汪春蕾，李凡姝，孫海瓊，趙敏，蘇秋鈺，亓旭輝

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

Bacillus細(xì)菌的分離及其芽孢漆酶對染料脫色的影響

汪春蕾，李凡姝，孫海瓊，趙敏，蘇秋鈺，亓旭輝

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

摘 要：利用含銅離子的富集培養(yǎng)基，從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場蒙古櫟林下的土壤中篩選出具有較高漆酶活性的1株細(xì)菌，采用形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)以及16S rDNA序列同源性分析等方法，鑒定其為芽孢桿菌屬細(xì)菌，命名為Bacillus sp. 5`MS。以丁香醛連氮為底物，以芽孢干重計(jì)算，其芽孢漆酶的活性高達(dá)56.73 U/g。菌株5`MS芽孢漆酶的最適pH值為6.6，最適反應(yīng)溫度為70 ℃。在100 ℃條件下，該芽孢漆酶反應(yīng)活性仍可達(dá)最適條件下的34.61%。當(dāng)染料脫色體系中添加介體乙酰丁香酮時(shí)，菌株5`MS芽孢漆酶1 h內(nèi)對活性黑、靛紅及結(jié)晶紫的脫色率均達(dá)92%以上，4 h內(nèi)對活性藍(lán)的脫色率達(dá)82.8%。

關(guān) 鍵 詞：芽孢桿菌屬；芽孢漆酶；染料脫色

投稿網(wǎng)址：http：//xb.ijournal.cn

漆酶（benzenediol： oxygen oxidoreductases， EC1. 10.3.2）是一類含銅的多酚氧化酶，能夠利用分子氧氧化各種芳香族和非芳香族化合物，并能同時(shí)完成多種底物的單電子轉(zhuǎn)移，分子氧被還原為水［1］。漆酶廣泛分布于真菌、植物和動物中［2］，近年來也發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛存在于細(xì)菌中［3-4］。細(xì)菌漆酶具有獨(dú)特的性質(zhì)，如在堿性條件下具有較好的活性及穩(wěn)定性［4］。細(xì)菌漆酶具有高耐熱性［5］，而真菌漆酶在高溫及高pH值條件下通常會迅速地失去活性［6］。芽孢桿菌屬細(xì)菌漆酶比真菌漆酶更適合對其基因進(jìn)行操作和重組［7-8］。漆酶作用的底物范圍廣泛，在造紙、食品、降解工業(yè)染料和生物檢測等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景［9］。近年來，合成染料廣泛應(yīng)用于紡織工業(yè)、醫(yī)藥、化妝品和食品等行業(yè)。全球每年生產(chǎn) 10萬多種染料（質(zhì)量超過80萬t［10］）。染料一般以顯色基團(tuán)進(jìn)行劃分，目前被廣泛使用的是偶氮、蒽醌、靛藍(lán)以及三苯甲烷這4種染料［11］。傳統(tǒng)上采用物理法和化學(xué)法降解染料。近年來，生物治理法的安全性

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

供試樣品為東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場蒙古櫟林下的土壤。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA polymerase、RNase A、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、溶菌酶、dNTP（2.5 mmol/L）為北京TIANGEN公司產(chǎn)品；pMD18-T Simple載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；Tryptone、Yeast Extract為Oxoid公司產(chǎn)品；EDTA、IPTG為 Amresco公司產(chǎn)品；X-Gal 2，2-連氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、丁香醛連氮（Syringaldazine，SGZ）、活性亮藍(lán)（Remazol Brilliant Blue R，RBBR）、靛紅（Indigo Carmine， IC）和活性黑（Reactive Black 5，RB5）為Sigma公司產(chǎn)品；結(jié)晶紫（Crystal Violet， CV）為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基組成（w/v）：1% Tryptone，0.5% Yeast Extract，1% NaCl，1.5%瓊脂。培養(yǎng)基pH為7.0。

1.2 方法

1.2.1 高產(chǎn)漆酶菌株的篩選及分離純化

稱取東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場蒙古櫟林下的土壤10 g為樣品。樣品加入到120 mL M9培養(yǎng)基［17］，充分振蕩混合，180 r/min、37 ℃下培養(yǎng)2 d，連續(xù)繼代培養(yǎng)，將稀釋后的培養(yǎng)液均勻涂布在 0.2 mmol/L Cu2+的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)3 d。用1 mmol/L丁香醛連氮溶液對上述培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行鑒定。挑選對丁香醛連氮顯現(xiàn)粉紅色的單菌落接種于含0.4 mmol/L Cu2+的LB培養(yǎng)基上，重復(fù)操作3次，得到具有高漆酶活性的菌株5`MS。

1.2.2 高產(chǎn)漆酶菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特性指標(biāo)測定

對菌株5`MS進(jìn)行革蘭氏染色，并通過生理生化反應(yīng)試驗(yàn)觀測氧化酶、過氧化氫酶和糖類發(fā)酵等特性，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［18］。

1.2.3 產(chǎn)漆酶菌株16S rDNA序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

參考文獻(xiàn)［19］的方法提取菌株 5`MS 的總DNA。以此為模板，利用16S rDNA的通用引物［20］27F和1492R對模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2 μL 10×Taq Reaction Buffer，0.4 μL dNTP，27F和1492R 各0.3 μL，0.2 μL Taq DNA polymerase（3 U/μL），1 μL DNA模板，8.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T過夜連接，再轉(zhuǎn)化到E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，將菌落PCR鑒定到的陽性轉(zhuǎn)化子送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

將所得序列利用 NCBI（National Center for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih. gov）的BLAST工具進(jìn)行分析比對，利用Clustal軟件進(jìn)行多序列比對以及 Phylip-3.69軟件中的最大簡約法構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株5`MS芽孢漆酶活性的測定

由于該菌株的漆酶活性來源于其芽孢外壁蛋白，所以其芽孢懸液即為芽孢漆酶液。在含有 0.2 mmol/L Cu2+的固體LB平板上接種菌株5`MS，37℃恒溫培養(yǎng)4 d，參照文獻(xiàn)［21］中的方法制備芽孢漆酶粗酶液。

以丁香醛連氮（syringaldazine，SGZ）作為底物，檢測菌株5`MS芽孢漆酶的活性。反應(yīng)體系包括緩沖液（0.2 mol/L磷酸氫二鈉與0.1 mol/L檸檬酸的混合液，pH 6.0），0.1 mol/L的丁香醛連氮以及一定體積的粗酶液。將反應(yīng)混合液在37 ℃水浴3 min，測定其在525 nm處的吸光值。測定3次。將每1 min氧化1 μmol 底物為產(chǎn)物所需的漆酶量定義為一個酶活力單位。

1.2.5 pH和溫度對芽孢漆酶活性的影響試驗(yàn)

采用0.2 mol/L 磷酸氫二鈉- 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 3.0～8.1），以 ABTS（2，2’-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid））和 SGZ為底物測定不同pH條件下的漆酶活性。測定3次。

在最適pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，以SGZ為底物，依次測量該芽孢漆酶在30～100 ℃條件下的酶活。測定3次。

1.2.6 菌株5`MS芽孢漆酶對染料脫色影響的試驗(yàn)

選取活性亮藍(lán)、活性黑、靛紅以及結(jié)晶紫4種染料，其最終質(zhì)量濃度分別為100、40、25、5 mg/L，其最大吸收波長分別為591、597、610、583 nm，研究添加介體乙酰丁香酮（ACE）時(shí)該粗酶液對染料脫色率的影響。芽孢粗酶液的濃度計(jì)算方法和脫色體系參考文獻(xiàn)［17］。40 ℃水浴鍋中振蕩，定時(shí)取樣，12 000 r/min 離心3 min后測定不同染料最大吸收波長下的OD值。測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株5`MS的篩選及分離純化

將土壤樣品利用含銅離子的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，以丁香醛連氮為底物對產(chǎn)漆酶的菌株進(jìn)行篩選，并在固體培養(yǎng)基上對菌種進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，選取1株對丁香醛連氮顯現(xiàn)為較深紅色的單克隆菌株為研究對象，并將其編號為5`MS。

2.2 菌株5`MS的形態(tài)和生理生化特性

菌株5`MS呈桿狀，菌體大小為（0.1～0.15） μm× （0.5～0.6） μm。革蘭氏染色結(jié)果為藍(lán)紫色，表明菌株為革蘭氏陽性細(xì)菌（圖1）。該菌株在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落為圓形，白色，半透明，光滑濕潤，稍隆起。菌株5`MS可以分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和甘露糖。菌株5`MS馬尿酸鹽、甲基紅、硝酸鹽還原、丙二酸鹽、明膠液化、西蒙氏枸櫞酸鹽、氧化酶和硫化氫測定結(jié)果均為陰性。

圖1 菌株5`MS革蘭氏染色結(jié)果（×1 000）Fig.1 Gram staining micrograph of strain 5`MS

2.3 菌株5`MS的16S rDNA序列分析

圖2中目的條帶清晰明亮。將16S rDNA 的PCR產(chǎn)物與E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞連接培養(yǎng)后，挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落進(jìn)行PCR，結(jié)果（圖3）表明，條帶單一、明亮，且無特異性條帶，其長度約為1.4 kb。

圖2 菌株5`MS的總DNA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result from total DNA of strain 5`MS

圖3 菌株5`MS的16S rDNA PCR電泳結(jié)果Fig.3 PCR result of 16S rDNA from strain 5`MS

經(jīng)測序分析，菌株5`MS的序列長度為1 422 bp。將其序列與GenBank中細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對，用 Lasergene軟件包中的 Editseq和Phylip-3.69構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。該序列與芽孢桿菌屬（Bacillus）的親緣關(guān)系最為接近，保守區(qū)相似性為99%。結(jié)合菌體形態(tài)特征和生理生化特性，確定該菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus）的新菌株，并將其命名為芽孢桿菌5`MS （Bacillus sp. 5`MS）。

圖4 根據(jù)16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree from 16S rDNA sequences

2.4 pH和溫度對菌株5`MS芽孢漆酶活性的影響

在30 ℃條件下，通過調(diào)節(jié)0.1 mol/L檸檬酸和0.2 mol/L磷酸氫二鈉的比例來配置不同 pH緩沖液。如圖5所示，以ABTS為底物時(shí)，pH 3.0條件下芽孢漆酶的活性最強(qiáng)；pH為3.0～6.0時(shí)芽孢漆酶的活性呈下降趨勢。以SGZ為底物時(shí)，以pH達(dá)6.6時(shí)芽孢漆酶的活性最強(qiáng)，因此，菌株5`MS芽孢漆酶對ABTS的最適反應(yīng)pH為3.0，對SGZ的最適pH為6.6。在最適pH條件下，由圖6可知，該芽孢漆酶在30～70 ℃均具有良好的活性，其中70℃左右漆酶活性達(dá)最大值；當(dāng)溫度升高到100 ℃時(shí)，該酶仍具有34.61%的活性?？梢?，菌株5`MS的芽孢漆酶具有良好的耐熱性。

圖5 不同pH下菌株5`MS芽孢漆酶的相對酶活性Fig.5 Relative enzyme activity of spore laccase in strain 5`MS under different pH

圖6 不同溫度下菌株5`MS芽孢漆酶的相對酶活性Fig.6 Relative enzyme activity of spore laccase in strain 5`MS under different temperatures

2.5 菌株5`MS芽孢漆酶對染料脫色的影響

當(dāng)不含介體ACE時(shí)，菌株5`MS芽孢漆酶僅對結(jié)晶紫（CV）有脫色效果，1 h后脫色率為63.06%，對染料活性亮藍(lán)（RBBR）、活性黑（RB5）和靛紅（IC）均無脫色作用。當(dāng)在脫色體系中加入0.1 mmol/L 介體ACE、pH為6.0的情況下，菌株5`MS的芽孢漆酶對活性亮藍(lán)、活性黑、靛紅及結(jié)晶紫均有脫色作用，在1 h內(nèi)對活性黑、靛紅和結(jié)晶紫的脫色率達(dá)92%以上（圖7），而菌株Bacillus sp.CLb在4 h內(nèi)對靛紅和活性黑的脫色率僅為81%和85.3%［17］。經(jīng)過4 h，菌株5`MS芽孢漆酶對RBBR的脫色率達(dá)80%以上（圖8）。

圖7 菌株5`MS對3種染料的脫色率Fig.7 Decolorization rate of three dyes by bacterial strain 5`MS

圖8 菌株5`MS對活性亮藍(lán)的脫色率Fig.8 Decolorization rate of RBBR by bacterial strain 5`MS

3 結(jié)論與討論

利用含銅離子的富集培養(yǎng)基篩選出漆酶活性較高的細(xì)菌菌株，并測定了菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征，分析了菌株的16S rDNA序列，初步確定該株細(xì)菌在分類上屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。該菌株的漆酶活性較高，并對蒽醌（活性亮藍(lán)）、偶氮（活性黑）、靛藍(lán)（靛紅）以及三氯甲烷（結(jié)晶紫）類染料具有明顯的脫色效果。

細(xì)菌漆酶的耐熱性比真菌漆酶強(qiáng)，能適應(yīng)堿性條件，穩(wěn)定性好，而大多數(shù)真菌漆酶的最適pH為酸性范圍［22］，例如雙孢蘑菇（Agarigusbisporus）漆酶的最適反應(yīng) pH 值為 5.0，在堿性條件下漆酶迅速失活［23］。王祎寧［24］發(fā)現(xiàn)絲孢菌（Monodictys asperospera）漆酶的最適反應(yīng)pH為6.6，當(dāng)pH 8.0時(shí)酶活下降53.06%；當(dāng)pH 9.0 時(shí)幾乎沒有漆酶活性。本研究中篩選的細(xì)菌5`MS芽孢漆酶可在堿性條件下催化底物丁香醛連氮，在pH 8.0時(shí)漆酶活性仍保留71.26%。大多數(shù)工業(yè)廢水和染料廢水的pH值一般在堿性范圍內(nèi)，菌株5`MS芽孢漆酶在堿性環(huán)境以及高溫環(huán)境下較為穩(wěn)定，因此，該菌株在處理堿性工業(yè)廢水上具有較好的應(yīng)用前景。將介體加入漆酶脫色體系可以極大地?cái)U(kuò)大其作用的底物范圍，同時(shí)促進(jìn)更多難氧化有機(jī)物的氧化分解，在環(huán)境污染治理上具有重要用途［25］。解淀粉芽孢桿菌LC03 （Bacillus amyloliquefaciens LC03）在pH為6.8]的條件下，當(dāng)脫色體系中含有乙酰丁香酮（ACE）時(shí)，該漆酶對這4種染料的脫色率為60%以上［26-27］。本研究中選取蒽醌（活性亮藍(lán)）、偶氮（活性黑）、靛藍(lán)（靛紅）以及三氯甲烷（結(jié)晶紫）等4種類型染料，在介體乙酰丁香酮（ACE）的參與下，菌株 5`MS的芽孢漆酶均對活性黑，靛紅和結(jié)晶紫脫色有明顯的效果，在1 h內(nèi)的脫色率均高達(dá)92%以上。可見，該芽孢漆酶在工業(yè)染料廢水的處理上具有較好的應(yīng)用潛能。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

中圖分類號：X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-1032（2016）01-0085-06

收稿日期：2015-03-07 修回日期：2015-11-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170553）；國家林業(yè)局“948”項(xiàng)目（2012-04-03）；黑龍江省博士后資助項(xiàng)目（LBH-Z11254）

作者簡介：汪春蕾（1972—），女，黑龍江省肇東市人，博士研究生，副教授，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究，wcls-1972@163.com和高效性越來越受到人們的關(guān)注。生物處理法主要是利用漆酶等微生物轉(zhuǎn)化酶，通過吸附或降解去除廢水中的染料［12］。漆酶和漆酶-介體體系能廣泛降解芳香族化合物［13］，是治理染料廢水最有潛力的物質(zhì)之一。雖然已有關(guān)于細(xì)菌菌株能使蒽醌［14］、偶氮［15］和三苯甲烷［16］類染料脫色的報(bào)道，但關(guān)于能夠同時(shí)使3種染料脫色的細(xì)菌菌株鮮見報(bào)道。筆者從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場蒙古櫟林下的土壤中篩選出具有漆酶活性的菌株 5`MS，通過鑒定，確定其為芽孢桿菌屬新菌株，并就該菌株芽孢漆酶對常用染料的脫色效果進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

Isolation of strain Bacillus and the effects of its spore laccase on dye decoloration and degradation

Wang Chunlei， Li Fanshu， Sun Haiqiong， Zhao Min， Su Qiuyu， Qi Xuhui
（College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Heilongjiang 150040， China）

Abstract：Enrichment medium added with copper ions was used to screen and isolate bacteria with laccase activity from soil at Quercus mongolica forest in northeast forestry university. The strain was identified as Bacillus sp. 5`MS judged from morphological， physiological and biochemical characteristics as well as from 16S rDNA sequence analysis. Its spore laccase activity was 56.73 U/g calculated by dry weight in syringaldazine as substrate. The optimum pH for its activity was 6.6 and the optimum reaction temperature was 70 ℃. Even though the temperature was enhanced to 100 ℃， the spore laccase activity of strain 5`MS could remain 34.61% of that in the optimal condition. The spore laccase could decolorize more than 92% of reactive black 5（RB5）， indigo carmine （IC） and crystal violet （CV） in 1 hour，and 82.8% of reactive brilliant blue R in 4 hours at the condition of acetosyringone as the mediator.

Keywords：Bacillus； spore laccase； dye decolorization