吉璐，陳智勇，肖亮，易自力*

（1.湖南第一師范學(xué)院基礎(chǔ)生物實驗室，湖南 長沙 410205；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

MlNAC2基因的克隆及其在南荻根部的表達模式

吉璐1，2，陳智勇2，肖亮2，易自力2*

（1.湖南第一師范學(xué)院基礎(chǔ)生物實驗室，湖南 長沙 410205；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

摘 要：克隆南荻MINAC2基因的cDNA序列，該序列全長為933 bp，編碼產(chǎn)物含310個氨基酸殘基，其蛋白質(zhì)理論相對分子質(zhì)量為34 427.8，等電點（pI）為5.85，不穩(wěn)定系數(shù)為34.84，為穩(wěn)定蛋白，具有保守的NAM基序，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，可推測其為親水性蛋白。亞細胞定位試驗結(jié)果表明，MlNAC2定位于細胞核，可能在細胞核內(nèi)行使功能。轉(zhuǎn)錄激活試驗結(jié)果表明，MlNAC2是一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白，且轉(zhuǎn)錄激活域位于C端。熒光實時定量PCR分析結(jié)果表明，高鹽、干旱、脫落酸、茉莉酸甲酯和機械傷害均能誘導(dǎo)MlNAC2基因在南荻根部的表達上調(diào)，而低溫處理時表達下調(diào)。

關(guān) 鍵 詞：南荻；NAC轉(zhuǎn)錄因子；基因表達；亞細胞定位；轉(zhuǎn)錄激活

投稿網(wǎng)址：http：//xb.ijournal.cn

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor）也稱反式作用因子，是一類能與真核基因啟動子中的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過蛋白之間的相互作用來激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。NAC （NAM，ATAF and CUC2）轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，全基因轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，約 20%～25%的 NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了至少一種脅迫應(yīng)答過程［1］。Mao等［2］發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達小麥TaNAC2和 TaNAC67基因，能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱、高鹽、低溫等多種非生物逆境脅迫的抗逆性。過表達水稻OsNAC5能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性［3］。GmNAC20受干旱脅迫誘導(dǎo)，過表達植物的抗鹽和抗低溫能力得到提高［4］。AhNAC2和 AhNAC3在ABA誘導(dǎo)、干旱和低溫條件下的表達上調(diào)［5］。茄子SmNAC1受低溫、高鹽和GA誘導(dǎo)表達，且優(yōu)先在根部表達［6］。

南荻（Miscanthus lutarioriparius）是中國特有的C4類多年生草本能源植物，主要分布在長江中下游流域，具有生物質(zhì)產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣等特點，近年已成為生物質(zhì)能源領(lǐng)域的研究熱點［7］。提高南荻的抗逆性，使其能在荒草地、灘涂鹽堿地等邊際性土地中生長，是南荻作為能源植物開發(fā)利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在干旱、高鹽、低溫和ABA等處理下，南荻葉片中多個NAC基因的表達上調(diào)［8］，在擬南芥中過表達南荻MlNAC2和MlNAC5基因能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性［8-9］。筆者研究MlNAC2基因的克隆及其在南荻根部的表達模式，旨在為芒草抗逆性的遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

南荻材料為二倍體（2n=2x=38），采用根狀莖無性繁殖。煙草（Nicotiana benthamiana）品種為Wisconsin 38。2種材料的培養(yǎng)條件均為溫度25～28 °C，光合強度80～200 μmol/（m2·s），空氣相對濕度為65%，光照周期16 h（光照）/8 h（黑暗）。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、酵母菌AH109、pGWC-T載體、pEarlyGate104載體及pGBKT7由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 MlNAC2基因的克隆

將南荻幼根樣品在液氮中研磨成粉末狀，用Trizol試劑盒（購自Invitrogen公司）提取總RNA，并用DNase I進行消化，去除基因組DNA污染，cDNA第一鏈的合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自TaKaRa公司）說明書進行。

根據(jù)已得到的MlNAC2基因（GenBank登錄號KM017002）序列設(shè)計特異性引物，獲得MlNAC2基因正向引物序列5′-ATGGGATTGCCGGTGAGGA GGG-3′和反向引物序列5′-TCAGAATGGTCCCA ACCCGGCG-3′。擴增得到目的片段，經(jīng)回收，連接到入門載體pGWC-T，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含有25 μg/mL氯霉素的LB平板上進行轉(zhuǎn)化子篩選，將PCR鑒定為陽性的克隆送北京華大基因公司測序，將測序正確的重組入門載體命名為pGWC-MLNAC2。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

編碼蛋白氨基酸序列的基本理化性質(zhì)由ProtParam 軟件分析；蛋白的保守結(jié)構(gòu)域由Consevered Domains工具預(yù)測；信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、序列的親/疏水性和二級結(jié)構(gòu)分別用 SingalP 4.1、TMHMM Server v. 2.0、Protscale和SOPMA軟件進行預(yù)測與分析；利用NCBI中的Blastp在線工具進行其他物種的同源氨基酸序列搜索；利用Clustal X（version 2.0）和DNAMan （version 8.0）進行氨基酸序列同源比對，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 亞細胞定位分析

將重組入門載體pGWC-MlNAC2與表達載體pEarlyGate104通過LR反應(yīng)構(gòu)建N端YFP融合表達載體。LR反應(yīng)體系為5 μL，其中包括pEarlyGate104 30～50 ng、pGWC-MlNAC2 30～50 ng和1×LR clonase Enzyme Mix?；旌戏磻?yīng)液在25 oC下反應(yīng)4～6 h。轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌 DH5α中，篩選陽性克隆進行測序，將測序正確的重組表達載體命名為 p35S：YFP-MlNAC2。

將重組表達載體p35S：YFP-MlNAC2轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌（GV3101），在含 50 μg/mL壯觀霉素和 50 μg/mL利福平的LB平板上進行轉(zhuǎn)化子篩選，PCR鑒定陽性克隆，并將陽性克隆農(nóng)桿菌振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6左右，室溫下6 000×g離心20 min，收集菌體，用侵染緩沖液（150 μmol/L乙酰丁香酮，10 mmol/L MES，10 mmol/L MS，pH 5.6）重懸菌體至OD600 nm為0.5～0.6。將重懸菌液注射在煙草葉片背面，避光放置2～5 d后，取約1 cm2的葉片材料，在激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV300）下觀察。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄激活試驗

分別用引物MlNAC2-NF和MlNAC2-CR擴增MlNAC2基因的全長；用引物 MlNAC2- NF和MlNAC2-NR擴增 N端片段；用 MlNAC2-CF和MlNAC2-CR擴增C端片段。PCR產(chǎn)物均經(jīng)酶切分別連接入酵母表達載體pGBKT7中，PCR篩選陽性克隆并測序驗證。轉(zhuǎn)錄激活引物序列見表1。

表1 轉(zhuǎn)錄激活引物序列Table 1 Primer sequences of transactivation

根據(jù) Clontech公司的操作手冊，將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)錄激活表達載體pGBKT7-MlNAC2、pGBKT7-MlNAC2ΔC（N端）和 pGBKT7-MlNAC2ΔN（C端）轉(zhuǎn)入酵母AH109中，以pGBKT7載體作為陰性對照。菌株將在 SD/-Trp和 SD/-Trp/-His/30 mM 3-AT培養(yǎng)基上進行雙重篩選。將2次篩選均為陽性的克隆轉(zhuǎn)至顯色培養(yǎng)基上（X-α-gal （20 mg/mL）按1∶1 000加入）倒置避光培養(yǎng)，直至顯色，顯藍色的為陽性克隆。

1.2.5 不同脅迫及激素處理下MlNAC2基因在南荻根部的表達模式分析

在南荻生長到6葉期時進行不同處理：1） 鹽脅迫處理，將植株根部泥沙輕輕洗凈，浸入 150 mmol/L NaCl溶液中；2） 干旱脅迫處理，將植株根部泥沙輕輕洗凈，吸干表面水分，并用吸水紙包裹，放置于培養(yǎng)箱中；3） 低溫脅迫處理，將植株放入4 °C光照培養(yǎng)箱中；4） 激素處理，將脫落酸（ABA，100 μmol/L）、茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol/L） 和水楊酸（SA，1 mol/L）溶液分別均勻噴灑于葉面；5） 機械傷害脅迫處理，用干凈的剪刀剪去每個葉片的頂端約5 cm。所有處理的光照度、光照周期和空氣相對濕度都與正常條件保持一致。以上處理分別在0、1、3、6、12、24 h時間點取相同部位的根部，液氮速凍后于-80 °C冰箱保存。RNA提取及cDNA第一鏈的合成同1.2.1。

實時熒光定量 PCR反應(yīng)系統(tǒng)為 LightCycler○R 480（Roche）。用于MlNAC2基因熒光實時定量分析的引物序列為5′-CCGGCGTCGGCACAACCA-3′和 5′-GCCGGGAACGAGTCCAGCTC-3′。芒草ACTIN11基因用作內(nèi)參基因，其擴增引物序列為5′-CTCGTCTTCCTCACCGTTATCAC-3′和5′-GCG TCATCTCCAGCGAA CC-3′。熒光實時定量 PCR （RT-qPCR）反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR預(yù)混液10 μL，cDNA模板1 μL，正向及反向引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性30 s；95 °C變性5 s，58 °C退火20 s，72 °C延伸10 s，45個循環(huán)。溶解曲線測定溫度為65～95 °C。基線與循環(huán)閾值（Ct值）使用LightCycler?480軟件自動生成。按照相對定量法2-ΔΔCt計算目標基因的相對表達量［10］。本研究中不同脅迫處理下，在同一時間點的表達量與對照相比差別至少在3倍以上時才被認為是受到了該脅迫或植物激素的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 MlNAC2基因的克隆與鑒定結(jié)果

擴增出的 MlNAC2基因片段大小約為 930 bp（圖1）。將PCR產(chǎn)物連接到pGWC-T載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將陽性菌落經(jīng)PCR檢測后篩選出3個陽性克隆進行測序，測得克隆片段的大小均為933 bp。該結(jié)果與湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物生態(tài)應(yīng)用技術(shù)湖南省工程實驗室先前所得數(shù)據(jù) （GenBank登錄號為KM017002）［8］一致。

圖1 MlNAC2基因的PCR檢測結(jié)果Fig.1 Cloning of MlNAC2

2.2 MlNAC2蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

MlNAC2基因全長933 bp，可以編碼310個氨基酸。Protparam預(yù)測該蛋白的相對分子質(zhì)量為34 427.8，理論等電點（pI）為5.85；有45個氨基酸殘基（Asp + Glu）帶負電荷，41個氨基酸殘基（Arg + Lys）帶正電荷；不穩(wěn)定系數(shù)為34.84，屬于穩(wěn)定型蛋白質(zhì)（＜40，蛋白穩(wěn)定），脂肪族系數(shù)為 65.26，總親水系數(shù)為－0.583。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，該蛋白具有保守的NAM基序。該蛋白無信號肽或跨膜結(jié)構(gòu)域。Protscale軟件預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白的親水氨基酸比例大于疏水氨基酸比例，可推測其為親水性蛋白。

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白由88個α螺旋（H）、45個延伸鏈（E）、19個β轉(zhuǎn)角（T）和158個無規(guī)則卷曲（HC）構(gòu)成，占總蛋白的比例分別為28.39%、14.52%、6.13%和50.97%。

將MlNAC2與南荻（MlNAC5），水稻（SNAC1、OsNAC3、OsNAC4、OsNAC5、OsNAC6、ONAC045），擬南芥（ATAF1、ATAF2、ANAC022、ANAC087、ANAC102），小麥（TaNAC2a、TaNAC67、TaNAC6），大豆（GmNAC2）、玉米（ZmNAC1）和高粱（SbNAC1）的 18個 NAC蛋白進行多序列比對的結(jié)果表明，MlNAC2蛋白N端具有完整的NAM特征結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域包含5個子結(jié)構(gòu)域（A-E），C端則是序列呈高度多樣性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2 MlNAC2與其他NAC家族的蛋白多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment between MlNAC2 and other NAC proteins

將 MlNAC2蛋白與這些同源蛋白進行聚類分析構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖3。由圖3可見，MlNAC2 與SbNAC1、ZmNAC1和SNAC1的親緣關(guān)系都較近，已有研究［11］表明這3種同源NAC蛋白都受多種逆境脅迫和激素的誘導(dǎo)，而過表達SNAC1能提高水稻的抗旱性和耐鹽性。

圖3 用鄰接法構(gòu)建MlNAC2蛋白與其他植物NAC蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Constructed phylogenetic tree of MlNAC2 protein and NAC proteins from other plants using neighbor joining method

2.3 MlNAC2的亞細胞定位

為了進一步明確MlNAC2的亞細胞定位，構(gòu)建了MlNAC2的N端融合YFP表達載體p35S：YFPMlNAC2，采用農(nóng)桿菌侵染法使其在煙草細胞中瞬時表達。從圖4可看出，MlNAC2在細胞核中的信號最為明顯，說明MlNAC2是一個核定位蛋白，可能在細胞核內(nèi)行使功能。

圖4 MlNAC2的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of MlNAC2

2.4 MlNAC2的轉(zhuǎn)錄激活試驗結(jié)果

將 PCR篩選鑒定為陽性的重組酵母菌株以及只含有 pGBKT7的對照酵母菌株分別涂在 SD/-Trp、SD/-Trp/-His/30 mM 3-AT和SD/-Trp/-His/X-α-gal平板上，30 °C條件下培養(yǎng)3～6 d，結(jié)果表明，含有MlNAC2蛋白的C端及全長序列的酵母表達菌株能夠在 SD/-Trp和 SD/-Trp/-His/30 mmol/L 3-AT平板上正常生長，并在X-α-gal存在的情況下（SD/-Trp/-His/X-α-gal）顯示藍色，而只含有pGBKT7的對照酵母菌株以及MlNAC2的N端的酵母表達菌株能在SD/-Trp正常生長，但是不能在SD/-Trp/- His/30 mM 3-AT和平板上正常生長，說明MlNAC2蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性，且其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于C端（圖 5）。

圖5 MlNAC2蛋白在酵母體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性分析結(jié)果Fig. 5 Transactivation analysis of MlNAC2 protein in yeast

2.5 MlNAC2基因在南荻根部的表達模式

對長勢一致的南荻進行不同的脅迫和激素處理后，實時定量PCR結(jié)果顯示，在根部，MlNAC2在高鹽、干旱、MeJA和機械傷害誘導(dǎo)下的表達量逐漸升高，并且在處理12 h時達到最大（表 2）。機械傷害處理12 h后，表達量比對照組提高了約30倍，說明MlNAC2受機械傷害強烈誘導(dǎo)表達。由于干旱處理24 h后根部失水過多，無法提取RNA，所以只在0～12 h內(nèi)取樣。低溫處理1 h后，MlNAC2表達量下調(diào)了73%，隨后恢復(fù)，與對照的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。用100 μmol/L ABA處理南荻，MlNAC2在處理后1 h的表達豐度迅速達到峰值，隨后降低。MlNAC2在根部的表達不受SA處理影響。

表 2 各處理MlNAC2基因在根部的相對表達量Table 2 Relative expression intensity of MlNAC2 gene in roots revealed under stress treatments

3 結(jié)論與討論

植物不同器官都能夠響應(yīng)逆境脅迫，根部作為最先感受到土壤條件變化的器官，在脅迫響應(yīng)中起著重要作用［12］。在PEG脅迫下，TaSNAC1在葉片中的響應(yīng)比在根部慢，且受誘導(dǎo)的程度比在根部的弱［13］。在高鹽、MeJA和機械傷害誘導(dǎo)下，葉片和根部中MlNAC2基因表達量的變化較為一致，都在處理后12 h達到峰值［8］。在MeJA處理下，MlNAC2在葉片中的表達峰值約為對照的136倍，在根部僅為葉片中的6.7倍。干旱脅迫0～12 h，MlNAC2在葉片和根部的表達都隨處理時間的延長而逐漸升高。在低溫條件下，MlNAC2在根部和葉片中表達的變化趨勢也較為一致，在處理1 h后下調(diào)至對照水平。用100 μmol/L ABA處理1 h，MlNAC2在根部被迅速誘導(dǎo)，而在葉片中的誘導(dǎo)較慢。在SA處理下，MlNAC2在根部不被誘導(dǎo)，而在葉片中可以被誘導(dǎo)上調(diào)。推測MlNAC2在根部和葉片中參與高鹽、干旱、低溫、MeJA的響應(yīng)機制可能一致，而參與SA和ABA處理的響應(yīng)機制存在差異。

全基因組轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表明，有20%～25%的NAC基因至少響應(yīng)一種脅迫［14-15］。干旱、高鹽和ABA能誘導(dǎo)ANAC019、ANAC055和ANAC072在擬南芥中表達，過表達這3個基因能提高植株對高鹽和干旱的耐受力［16］。Hu等［17］發(fā)現(xiàn)SNAC1基因參與了水稻的非生物脅迫，過表達植株的抗鹽和抗旱性顯著提高，并且沒有出現(xiàn)矮化。在高鹽脅迫下，TaNAC2a表達量先降低后升高；在干旱條件下該基因的表達量逐漸升高；在ABA誘導(dǎo)下逐漸降低。在煙草中過表達 TaNAC2a能顯著提高植株的抗旱性［20］。MlNAC2與SNAC1、TaNAC2a為同源基因，推測該基因可能在提高植物抗旱性方面具有重要作用。

本研究中通過對轉(zhuǎn)錄因子MlNAC2進行生物信息學(xué)分析，鑒定該蛋白定位于細胞核，且具有轉(zhuǎn)錄激活活性，轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于蛋白的C端。根據(jù)不同脅迫和激素處理下該基因在根部的表達模式，可推測該基因可能在南荻的脅迫響應(yīng)中起重要作用。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

中圖分類號：Q943.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-1032（2016）01-0027-06

收稿日期：2015-06-02 修回日期：2016-01-05

基金項目：國家科技支撐計劃項目（2013BAD22B01，2013BAD22B02）

作者簡介：吉璐（1989—），女，湖南藍山人，碩士研究生，主要從事芒屬植物分子生物學(xué)研究，kobejilu@163.com；*通信作者，易自力，博士，教授，主要從事能源植物資源研究，yizili889@163.com

Cloning MlNAC2 gene from Miscanthus lutarioriparius (Poaceae) and its expression profile in roots

Ji Lu1，2， Chen Zhiyong2， Xiao Liang2， Yi Zili2*
（1.Laboratory of Basic Biology， Hunan First Normal University， Changsha 410205， China； 2.College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract：A full length of 933 bp cDNA sequence encoded with 310 amino acid residues of MlNAC2 was cloned from Miscanthus lutarioriparius. The theoretical molecular weight and isoelectric point of this protein were 34 427.8 and 5.85，respectively， and it could be classified to stable proteins with an instability index about 34.84. MlNAC2 was assumed as a hydrophilic protein for its protein sequence contained a conservative NAM motif and no signal peptide or transmembrane structure. The subcellular localization assay confirmed that MlNAC2 was located in the nucleus and therefore might function in this subcellular. Transactivation assay indicated that MlNAC2 was a transcription factor protein and the transactivation region located at its C-terminus. Result from real-time quantitative PCR test suggested that the transcript of MlNAC2 at the roots of Miscanthus lutarioriparius was up-regulated at high salt， drought， ABA， MeJA or mechanical injuries， on the contrary， it was down-regulated at cold， but did not give response to SA.

Keywords：Miscanthus lutarioriparius； NAC transcription factor； gene expression； subcellular localization； transactivation