張　平，賀志昊，龍冬梅，馬惠琴，王蕓華，王　云（.貴州省畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 畢節(jié) 55700；.貴州省納雍縣農(nóng)牧局，貴州 納雍 553300）

一起豬瘟病毒感染病例的實(shí)驗(yàn)室診斷

張平1，賀志昊1，龍冬梅1，馬惠琴1，王蕓華1，王云2
（1.貴州省畢節(jié)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州省納雍縣農(nóng)牧局，貴州 納雍 553300）

摘要：2015年11月畢節(jié)市納雍縣某豬場(chǎng)3頭育肥豬出現(xiàn)體溫升高不下，食欲減退，糞便干燥，全身皮膚出血等癥狀。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)肝、脾、腎多器官?gòu)V泛性出血。采集剖檢豬病變組織，提取RNA，利用熒光定量PCR方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，豬瘟病毒陽(yáng)性，確診為豬瘟病毒感染。

關(guān)鍵字：豬瘟；臨床癥狀；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由豬瘟病毒引起豬的一種急性、熱性、接觸性傳染病。以發(fā)病急、高熱稽留和細(xì)小血管壁變性引起廣泛出血、梗死和壞死等變化為特征。1885年首先在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，以后傳播到世界各大洲[1]。中國(guó)大部分省都有發(fā)生，主要通過(guò)直接接觸，或由于接觸污染的媒介物而發(fā)病。消化道、鼻腔黏膜和破裂的皮膚均為感染途徑。一年四季都可發(fā)生，以春夏多雨季節(jié)為多[2-4]。2015年11月畢節(jié)市納雍縣某豬場(chǎng)飼養(yǎng)的3頭育肥豬，出現(xiàn)，體溫升高不下，食欲減退，糞便干燥，全身皮膚出血等癥狀。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)心肝脾肺腎多器官?gòu)V泛性出血。剖檢采集豬脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)，采用實(shí)驗(yàn)室實(shí)時(shí)熒光RT-PCR診斷技術(shù)，最終確診為豬瘟病毒感染引起。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集發(fā)病豬肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)放在50％甘油生理鹽水溶液中，低溫保存送至市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要試劑世紀(jì)元亨豬瘟病毒提取試劑盒，豬瘟病毒通用型熒光定量PCR試劑盒。

1.2方法

1.2.1樣品的處理分別從豬肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)取約1 g組織，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.2 g于研磨器中研磨，加入1.5 ml生理鹽水，研磨均勻后離心取100 μl上清液于滅菌離心管中。

1.2.2總RNA提取按照豬瘟病毒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光RP-PCR檢測(cè)反應(yīng)采用20 μl體系，反應(yīng)體系為：無(wú)菌無(wú)核酸水2.7 μl，RT-PCR反應(yīng)液10 μl，酶混合液0.4 μl，熒光探針1.9 μl，RNA模板5 μl。反應(yīng)條件為：45℃15 min，95℃1 min；95℃5 s，60℃35 s，在每個(gè)循環(huán)第二步收集FAM熒光信號(hào)，共40循環(huán)（報(bào)告基因“FAM”，淬滅基團(tuán)“NONE”）。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1臨床癥狀

病豬極度消瘦，被毛粗亂，精神沉郁，體溫升高，眼角可見(jiàn)分泌物，大便干燥且惡臭，部分豬只四肢、耳后出現(xiàn)出血斑癥狀。

2.2剖檢癥狀

對(duì)病死豬只剖檢可見(jiàn)全身性出血，脾臟明顯梗死，肝臟、肺臟表面有壞死灶，腎臟水腫，皮膚出現(xiàn)紫斑，膀胱黏膜中有小點(diǎn)出血，腸壞死，腸系膜淋巴結(jié)腫脹。

2.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)3份組織總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，3份樣品均為陽(yáng)性（見(jiàn)圖2）。

由圖2可知病死豬3份組織樣品RNA均呈現(xiàn)出特異性擴(kuò)增曲線。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，CT值在25.3172～29.2240范圍。根據(jù)說(shuō)明書(shū)結(jié)果判定CT＜30且呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判定三份樣品均為CSF陽(yáng)性。

圖1病死豬剖檢病變

圖2 CSF實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果A1：陽(yáng)性對(duì)照；C1：陰性對(duì)照；B1/D1/H1：待檢樣品

3　討論

豬瘟一直是感染率、發(fā)病率、死亡率都很高的傳染病，一旦發(fā)生會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)很大損失，因此豬瘟的預(yù)防及診斷問(wèn)題一直備受世界各國(guó)關(guān)注[5,9]。近年來(lái)豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)已轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑堑湫拓i瘟為主的流行形勢(shì)，在臨床以及剖檢上出現(xiàn)不同于典型豬瘟的特征性病變，給豬瘟臨床診斷帶來(lái)極大困難，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室確診成為一種準(zhǔn)確、方便的診斷方法[6,7]。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。具有操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好等特點(diǎn)，已然成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)動(dòng)物疫病的主要手段[8,10,11,12]。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，豬瘟病毒檢測(cè)技術(shù)將更靈敏、更特異、更快速、通量更大，檢測(cè)豬瘟病毒手段將更豐富、更高效，從而有利于開(kāi)展豬瘟的檢測(cè)工作。

本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)3頭臨床豬瘟癥狀不典型的育肥豬進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的檢測(cè)，確診了該次疫病由豬瘟病毒引起。為今后實(shí)驗(yàn)室確診豬瘟病毒引起非典型豬瘟提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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（編輯：高真貞）

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1006-799X(2016)04-0092-02

作者簡(jiǎn)介：張平（1988-），女，安徽阜陽(yáng)人，主要從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。