時(shí)期花色苷的吸收峰波長(zhǎng)Table 3 Absorption peak’s wavelength of anthocyanins of Heinuo 27 at different stages

3 結(jié)論與討論

崔麗娜等［11］在研究不同基因型玉米籽粒類胡蘿卜素與花色苷色素積累規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑糯玉米的黑色素存在于糊粉層，花色苷含量在黑糯玉米授粉后40 d達(dá)到最大值。本研究結(jié)果表明，黑糯27在授粉后30 d黑色素即達(dá)到最大值。冉穎霞等［18］、蔡士兵等［20］的研究發(fā)現(xiàn)，超黑糯玉米比普通黑糯玉米轉(zhuǎn)色早，粒色深，黑色素含量也明顯高于普通黑糯玉米， 其籽粒形成時(shí)即呈深紫黑色，尤其是籽粒果種皮和穗軸中水溶性天然黑色素含量高， 穩(wěn)定性好，具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。本研究結(jié)果表明，超黑糯玉米黑色素主要存在于果種皮中，糊粉層沒有黑色素沉積。在玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中，白糯 66的類胡蘿卜素含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在整個(gè)籽粒發(fā)育時(shí)期，都沒有檢測(cè)到花色苷的存在。黑糯 27隨著籽粒發(fā)育天數(shù)的增加，其類胡蘿卜素含量呈下降趨勢(shì)；在發(fā)育過(guò)程中花色苷的含量先上升，到30 d達(dá)到最大值，后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。黑糯 27在籽粒發(fā)育末期花色苷含量下降的原因可能是后期與花色苷合成有關(guān)的酶活性降低，或者是花色苷的含量與類胡蘿卜素的合成與降解有關(guān)，還可能與籽粒中糖與淀粉的合成有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

中圖分類號(hào)：S513.01

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-1032（2016）01-0006-05

收稿日期：2015-07-02 修回日期：2015-12-09

基金項(xiàng)目：安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2012A254）；淮北市人才基金項(xiàng)目（20130301）

作者簡(jiǎn)介：李桂萍（1977—），女，新疆米泉人，博士，主要從事作物遺傳育種研究，liguipingxxq@163.com新品種［5-7］。該類品種營(yíng)養(yǎng)豐富，天然黑色素和微量元素硒含量也明顯高于普通黑糯玉米，籽粒果皮及穗軸中黑色素含量高達(dá) 7%以上。黑色素的主要化學(xué)組分為花色苷。研究［8-10］表明，花色苷類物質(zhì)具有抗變異、抗腫瘤、抗過(guò)敏、降血脂、保護(hù)胃黏膜等多種生物活性功能，故超黑糯玉米具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值。

Regularity of pigment accumulation in the grain development progress of super black waxy corn

Li Guiping1， Zhou Lijuan1， Cai Shibing2， Ba Qingsong1
（1.School of Life Science， Huaibei Normal University， Huaibei， Anhui 235000， China； 2.Suixi Agricultural Research Institute of Anhui， Suixi， Anhui 235100， China）

Abstract：In this study， Heinuo 27 and Bainuo 66 from F2generation of super black waxy corn inbred lines I46 crossed white waxy corn inbred lines BN13 were selected to study the distribution and accumulation regularity of maize pigment in grains by microscopic observation， solvent extraction method and spectrophotometry. The results showed that the pigment of super black waxy corn existed in seed coat， which appeared from the top of kernels and then spread to the whole grain. With the development of grains of Heinuo 27， the content of carotenoid decreased gradually， however， the content of anthocyanin increased until it reached the maximum value on the 30th day after pollination and then decreased. With the development of grains of Bainuo 66， there was no melanin in the grains and the contents of carotenoid increased first and then dropped， however， the anthocyanin was not detected in the whole grain development process.

Keywords：super black waxy corn； pigment； carotenoid； anthocyanin